实验指导 - 图文

水产动物生理学实验指导

目 录

第一部分 水产动物生理学实验概述

一、水产动物生理学实验的目的、任务与要求 二、水产动物生理学实验报告的写作

第二部分 基本生理实验操作

第一节 组织、器官的机能实验

实验1 生理学常用仪器使用方法介绍 实验2 坐骨神经—腓肠肌标本的制备 实验3 刺激强度对骨骼肌收缩的影响 实验4 刺激频率对骨骼肌收缩的影响 实验5 蛙心起博点

实验6 期前收缩与代偿间歇 实验7 蛙心灌流

实验8 鱼类心脏灌流

实验9 离体小肠平滑肌的生理特性

实验10 反射中枢活动的某些基本特征及反射弧分析

第二节 血液组成成分及其性质的分析、血清中部分物质含量的测定

实验11 红细胞与白细胞计数

实验12 血红蛋白含量测定

实验13 血涂片制作与白细胞分类计数 实验14 红细胞沉降率的测定 实验15 红细胞比容的测定

实验16 红细胞渗透脆性的测定—浓度梯度法 实验17 蛋白质含量的测定I—双缩脲法

实验18 血清γ—球蛋白的分析测定—盐析法 实验19 血清白蛋白和球蛋白的分析测定—盐析法 实验20 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白 实验21 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白 实验22 糖含量的测定II—邻甲苯胺法 实验23 总脂的测定—香草醛法 实验24 胆固醇的测定—邻苯二甲醛法 实验25 血清尿素氮的测定

第三节 酶活力的分析测定

实验26 过氧化氢酶活力的测定 实验27 酸性磷酸酶活力的测定 实验28 硷性磷酸酶活力的测定

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实验29 谷丙转氨酶（GPT）活力的测定 实验30 蛋白酶活力的测定 实验31 淀粉酶活力的测定 实验32 脂肪酶活力的测定

第四节 营养、消化、吸收与代谢机能实验

实验33 耗氧率的测定 实验34 氨氮排泄率的测定

第三部分 研究设计型实验

第一节 疾病对水产动物机能影响的研究实验

参考选题

1、中国对虾（或南美白对虾）红腿病的发病机制的分析研究 2、中国对虾黑鳃病几项生理、生化、免疫指标变化的分析研究 3、鲤肠炎病几项生理、生化、免疫指标变化的分析研究 4、草鱼出血病几项生理，生化，免疫指标变化的分析研究

5、寡糖类免疫增效剂对提高中国对虾抗病力的影响及其作用机制 6、微生态制剂对提高鲤抗病能力的影响及其作用机制 7、抗生素对鲤免疫机能影响及其作用机制

第二节 环境因子对水产动物机能影响的研究实验

参考选题

1、温度对鲤（或牙鲆）生长、消化、代谢、消化酶活力及免疫力的影响

2、低温条件下鲤、鲫、鲢、鳙抗寒力的比较研究 3、氨氮、硝态氮、亚硝态氮对鲤抗病力影响的研究 4、农药对南美白对虾几项生理、生化、免疫指标的影响 5、水质净化剂对提高中国对虾免疫力的影响及其作用机制

第三节 营养和非营养因素对水产动物生长和物质利用影响的研究实验

参考选题

1、饥饿对美国红鱼的消化、代谢机能的影响 2、不同脂肪源对牙鲆生长和代谢的影响 3、美国红鱼的营养需求量的研究

4、微生态制剂饲料添加剂对促进鲤生长的影响及其作用机制 附录

常用试剂配制

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第一部分 水产动物生理学实验概述

一、水产动物生理学实验的目的、任务与要求

（一）生理实验课的目的和任务

水产动物生理学实验是水产动物生理学的配套课程，也是水产养殖专业的专业基础课，更是主要实践环节之一。本课程的主要先修课是组织胚胎学、普通动物学、生物化学实验，后续课为水产动物病理学、水产动物营养学等课实验等。

该课程不仅能强化理论课的教学，还具有独自的教育作用。培养学生实际操作能力和实验报告写作能力，培养学生提出问题、分析问题、解决问题的科学思维方法，养成实事求是、严谨求证的工作态度和规范操作、分工协作的工作作风，以及爱科学、爱公物的素养。

通过本课程学习，学生应获得以下知识和能力：

1.掌握基本生理指标测量方法；

2.掌握生理实验技能和生理手术基本操作技能；

3.了解电生理基本操作技能；

4.能独立分析实验结果、写出规范的实验报告；

5.知道生理实验设计的一般原则和方法，并作初步尝试。

6.进一步培养学生进行研究设计型实验。

水产动物生理学是一门实验学科，实验在课程学习和知能掌握中具有重要作用。水产动物生理学实验独立设课能强化学生的重视程度，有助于培养目标的落实。教程所列实验项目为学生操作或教师示范的选择内容，对不同专业可采用不同的实验对象甚至教学内容。实际行课时，课程结构中的实验概述、基本操作、综合实验和录像示教内容宜混合编排，有机组合，一次实验可安排一个或多个项目，甚至跨章的综合性内容。实验设计在课程进程中间布置、课程末尾答辩。实验课成绩评定强调全面性与全程性，包括每次实验操作和报告撰写、自行设计实验和期末考核。期末考核由口试、准备器具和操作组成。综合评定成绩不及格者必须重修本课。

（二）生理学实验方法

水产动物生理学的知识来自对生命现象的客观观察和科学实验。所谓生理学实验，就是人为地创造一定条件，以利于对平时不能从外表观察到的隐蔽或细微的生理活动能被观察，或某种生理过程能被认识。器官组织水平的生理实验方法主要分为急性和慢性两大类。急性实验法又可分为离体组织器官法和活体解剖法。如离体蛙心灌流即是离体组织器官法，如胃肠运动的直接观察即是活体解剖法。急性生理实验持续时间短暂，条件简单、容易排除其他因素干扰，并有可能对研究的对象进行直接的观察和细致的分析。动物实验后一般不能存活，也无须无菌条件。但所获得的结果可能与正常生理机能相差较大，不能轻易推断。慢性生理实验通常先实施慢性生理手术，在无菌条件下安置体内电极、安装瘘管或切除移植腺体等，待动物术后恢复时，再在机体清醒完整的情况下进行记录、取样等实验项目。这类实验过程较长，实验室条件也要求较高，实验动物模型也可使用较长时间，其机能活动更接近正常。自然，每种方法都有它的长处，也都存在—定的局限性，要了解并选择适当的方法，以与一定的研究目的和实验对象相适应。

（三）生理学实验课的要求

一堂完整的实验课包括实验前、实验和实验后三个环节。实验前应有目的地做好充分准备，仔细阅读和研究实验指导，了解实验原理和基本操作方法，复习有关的生理学知识，

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预期实验中可能出现的结果和问题。这是避免被动盲目操作、提高实验课质量的重要前提。 实验时必须遵守实验室规则，入室前穿好实验服，室内保持安静，不随意走动，不做与实验无关的事。节约实验用品，实验动物只能由教师统一发给。实验器材每次专人负责，领取清点，归还复核，损坏登记，丢失赔偿。已调试好的仪器不要任意调动，实验器具不得与其他组调换，如需要可向准备教师要求添加或更换。实验时要注意动脑思考，实验中自行更改或设计项目应征求同伴和教师意见。组内分工合作，认真有条理地操作，耐心细致地观察，及时准确地记录，原始记录交教师签字认可后方能结束实验。实验完成较早，通过教师允许可以利用动物预习下次操作、补做上次内容或自行练习等，此时仍要注意规范操作和动物福利。

实验结束后，各组清理好自己的场地、物品，归还实验用品，动物尸体放指定位置。值日同学清理好公共用品和场地，报教师同意后方可离开。每人转录、整理原始记录，及对写好实验报告上交。

特别强调要珍惜实验条件和机会，保证实验课质量；绝对不许用动物和手术器械开玩笑。有兴趣的同学可以申请参加实验准备和预备实验。

二、水产动物生理学实验报告的写作

写实验报告是对所做实验的再理解再创造的工作，是检查学生知识掌握和衡量能力的重要尺度之一，是今后撰写科学论文的初始演练。

(一)一般要求

使用学校统一印制的报告纸。填全各栏目，并标明学号或组号，―日期‖一栏填做实验日期，写报告日期可标于文末。―指导教师‖一栏不写，系留阅报告人签名用。报告要求格式标准、卷面整洁、图表准确、字迹端正、简明精练，按时上交。注意文字规范，语句通顺，不用自造的不规范的简化字、代号。

(二)基本格式与写法

生理实验有的侧重于操作方法(如神经-肌肉标本制备)，有的侧重于现象观察(胃肠运动的直接观察)，有的侧重于结果及分析(影响尿生成的因素)，多数则兼而有之。应根据实验类型，选用合适的报告格式及详略安排各栏目。

实验报告大体上有两种格式：一种是一般实验报告式，另一种是仿学术论文式，其对应关系如下表。一般认为操作类宜选用前者，而侧重结果的实验后者更适用。

表 实验报告的基本格式

一般实验报告式 题目(内容)

目的原理

实验对象与用品 方法步骤 结果与分析 讨论

(结论或结语) 注意事项原始记录 实验分工体会与建议

(三)注意事项

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仿学术论文式 题目

引言(导言) 材料与方法

结果与分析 讨论与结论(语)

附录(含原始记录，公式 推导，参考文献，致谢等）

写报告应以事实为根据，尽量用自己的话表述，忌抄书，不许修改、编造数据。实验方法与步骤可视重要否而详略，但报告应独立成章，不可用―见书第33页‖字样而省略。有的实验报告中，结果、分析甚至实验项目可以列表表达。―讨论‖是一篇报告的核心，应紧扣结果联系相关理论进行，忌就事论事或离题万里；结果也不可轻易推断或引申。“结果与分析”一栏可在实验小组内讨论，必要时也可以参考其他组数据(需注明)，但报告必须按要求独立完成，禁止互相抄袭。

第二部分 基本生理实验操作

第一节 组织、器官的机能实验

实验1 生理常用仪器设备的使用方法介绍（必修）

D－951微机化生理实验教学系统是一种智能化的四导生物信号采集分析系统，适用于80X86系列微机。具备示波器加记录仪加放大器加刺激器等传统生理仪器的全部功能。另外，还具有自动分析、参数预置、操作提示、动画释疑、中文显示、下拉菜单、鼠标驱动和在线帮助等微机特有的功能。有些实验还设计了模拟实验的内容。本系统的功能特点包括：图形化界面；Windows风格；键盘与鼠标操作兼容；模仿仪器面板式操作界面；项目化参数预置；实时记录与实验模拟并行；实时无间隙存盘（＞24h）；自动基线；项目标记；波形编辑等。硬件方面采用程控放大器（程控平衡调节）和程序刺激器，废除了传统的开关和旋钮。参数的调整，通道的切换全部由软件控制。

(1)系统结构:微机化生理实验教学系统由微机、采样及程控专用接口、程控电生物放大器、换能器接口、程控刺激器、专用软件和打印机等组成。通过记录电极或换能器引导出的生物信号，经放大后通过A/D转换送入微机处理。同时微机还可通过专用接口控制放大器的参数和状态整个系统硬件集成为两块硬卡，一块程控放大卡，一块A/D卡。

（2）基本功能：可同步记录4路生物信号。电信号2路：神经干动作电位、传导速度

测定、神经放电诱发电位、心电、脑电、肌电等。换能器信号2路：压力(血压、胸膜腔内压、中心静脉压）、张力（肌肉、肠管、蛙心、呼吸等）。

程控刺激输出：频率、波宽、幅度分别可调，可正负双向输出。

(3)操作举例：

1)血压调节：血压换能器连接到3通道，心电信号连接到1通道（可选）。选择：‘血压调节，，项目。采样周期建议为32ms，压缩比建议为1：4。连接好相应装置，用鼠标点击空格键开始记录。曲线显示的位置及幅度可通过相应的推钮进行调节。若基线位置不合适，可用鼠标点击“自动基线”按钮，使曲线回到合适的位置。所实施的实验项目可通过标功能直接标记在记录曲线上。进行刺激时，可通过面板上的按钮打开刺激器，用推钮调节刺激频率和幅度。实验结束后通过

钮左右移动图形，流浏览实验结果压（缩比可改加1：

8），并通过剪贴功能能重新编辑图形。编辑好的图形可存盘作永久保存，也可通过打印机打

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印出来（图Ⅱ-1）。

图Ⅱ-1动脉血压的变化

1．正常；2．夹闭颈总动脉；3．刺激降压神经；4．刺激迷走神经；5．肾上腺素

2）神经干动作电位：记录电极连接到：通道和2通道，刺激电极连接刺激输出。选择“神经干AP记”项目。程控放大器参数（按“F”键）设定为增益：200；滤波：10K；时间常数：0．05s。按t键（触发采样），程序进入扫描等待状态。按“TNTER”键，程序发出刺激信号，同时进行一次扫描。也可用鼠标选择单次或连续刺激。精细调节刺激幅度可观察动作电位幅度与刺激间的关系，从而找表！阈刺激。逐步调节双刺激间隔，以观察不应期。改变刺激极性（刺激反向）可观察到（刺激伪迹倒向，而动作电位不倒向。按空格键退出触发扫描。通过相应的按键完成存盘、波形测量、打印等操作（图Ⅱ-2）。

2．BL-410电脑化实验系统

（1）概述：BL-410生物机能实验系统是配置在计算机上的4通道生物信号采集、放大、显示、记录与处理系统。它由以下三个主要部分构成： 1） IBM兼容微机。

2） Biolap410智能型生物信号采集、放大硬卡。 3） Biolap98生物信号显示与处理软件。

Biolap410智能型生物信号采集、放大卡是一台程序可控的，代4通道生物采集与放大功能，并集成高精度、高可靠性以及宽适应范围的程控刺激器与一体的硬卡。Biolap98生物信号显示与处理软件利用微机强大的图形显示与数据处理功能，可同时显示4道从生物体内或离体器官中探测到的生物电信号或张力、压力等非生物电信号的波形，并可对实验数据进行存贮、分析及打印，它完全替代了原有的利用分离的放大器、示波器、记录仪、刺激器等所构成的繁琐而性能低下的生物信号观测系统，功能更强大与灵活。

（2）系统功能特点：

1）采用12位A/D转换器，最高采样速度可达60kHz。 2）4通道增益（2-50000倍）、低噪音，程控的生物放大器。各通道扫描速度分别可调。 3）程控电刺激器：电压输出（0±35V步长500mV和50mV两挡）和电流输出（0±10mA步长100μA和10μA）两种模式。

4）程控全导联心电选择。

5）以中文win98为软件平台，全中文图形化操作界面。

6）以生理实验为基础，预设置了八个系统约32个实验模块。

7）数据分析功能：可实时地对原始生物信号以及储存在磁盘上的反演信号进行积分、微分、频谱、频率直方等运算、分析；并同步显示该处理后的图形。

8）测量功能：对信号进行实时测量（单点测量、两点测量以及区间测量），也可测量出多项指标，如：最大、最小以及平均值，信号的频率、面积、变化率以及持续时间等。 9）可独立调节4个通道波形的扫描速度 10）有数据反演功能：在反演数据过程中，可用鼠标拖动数据查找滚动条进行快速查找；并可对反演信号进行数据、图形剪切。

11）有打印单、多通道的实验数据功能；在打印时，还可进行图形比例压缩，确定打印位置。

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实验2 坐骨神经—腓肠肌标本制备（必修）

[目的与原理]

掌握机能学实验的基本组织分离技术；掌握蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本制备的基本操作方法。

蟾蜍等两栖类动物的某些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，其离体组织的实验条件较简单且易于控制，在机能实验中常用蛙或蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本观察神经、肌肉兴奋性、刺激与反应的关系及肌肉收缩等某些基本特性或活动规律。 [实验对象] 蟾蜍或蛙。

[试剂与器材]

任氏液、蛙板、玻璃板、粗剪刀、手术剪、镊子、金属探针、玻璃钩针、蛙钉、滴管、培养皿、锌铜弓、烧杯。 [实验步骤]

1、破坏脑脊髓：

（1）取蟾蜍一只，用自来水冲洗干净。左手握住蟾蜍，用食指按其头部使之略向前屈，拇指按住其背部，其余三指则握住蟾蜍的四肢和腹部，其手法如图1-7-1A。 （2）用右手持金属探针，在头颅后缘，自枕骨大孔与脊椎管之间刺入椎管，先左右摆动，离断脊髓；再向前插入颅腔，向左右摆动数次，捣毁全部脑组织，如探针确已插入颅腔，则向各方向摆动时，即有触及颅骨的感觉。

（3）将探针撤回至枕骨大孔，但不拔出皮肤，直接向后插入脊椎管，直达骶部，轻轻转动探针，以破坏脊髓。如探针确已在脊椎管中，则不能左右摆动，探针不得穿透脊椎管，以免损伤内脏。最后拔出探针，用小棉球堵塞创口以止血。

脑脊髓破坏完全后，蟾蜍将失去一切反射活动，全身肌肉软瘫。如动物仍有反射动作，表示破坏不彻底，必须重新破坏。

2、去皮和制作下肢标本：

图1-7-1破坏蟾蜍脑脊髓及剥去皮肤

（1）左手握住蟾蜍的脊柱，用粗剪刀在前肢腋窝处，将脊柱横断，并沿脊柱两侧避开坐骨神经剪开腹壁，此时头、躯干上部及内脏全部下垂，剪除头、全部躯干及内脏组织，剪

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去肛周皮肤，留下脊柱和后肢（图1-7-1B、C）。

（2）用圆头镊子夹住脊柱边缘，注意不要碰到坐骨神经，捏住皮肤边缘，逐步向下牵拉剥离皮肤。（图1-7-1D）将全部皮肤剥除后，标本放于盛有任氏液的小烧杯中。随即洗净蛙板、剪刀和双手上的污物及毒汁。

（3）用粗剪刀沿脊柱和骨盆的中线，将标本纵剖为两半，注意勿损伤坐骨神经。一半置于蛙板上，以制备标本；另一半置于盛有任氏液的玻璃平皿中备用。

3、制备神经－腓肠肌标本：

（1）把下肢的背面朝上，参照图1-7-2A所示，辨认蟾蜍大腿的三头肌、二头肌和半膜肌，以及小腿的腓肠肌。

（2）用玻璃钩针和镊子仔细把二头肌和半膜肌分开，便可看到一条粗大的神经，此即坐骨神经。用玻璃钩针把神经挑起，剪去通往大腿肌肉的神经分支，顺着神经走行方向，转向腹腔面沿脊柱逐渐把神经主干全部分出，直到所连的椎骨为止。用粗剪刀剪除多余的肌肉和脊椎骨，仅留下与坐骨神经相连的一小块脊椎骨，用镊子夹住这块脊椎骨，轻轻提起坐骨神经，用手术剪剪去残余的分支，并将坐骨神经一直分离到膝关节附近。

（3）分离腓肠肌的跟腱，用线结扎跟腱，在结扎处以下将跟腱剪断。持线提起腓肠肌，用粗剪刀剪去小腿骨和其上的肌肉，再将大腿肌肉剪去，只留长约1～2cm的股骨，并将其上肌肉刮干净，以便在肌动器上固定此标本（如图1-7-2B）。

4、检验标本：用锌铜弓的两端轻轻接触神经，若肌肉产生收缩，则表示此标本的机能状态良好。

[方法评估]

此为机能学基础理论验证性实验操作技术中的最简单的手术之一。只要仔细操作均能成功 [应用意义]

为检验骨骼肌生理特性的基础手术。在完成此手术的基础上再进行其它神经肌肉特性的实验。

[注意事项]

1、避免蟾蜍毒液及其它污物等污染坐骨神经标本。

2、不得用镊子等金属器械接触神经或用力拉扯神经。

3、剪除神经分支时不得损伤其主 干。

图1-7-2 蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本制备法 1.骨二头肌;2.半膜肌；3.坐骨神经；4.腓肠肌

4、移动制备好的标本时，应用镊子分别夹持脊椎骨片和股骨断端。

5、制作过程中应经常用任氏液湿润标本，以防干燥，标本必须放在任式液中浸泡数分钟后再开始实验。 [思考题]

为什么在标本的制作过程中不能用清水冲洗标本只能用任氏液湿润或浸泡标本？

实验3 刺激强度对骨骼肌收缩的影响（必修）

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[目的与原理]

掌握刺激、记录肌肉收缩的方法和测量组织兴奋性的方法；观察刺激强度与肌肉收缩反应的关系；理解阈刺激、阈上刺激、阈下刺激、最大刺激等基本概念。

神经、肌肉组织具有兴奋性，能接受刺激而发生反应。但刺激要引起组织兴奋，其强度和作用时间必须达到一定的阈值（称强度阈值及时间阈值）。兴奋性不同的组织其阈值大小亦不相同，兴奋性高的阈值小，因此，阈值常作为衡量组织兴奋性高低的客观指标。 不同种类的组织兴奋性高低不同，同一组织的不同单位其兴奋性也不同，例如腓肠肌是由许多肌纤维组成的，个个肌纤维的兴奋性高低并不相同。当用刺激时间一定的单个刺激直接（或通过神经间接）刺激腓肠肌时，如刺激强度太弱，不能引起肌肉收缩（强度未达到阈值的刺激为阈下刺激）；只有当刺激增强到一定强度时，才能引起肌肉发生最微弱的收缩，这种刚能引起最小反应的最小刺激强度称阈强度（或强度阈值），强度达到阈值的刺激即称阈刺激，此时只是少数兴奋性较高的肌纤维产生了收缩。以后随着刺激强度的增加，越来越多的肌纤维被兴奋，肌肉的收缩也相应地逐步增大（强度超过阈值的刺激称为阈上刺激）；当刺激强度增大到某一个强度时，整块骨胳肌中所有的肌纤维均产生了兴奋，肌肉出现最大的收缩反应，此时如再继续增大刺激强度，肌肉的收缩却不再增大。这种能使肌肉发生最大收缩反应的最低刺激强度称为顶强度（或最适强度）。具有顶强度的刺激称为最大刺激，最大刺激引起的肌肉收缩称最大收缩。可见，在一定范围内，骨胳肌收缩的大小取决于刺激的强度，这是刺激与组织反应之间的一个普遍规律。 [实验对象] 蟾蜍或蛙。 [试剂与器材]

任氏液、计算机、生物信息采集处理系统（或二道生理记录仪、电子刺激器）、张力换能器、肌动器、铁支台、双凹夹、蛙类手术器械等。 [实验步骤]

1、按实验72的方法制备坐骨神经-腓肠肌标本，在任氏液中浸泡10～20min （本实验也可只用腓肠肌标本，但为练习标本制作，仍然制成坐骨神经-腓肠肌标本）。

2、熟悉计算机实验教学系统的结构、功能及其基本操作方法。

3、将坐骨神经-腓肠肌标本固定在肌动器上，并将神经搭在其刺激电极上，把刺激的输出线与肌动器刺激电极的接线柱连接，或在接线柱上再接上两根细漆包线（其两端漆皮要去掉），直接插入腓肠肌的两端作刺激电极用。 4、将张力换能器用双凹夹固定于铁支台上，其换能器的输出线插入计算机的信号输入插口。

5、将腓肠肌跟腱结扎线的一端与换能器的簧片相连，不能拉得太紧。

6、打开计算机等待自动进入智能型生物信息采集处理系统主页界面，在空白处双击后进入主界面，于顶级菜单“实验项目”处单击，打开子菜单后点击“肌肉神经实验，再选择“刺激强度与反应的关系”项单击，出现对话框填入合适的数据后点“OK”进入实验的监视。实验方式可选程控。

7、观察生物信号的显示：窗口可见弱刺激开始时肌肉无收缩反应，随着刺激强度的加大刚能记录出收缩反应时为阈强度，以后收缩高度逐渐加高直到连续三、四个收缩的高度不再随着刺激强度的加大而加高为止，收缩高度不发生改变的最小刺激强度为顶强度（最适强度），此刺激就是最大刺激。可根据结果调节填入对话框的数据（主要是起始刺激强度、刺激强度增量的设置），以描绘出满意的图形，见图1-7-3。

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图1-7-3 刺激强度对骨骼肌收缩的影响

[方法评估]

此方法比较简单为检测骨骼肌兴奋收缩特性与刺激强度的关系的常用方法。 [应用意义]

此为骨骼肌生理特性的验证性实验之一，主要应用于观察刺激强度对骨骼肌收缩的影响以及测量骨骼肌兴奋性的高低。

[注意事项]

1、每次连续刺激时间不宜太长，且每两次刺激之间应让标本休息0.5-1min，以防肌肉疲劳影响实验结果。

2、随时用任氏液湿润标本，以保持其良好的兴奋性。

3、标本固定的松紧要适度，并防止肌肉产生持续的强直收缩，才能保证做出良好的肌肉收缩曲线图。 [思考题]

1、引起组织兴奋的刺激必须具备哪些条件？

2、什么是阈刺激、阈上刺激、阈下刺激及最大刺激？

3、为什么在一定范围内腓肠肌收缩曲线的幅度会随着刺激强度（在一定范围内）的增加而不断增大？

实验4 刺激频率对骨胳肌收缩的影响（必修）

[目的与原理]

观察肌肉收缩的形式及刺激频率与肌肉收缩之间的关系，了解与掌握单收缩、复合收缩、强直收缩的特征及其形成的基本原理。

当给肌肉一个阈上刺激时，肌肉即发生一次收缩反应，这是肌肉收缩的最简单形式，称为单收缩，其总时程为0.11s，包括潜伏期、收缩期共0.05s，舒张期0.06s。如相继给予肌肉两个以上强度相同的阈上刺激时，若刺激之间的间隔时间超过一次单收缩的持续时间，则肌肉将出现一连串各个分开的单收缩；若间隔时间比一次单收缩的持续时间短，则前一个收缩波还未结束就开始后一个收缩，这样两次收缩就会重叠起来，这种现象称为复合收缩。如果后一个收缩是在前一个收缩的舒张期内发生的，各次收缩复合的结果，会出现持续的锯齿状的收缩曲线，称为不完全强直收缩。若刺激的间隔时间比单收缩的收缩期短，后一收缩就在前一收缩的收缩期内发生，结果会出现一持续的平滑收缩曲线，称为完全强直收缩，刺激强度一定时，强直收缩的高度要比单收缩高，而且在一定范围内，收缩高度随刺激频率的增加而增高。（图1-7-4）

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[实验对象]

蟾蜍或蛙。 [试剂与器材]

任氏液、计算机、生物信息采集处理系统（或二道生理记录仪，电子刺激器）、张力换能器、肌动器、铁架台，双凹夹、蛙类手术器械等。

[实验步骤]

1、按实验72的方法制备坐骨神给腓肠肌标本，在任氏液中浸泡10～20min（本实验也可只用腓肠肌标本，但为练习标本制作，仍然制成坐骨神经-腓肠肌标本）。

2、将坐骨神经-腓肠肌标本固定在肌动器上，并将神经搭在肌动器刺激电极上，把刺激的输出线与肌动器刺激电极的接线柱连接，或在接线柱上再接两根细漆包线（其两端漆皮要去掉），直接插入腓肠肌的两端作刺激电极用。

3、将张力换能器用双凹夹固定于铁支台上，其换能器的输出线插入计算机的信号输入插口。

4、将腓肠肌跟腱结扎线的一端与换能器的簧片相连。注意：不能拉得太紧。 5、打开计算机等待自动进入智能型生物信息采集处理系统主页界面，在空白处双击后进入主页界面，于顶级菜单“实验项目”处单击，打开子菜单后点击“肌肉神经实验”，再选择“刺激频率与反应的关系”项单击，出现对话框后选择现代或经典实验进入实验的监视。 6、调节对话框的数据，如刺激强度（一般为5—7.5V）、刺激频率增量（一般为1、6、10、15、20、30Hz）的设置，直至做出满意的肌肉收缩曲线图形，即记录出几个单收缩曲线和一段不完全强直收缩及完全强直收缩曲线，见图1-7-4。

图1-7-4 骨骼肌的单收缩和强直收缩 上：收缩曲线 下：刺激标记

1.单收缩 2.不完全强直收缩 3.完全强直收缩

[方法评估]

为检验骨骼肌兴奋收缩特性与刺激频率关系的常用方法，操作简单易于掌握。

[应用意义]

为骨骼肌生理特性验证性实验之一，主要应用于观察刺激频率对骨骼肌收缩的影响。 [注意事项]

1、连续刺激时间不宜太长，每次刺激持续时间要保持一致，不得超过3—4s，且每两次刺激之间应让标本休息0.5-1min，以防肌肉疲劳影响实验结果。 2、经常用任氏液湿润标本，以保持其良好的兴奋性。

3、标本固定的松紧要适度，才能保证做出良好的肌肉收缩曲线图。

[思考题]

1、何谓单收缩？单收缩的潜伏期包括哪些时间因素？有神经和无神经的标本有何差异？

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2、为什么刺激频率增高，骨骼肌收缩幅度也增高？

3、何谓不完全强直收缩、完全强直收缩？它们是如何形成的？

4、如果能用单根的腓肠肌纤维重复以上实验，预期的实验结果将会怎样？为什么？

实验5 蛙心起搏点（必修）

[目的与原理]

利用改变局部温度和结扎方法来观察蛙心起搏点和蛙心脏不同部位的自律性高低。

动物心脏的特殊传导系统具有自动节律性，但心脏各部分自律性高低不同，哺乳动物以窦房结的自律性最高。正常心脏搏动每次都是自窦房结传出，传到心房，心室引起收缩，所以窦房结被称为哺乳动物的心搏起点。两栖类动物心搏起点是静脉窦，鱼类的心脏则具有2～3个这样的自动节律性中枢。 [实验对象] 蟾蜍或蛙

[试剂与器材]

蛙类手术器械、蛙心夹、滴管、线、任氏液、小试管、35～40℃热水。

[实验步骤]

1、取蟾蜍一只，用探针破坏脑和脊髓后将蟾蜍仰卧固定在蛙板上，用剪刀剪开胸骨表面皮肤并沿中线剪开胸骨，可见心脏在心包内，仔细剪开心包暴露心脏。

2、参照图l-7-7、图1-7-8识别静脉窦，心房和心室。观察它们的跳动程序并计算它们在单位时间内的跳动次数。

3、用盛有35～40℃热水的小试管分别靠近心室与心房，静脉窦，改变其局部温度观察它们的跳动次数有何改变。

4、用镊子在主动脉：下穿一线备用，用玻璃针穿过主动脉干下面，将心尖翻向头端，暴露心脏背面，在静脉窦和心房交界的半月形(窦房沟)处将线作一结扎以阻断静脉窦与心房之间的传导，观察心房的跳动是否停止?静脉窦是否仍在跳动?

5、待心房、心室恢复跳动后，分别计数单位时间内静脉窦和心房、心室跳动频率，两者是否一致?

6、记录上述实验观察结果，并根据其结果作出分析和讨论。

图1-7-7 蟾蜍心脏腹面观

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图1-7-8 蟾蜍心脏背面观

[方法评估]

验证心肌自律性的基本方法，操作简单易于掌握。

[应用意义]

为心肌生理特性验证性实验，应用于检测心脏起搏点及其心脏各部位自律性高低。 [注意事项]

在沿窦房沟用丝线结扎时，结扎线应尽量靠近心房端，以免伤及静脉窦。同时可确保心房侧无静脉窦组织残留；结扎要紧以完全阻断静脉窦与心房间的传导。结扎后，应注意观察心脏各部分节律性活动先是出现什么变化?而后又将如何?

[思考题]

1、在正常情况下，静脉窦、心房和心室三者的节律性舒缩活动有何不同?为什么? 2、分别用盛有40℃左右热水的小试管接触心室、心房和静脉窦，将引起什么变化?为什么?

3、在静脉窦与心房交界部的窦房沟处作一结扎，观察心脏各部分的节律性活动立即有何变化?为什么?

4、稍待片刻，再观察心脏各部分的节律性活动又将如何?为什么？

实验6 期前收缩与代偿间歇（必修）

[目的与原理]

掌握心脏活动的描记方法，观察在心脏活动的不同时期给予刺激时心肌兴奋性的阶段性变化，了解心脏活动的特点及期前收缩、代偿间歇产生的的基本原理。

心肌每兴奋一次，其兴奋性就发生一次周期性变化。心肌兴奋性的特点在于其有效不应期特别长，几乎相当于整个收缩期和舒张早期。因此，在心脏的收缩期和舒张早期内，任何刺激均不能引起心肌兴奋而收缩，但在舒张早期以后，给予一次较强的阈上刺激就可以在正常节律性兴奋到达之前，产生一次提前出现的兴奋和收缩，称之为期前收缩或额外收缩。同时，期前收缩亦有不应期，因此，如果下一次正常的窦性节律性兴奋到达时正好落在期前收缩的有效不应期内，便不能引起心肌兴奋而收缩，这样在期前收缩之后就会出现一个较长的舒张期，这就是代偿问歇。 [实验对象]

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蟾蜍或蛙。

[试剂与器材]

任氏液、计算机、生物信息采集处理系统（二道仪、刺激器）、蛙类手术器械、蛙心夹、刺激电极、机械换能器、铁架台、双凹夹、小试管、滴管、丝线。 [实验步骤]

1、取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，将其仰卧位固定于蛙板上。由剑突水平向两肩关节方向剪开皮肤，然后沿胸骨打开胸腔，剪开心包，充分暴露心脏。

2、将连有线的蛙心夹在心室舒张期夹住心尖后，再将连线缚于机械换能器的簧片上，调整机械换能器，使连线松紧适度。

3、将与计算机连接的刺激电极的两端分别与蛙心夹和蟾蜍的身体相连。

4、打开计算机，进入Bio1ap98菜单条→实验项目（单击）→循环系统→期前收缩与代偿间歇（单击）。调节刺激频率到单刺激，刺激强度到中等强度。

5、当用鼠标给予额外刺激时，观察刺激落到心室收缩期和舒张早期能否引起期前收缩？当刺激落在心室舒张早期之后能否引起期前收缩？如能引起期前收缩，观察其后是否出现代偿间歇？

图1-7-9 期前收缩与代偿间歇

6、记录一段正常心肌收缩曲线和期前收缩、代偿间歇的曲线图形。（图1-7-9） [方法评估]

检验心肌生理特性的基本方法之一，为常用方法，手术及其操作均简单易于掌握。 [应用意义]

为心肌生理特性验证性实验，主要应用于检测心肌接受一次刺激后兴奋性的变化及期前收缩代偿间歇的产生。 [注意事项]

1、破坏蟾蜍脑和脊髓要完全。

2、蛙心夹与机械换能器间的连线一定要垂直，且与心轴一致，并应有一定的紧张度。 3、注意滴加任氏液，以保持蛙心适宜的环境。

[思考题]

1、心肌受到一次刺激产生兴奋后，兴奋性的周期性变化的特点是什么？与骨骼肌有什么不同？

2、心肌为什么能产生自动节律性的收缩与舒张？ 3、期前收缩和代偿间歇产生的原理。

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实验7 蛙心灌流（选修）

[目的与原理]

掌握离体蛙心的灌流方法；了解内环境理化因素的相对恒定对维持心脏正常节律性活动的重要作用；并观察Na+、K+、Ca2+、肾上腺素、乙酰胆碱等对心脏活动的影响。

蛙心起搏点静脉窦能按一定节律自动产生兴奋，因此将离体蛙心保持在适宜的环境中，在一定时间内仍能产生节律性兴奋和收缩活动；心脏正常的节律性活动有赖于内环境理化因素的相对稳定，所以改变灌流液的成分，则可以引起心脏活动的改变。 [实验对象] 蛙或蟾蜍。

[试剂与器材]

任氏液、0．65%NaC1、2êC12、1%KC1、1：10000肾上腺素、1：10000乙酰胆碱、计算机、生物信息采集处理系统（或二道仪、刺激器）、蛙类手术器械、蛙心夹、蛙心插管、机械换能器、铁架台、双凹夹、试管夹、小烧杯、滴管、丝线、玻璃分针。

[实验步骤]

1、离体蛙心的制备：

（1）取蟾蜍一只破坏其脑和脊髓后，仰卧位固定于蛙板上，剪开胸壁，暴露心脏，在两个主动脉干下穿两根细线将其中一根打活结备用（用以结扎和固定插管）。将连有细线的蛙心夹在心舒期夹住心尖部。

（2）用玻璃分针将心脏轻轻向上翻转，将主动脉干下的另一根细线向下拉，在静脉窦的远端做一结扎（切勿扎在静脉窦上），以阻止血液回流心脏。

（3）将心脏翻回原位置，用眼科剪在主动脉球上端向下剪一斜向的切口，将盛有少量任氏液的蛙心插管由切口插入动脉球，再将蛙心插管尖端转向背侧及左下方，于心缩期插入心室内（插管不可插得太深）。插管如已进入心室，则见管中液面随着心搏而升降，此时即可将预置线的活结扎紧，并固定于插管壁的小钩上，以免插管滑出心室。

（4）将心脏连同静脉窦一起剪下，必须注意不得损伤静脉窦。吸去管内的血液，并用任氏液反复冲洗心室内的余血，以防止血液凝固而影响实验的进行。

2、实验装置：将蛙心插管用试管夹固定于铁架台上，蛙心夹的细线连接在机械换能器的簧片上。换能器的输出线与计算机的输入接口相连接。

3、打开计算机，进入Biolap98菜单条 →实验项目（单击）→循环实验→蛙心灌流（单

击），并根据蛙心的灌流液做好标记。（图1-7-10）

4、观察项目： （l）记录心脏收缩曲线，观察心率及收缩幅度，作为正常对照。

（2）吸去插管内的任氏液，换以等量的0．65%NaC1，观察并记录心脏的活动变化。

（3）吸出管内溶液并用任氏液冲洗数次后换以等量任氏液，待心脏恢复正常后，加入2êC121～2滴，观察并记录心脏的活动变化。

（4）同上法冲洗并换以等量任氏液，待心

脏

恢复正常后，加入1%KCI 1～2滴，观察并记录

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心脏的活动变化。

图1-7-10蛙心灌流仪器连接方法

（5）同上法冲洗并换以等量任氏液，待心脏恢复正常后，加入1：10000肾上腺素2～3滴，观察并记录心脏的活动变化。

（6）同上法冲洗并换以等量任氏液，待心脏恢复正常后，加入1：10000乙酰胆碱1～2滴，观察并记录心脏的活动变化。 [方法评估]

检验心肌生理特性的基本方法之二，手术及操作亦较简单易于掌握。 [应用意义]

为心肌生理特性验证性实验，主要用于验证或检测内环境因子对心脏活动的影响。 [注意事项]

1、蛙心夹应一次夹住心尖，不宜反复多次以致损伤心脏，导致漏液。蛙心夹与换能器簧片的连线呈一定的倾斜度，以防止溶液滴入换能器。

2、当各项实验效果明显后，应及时将插管内溶液吸出，用任氏液反复冲洗数次，待心跳恢复正常后，再进行下一项实验。

3、各种溶液的吸管必须分开，不要混用。

4、在实验过程中，蛙心插管内灌流液的液面高度应适宜，一般为1～2cm，在各项观察项目中，液面高度应保持一致。仪器各项参数一经调好也不可变动。

5、加药后效果不明显可适量滴加并密切注意计量增加后的实验结果，出现变化应立即更换任氏液，加药过量会导致不可挽回的后果或难以恢复的心脏停跳。

6、每进行观察项目时，先记录一段正常对照曲线，然后再加入待试液，并记录其效应。 [思考题]

1、高K+高Ca2+高Na+对心脏活动有什么影响，其机理如何？ 2、从心肌生理特性分析以上实验结果。

实验8 鱼类心脏灌流（选修）

[目的和原理]

掌握鱼类离体心脏灌流方法，并通过自主性药物对心脏活动的影响，加深对鱼类心肌某些特性的理解。

离体心脏在生理盐溶液中能保持一定的节律性兴奋与收缩活动。将离体鱼心置于生理盐溶液中，并通过导管对心脏进行灌流，再通过记录装置，便可记录与分析心脏活动规律。同时利用这一装置，可以研究内环境渗透压、自主性药物、及其它因子等对心脏活动的影响，特别是对心肌自动节律性的影响，从而加深对心肌细胞生理特性的理解。 [试剂与器材] 材料：鲤

试剂：

1、灌流液（鱼类生理盐溶液：）NaCl：7.526g ，KCl：0.417g，CaCl2：0.322g，MgCl2：0.095g，NaHCO3：0.193g，KH2PO4：0.122g，葡萄糖：2.91g，蒸馏水：lL，配好后溶液的pH值为6.9。

2、肾上腺素，乙酰胆碱、5一羟色胺：用灌流液配制成10－5的浓度。 器材：

实验装置(如图1-7-11所示)

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[实验步骤]

1、 用MS-222把鱼麻醉，打开胸腔，迅速取出心脏，要保留一定长度的腹大动脉和主 静脉，放入盛有100ml灌流液的培养缸中。

2、如图1-7-11所示，从后主静脉或肝静脉插入一塑料小管(选择合适的管径)，在窦房结处结扎，从腹大动脉插入另一管，在与动脉球连接处结扎。

3、按图1-7-11所示接好灌流装置。灌流速度调整为2—3ml／min。灌流液从容器中经蠕动泵，稳流烧瓶和导管进入静脉窦，再从动脉球流出，流出的液体用量简收集，计算其速度。用压力换能器记录心脏活动。换能器上有一根短的钨丝、其末端连着一个小塑料珠子(4mm)。珠子紧靠心室放置，心房和心室收缩引起钨丝偏斜，经放大而显示在内应力测定记录仪上(Dynagraph recorder)。

4、在3—6s内，从注射阀门注入药物0.05-0.2ml，观察心脏收缩的变化。每种药物注入后，要经过一段时间让心脏恢复正常，才能注入第二种药物。

图1-7-11 鱼心脏灌流装置图

[方法评估]

该方法为了解鱼类心肌某些特性的基本实验方法之一，其实验装置和手术操作都较复杂，且较难以掌握，可用于研究性实验。

[应用意义]

了解鱼类心肌特性的验证性实验也可用作研究各种因素（如农药、有机物污染、高氨氮等）对鱼类等水产动物心脏功能的影响。

[注意事项]

1、手术一定要认真仔细，以免穿透心脏难以进行灌流；

2、在灌流过程中一定注意要在恢复正常后才能加入第二种药物；

3、出现曲线变化后即刻换掉药物以免长时间作用难以恢复生理功能。

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[思考题]

1、实验中化学物质对鱼类心脏活动的影响如何；与高等脊椎动物比较有何不同。

2、分析对比肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺等对心脏收缩的影响并讨论其作用机理。

实验9 离体小肠平滑肌的生理特性（必修）

[目的与原理]

掌握离体小肠平滑肌收缩的记录方法。通过观察化学物质、温度变化对离体小肠平滑肌收缩的影响，加深对平滑肌某些基本特性的理解。

消化道平滑肌除具有与骨骼肌相同的某些特性（如兴奋性、收缩性）外，还具有自动节律性和对某些化学物质特别敏感的特性；离体肠段还具有一定紧张性。

离体小肠平滑肌在适宜环境中仍可保持其生理功能，因此可以将小肠肠段置于模拟的内环境中观察各种理化因子的变化对小肠平滑肌收缩活动的影响。 [实验对象]

家兔离体肠段。

[试剂和器材]

木槌，平滑肌恒温浴槽，生物信息采集处理系统，计算机，球胆，氧气，滴管，烧杯，普通剪刀，手术剪，镊子，热水，冰块，台氏液，肾上腺素(1：10 ,000)，乙酰胆碱(1：100 ,000)，10g／LCaCl2，NaOH(1mol/L )，HCl(1 mol/L)。

[实验步骤]

1、实验准备

(1)制备标本：提起家兔后肢将其倒悬，用木槌猛击头部致昏迷。立即开腹，在十二指肠及其邻近部位剪20 ～ 30cm长的肠段，用台氏液冲洗肠段中的内容物，然后剪成数小段(每段长约2 -3cm)，用棉线结扎肠段两端，置于4～6℃台氏液中备用。

(2)加热恒温浴槽：将台氏液加入恒温浴槽中心管内，外部容器中装入温水(略低于38℃)，开启电源加热，浴槽温度就会自动控制在38℃左右。

(3)连接好仪器，选择适当的参数。

(4)放置标本，连接实验装置：将肠段一端结扎线连在中心浴槽内标本固定钩上，另一端结扎线连在张力换能器上，将浴槽充气管与充满氧气的球胆相连，调节三通开关．使气泡小而连续地通至中心浴槽．以供给标本足够的氧气。换能器的输出线与计算机输入接口相连接。参看图1-7-12。

(5)打开计算机，在功能菜单上选择本实验的软件后，使系统进入信号采集状态。单击实验项目→平滑肌实验，并根据注入的药物做好标记。

2、观察项目

(1)自动节律收缩：在不施加刺激的情况下，观察记录其舒缩状况。注意节律、波形、幅度及紧张性(依据曲线的基线变化而定)。

(2)Ach的作用：用接有腰穿针头的注射器抽取1：100,000Ach 0.4 ml。插入浴槽内适当深度后注入，使其迅速发挥作用。观察曲线变化．出现明显效果后．立即更换浴槽内台氏液，反复3次。待平滑肌收缩恢复后，再进行下一项观察。

(3)肾上腺素的作用：按上法注入1：10 ,000肾上腺素0.4 ml，记录到曲线明显变化后，按上法更换台氏液。

(4)CaCl2的作用：按上法给予1：100CaCl20.4ml。观察平滑肌的反应后，按前法更换台氏液。

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(5)温度的影响：在浴槽中加一小块台氏液制的冰块，以降低浴液温度（约至25℃左右），观察平滑肌的反应。待冰块融化，浴槽内温度回升后，即可进行下一项而不必换液。

(6)HCI的作用：将1mol/L的HCl0.4 ml加入浴槽内，观察平滑肌的反应，按前法更换台氏液。

(7)NaOH的作用：将1mol／L的NaOH 0.4ml加入浴槽内,观察平滑肌的反应。

图1-7-12 离体小肠平滑肌实验装置

[方法评估]

上述实验可使用两套浴槽中的任一套，用玻璃浴槽简便但控温不理想。恒温浴槽控温较好也较简便，价格较贵。

[应用意义]

为平滑肌生理特性验证性实验，主要应运于观察分析平滑肌生理特性自动节律性、收缩性及其各种理化因子对它的影响。

[注意事项]

1、注意保持浴槽内温度在38℃左右，每次更换台氏液前，要先将台氏液加热至38℃左右再加入浴槽内。

2、每项实验出现作用后，要及时更换台氏液并冲洗数次，待肠段恢复正常后再进行下一个实验。

3、滴加药液时，要有一定深度，且需计量适度，不可加药过量。 [思考题]

1、小肠平滑肌有哪些特性?

2、小肠平滑肌受哪些因素调节?

实验10 反射中枢活动的某些基本特征及反射弧的分析（选修）

[目的与原理]

通过对某些脊髓反射（如脊蛙的屈肌反射）的分析，了解反射弧完整性与反射活动的关系

掌握反射时的测定方法，通过用不同浓度的硫酸溶液刺激蛙趾引起屈肌反射，了解刺激强度与反射时的关系。

以脊蛙的屈肌反射为指标，观察反射中枢活动的某些基本特征，并分析它们产生的机制。

在中枢神经系统的参与下，机体对刺激所产生的具有适应意义的规性律性反应过程称

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为反射。将动物的高位中枢切除仅保留脊髓的动物成为脊髓动物（如脊蛙），它们产生的反射活动为单纯的脊髓反射，由于失去高位中枢的控制反射活动较为简单，便与观察与分析反射过程的某些特征。

反射活动的结构基础是反射弧。典型的反射弧由感受器、传入神经、神经中枢、传出神经和效应器五个部分组成。反射弧必须保持完整性，才能引起反射，其中任何一个环节受到破坏，反射活动就无法实现。 在反射活动中，由于神经元特别是中间神经元联系方式的不同，使反射活动表现出种种特征。如：反射时（从刺激作用于感受器至效应器出现反应所经历的时间）的长短、反射活动空间范围的大小、反射活动持续时间的久暂以及引起反射活动的刺激条件等等。 [实验对象] 蟾蜍。

[试剂与器材]

硫酸溶液（0．1%、0．3%、0．5%、1%）、纱布。蛙类手术器械、铁架台、血管钳一把、秒表、玻璃平皿、肌夹、搪瓷杯、小滤纸（约1cm×1cm）、刺激电极两个、双输出电刺激器一台、烧杯。

[实验步骤] 1、实验准备

取蟾蜍一只，用粗剪刀由两侧口裂剪去上方头颅，制成脊蟾蜍。将动物俯卧位固定在蛙板上，于右侧大腿背侧纵行剪开皮肤，在股二头肌和半膜肌之间的沟内找到坐骨神经干，在神经干下穿一条细线备用。手术完后，用肌夹夹住动物下颌，悬挂在铁架台上。 2、实验项目

（l）反射中枢活动的某些基本特征

①反射时的测定：在平皿内盛适量0.1%硫酸溶液，将蟾蜍一侧后肢的一个脚趾尖浸入硫酸溶液中，同时按动秒表记录从浸入时起至后肢发生屈曲所需要的时间，并立即将该足趾浸入搪瓷杯水中浸洗数次，然后用纱布拭干。用上述方法重复三次，注意每次浸入趾尖的深度要一致。三次所测时间的平均值，即为此反射的反射时（两次实验间隔至少2～3min）。然后平皿中分别换以0.3%、0.5%、1%的硫酸溶液再重复上述测定，比较四种浓度硫酸所测之反射时是否相同。

②反射的空间范围（扩散）：将一个电极放在蟾蜍后肢的足面皮肤上，先给予弱的连续电刺激，观察发生的反应，然后依次增加刺激强度，观察每次增加强度所引起反射的空间范围有何变化。

③反射的持续时间（后放）：在观察反射的空间范围中，还要注意观察随刺激强度的增加，所引起反射持续的时间有何变化，并以秒表计算至刺激停止起到反射活动结束之间共持续多少时间（后放）。 ④阈下刺激引起反射的条件：将两个刺激电极各连接刺激器的输出端，然后分别与蟾蜍同一后肢相同的皮肤区域接触，用单个电刺激找出引起屈肌反射的阈值，再用略低于此阈值的阈下刺激分别给以单个电刺激，如均不引起反应，然后把两个电极放在皮肤的同一区域，距离不超过0.5cm，当同时给予阈下刺激时，观察可否引起反射。

另外，只放一个电极在后肢皮肤上，在给一次阈下刺激不能引起反射的情况下，换以连续刺激并依次增加刺激频率，记录哪一频率最早引起反射，并计算该频率刺激的时间间隔（即刺激频率的倒数）。 ⑤反射的抑制：用0．5%硫酸溶液测定反射时，然后用止血钳夹住一侧前肢，给一个较强的刺激，待动物安静后再测反射时，观察其有无延长？ （2）反射弧的分析

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①用浸有1%硫酸溶液的小滤纸片贴在下腹部。观察双后肢有何反应？待反应出现后，将动物浸于搪瓷杯的清水内洗掉滤纸片和硫酸，用纱布擦干皮肤。提起穿在右侧坐骨神经下的细线，剪断坐骨神经，再重复上述实验，比较两次结果有何不同？

②分别将左右后肢趾尖浸入盛有1%硫酸的小平皿内（两侧浸没的范围相等且仅限于趾尖），双侧后肢是否都发生反应？ ③沿左后肢趾关节上做一环形皮肤切口，将切口以下的皮肤全部剥脱（趾尖皮肤一定要剥干净），再用1%硫酸溶液浸泡该趾尖（切不可将其他趾尖浸入），观察该侧后肢的反应。 ④将一1%硫酸纸片贴于左后肢皮肤，观察引起的反应，用搪瓷杯中清水洗掉纸片及硫酸，擦干皮肤后，将探针插入脊髓腔内反复捣毁脊髓，再重复刚才的实验。结果如何？ [方法评估]

操作简单、易于掌握，为常规实验方法。

[应用意义]

为了解中枢神经系统某些特征及活动规律的验证性实验，主要用于观察分析中枢神经系统内反射中枢的活动规律及反射弧的完整与反射活动的关系。

[注意事项]

1、离断颅脑部位要适当，太高可能保留部分脑组织而出现自主活动，太低也会影响反射的引出。

2、每次用硫酸溶液或纸片处理后，应迅速用搪瓷杯中的清水洗去皮肤上残存的硫酸，并用纱布擦干，以保护皮肤并防止冲淡硫酸溶液。测定反射时的硫酸浓度应由低到高。 3、施加电刺激时，要区别是通过皮肤刺激了传出神经或肌肉引起的局部反应，还是引起的反射性反应。

4、浸入硫酸溶液的趾尖应仅限于一个，而且每次浸泡的范围也应恒定，切勿浸入太多。 [思考题]

1、何谓反射时，反射时与刺激强度之间有何关系？ 2、反射弧包括哪几部分？剥去趾关节以下的皮肤后不再出现原有的反射活动，为什么？

3、何谓时间总和和空间总合？

第二节 血液组成成分及其性质的分析测定

鱼类等脊椎动物血细胞的形态、数量、白细胞分类及其比例、生理特性（红细胞悬浮稳定性及渗透脆性等）以及血浆中的各种组成成分（包括多种蛋白质、非蛋白氮及其它有机物、无机物）、理化特性（包括比重、粘滞性、渗透压、pH等）都是相对稳定的，即为内环境相对稳定性，它具有重要的生理意义。

机体感染疾病或受到环境污染物的胁迫时，以上各项生理生化指标，特别是血细胞形态（变形率）、数量、白总分、血细胞生理特性及血浆中各组成成分会发生较大的变化。测定水产动物（鱼类）这些指标的变化及其变化幅度有助于水产动物（鱼类）疾病的初步诊断及其抗病力、抗污染力的分析研究。

本节所介绍的内容为以上各项生理生化指标的常规检测方法和基本操作技能，其实验设备简单、实验方法经典成熟、操作简便易行，主要应用于鱼类血液中各项生理生化指标的检测，由于无脊椎动物（虾、贝类）血细胞形态、分类、功能、性质及血液各组成成分与鱼类等脊椎动物存在较大的差异，所以这些方法只能参考应用。

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实验11 红细胞与白细胞的计数（必修）

[目的与原理]

掌握鱼类采血技术和鱼类红、白细胞计数的原理和方法，并测定不同鱼类的红、白细胞含量及其差异。

采用稀释法计数鱼类单位容积血液内的红细胞和白细胞数。由于血液中红、白血细胞数很多无法直接计数，故需用适当的溶液将血液稀释。然后将稀释血滴入血细胞计数板上，在显微镜下计数一定容积的红、白细胞数。再将所得的结果换算为每立方mm血液中红、白细胞个数。

[实验对象]

鲤、鲫或草鱼。

[试剂与器材]

显微镜，血细胞计数板，计数器，鱼用注射器（1ml或5ml），吸血管，凹瓷盘，消毒棉球，纱布，擦镜纸，小试管及试管架，移液管（1ml及2ml），红、白细胞稀释液（或0.85—0.9%的NaCl溶液），75%的酒精，蒸馏水，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。 [实验步骤]

1、熟悉血细胞计数板的构造：血细胞计数板为一长方形厚玻璃板。其中计数室方格大小的划分，各种产品略有不同，但基本原理相同。其中央横沟的两边各有一计数室，两计数室的划分完全相同（图1-5-1）。在显微镜低倍下观察，可见每个计数室用双线划分成9个大方格（图1-5-2）。大方格每边长1.0mm。四角的大方格每个又分为16个中方格，这是用以计数白细胞的。中央的一个大方格用双线分成25个中方格，每个中方格又等分成16个小方格（用单线），中方格每边长为0.2mm，计数红细胞时，数中央大方格的5个中方格（即四角和中央的中方格）内的红细胞数目（图1-5-2）。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1mm，因此，放上盖玻片后，计数板与盖玻片之间的距离为0.1mm，此为计数室的高度。

2、采血及稀释：以2ml移液管在干净的小试管内准确加入红细胞稀释液或0.85~0.9%的NaCl溶液2ml，另用1ml移液管在另一干净的小试管内加入白细胞稀释液0.38ml，备用。

鱼类血液可从心脏或尾动脉中采取。方法是将鱼腹部向上固定在鱼解剖台上，或用纱布包好握在手里，用浸润过抗凝剂的注射器沿鱼体中线与两腹鳍根部之间相交部位刺入，依据解剖部位确认已刺入心脏，可稍后拔针管，如有血液吸入即可，否则重新拔出再刺。

图 1-5-1 血细胞计数室结构 图 1-5-2 血细胞计数区

尾动脉取血方法是用注射器从鱼体臀鳍后部插入至椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每

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尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入之前。

将抽出的血液放入经抗凝剂处理的凹瓷盘内，用微量（血红蛋白）吸血管吸取10μl血液至红细胞稀释液试管内，再吸取20μl血液至白细胞稀释液试管内，轻轻挤出血液并反复吸洗2～3次。然后将血液与稀释液混和均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。

3、充液：将盖玻片先盖在计数板上，用洁净的吸血管吸取摇匀的稀释血液，然后将吸管口轻轻斜置盖玻片的边缘，滴出少量稀释血液，使溶液借毛细管现象而流入计数室内。但必须注意，如滴入过多时，流出室外凹沟中，易造成盖玻片浮起，体积不准；过少时，经多次充液，易造成气泡，所以都应洗去重新充液。

4、计数：稀释血液滴入计数室后，须静置2—3分钟，然后低倍镜下计数（显微镜焦距准确，缩小光圈并降低聚光器。使视野较暗）。计数白细胞时，数四角四个大方格内的白细胞总数。计数红细胞时数中央大方格四角的四个中方格和中央的一个中方格（共5个中方格）内的红细胞总数，计数时应循一定的路径以免遗漏或重复。对于分布在划线上的血细胞，依

照“数上不数下， 数左不数右”的原则进行计数（图1-5-3）。

计数白细胞时，如发现每个大方格白细胞数相差10个以上；计数红细胞时，如发现各个中格之间的红细胞数相差超过15个，表示血细胞分布不均匀。应将计数板洗净，重新摇匀稀释血液，再充液计数。 5．计算

红细胞数目：将5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000．即得每立方mm血液中红细胞总数。

图1-5-3 血细胞计数方式 （实心圈表示计数的红细胞， 空心圈表示不应计数的红细胞）

计算公式为：红细胞数/mm3 = 5个中格红细胞数3稀释 （1）

倍数/计数的5个中格容积

稀释倍数等于稀释液2ml除以加入血10μL（0.01ml），为200倍。

（2） 计数室5 个中格容积为0.230.230.135 = 0.02 mm3。

白细胞数目：将4个大方格内数得白细胞总数乘以50，即每立方mm血液的白细胞总数。 计算公式为：白细胞数/ mm3 = 4个大方格白细胞数3稀释倍数/ 计数的4 个大格容积 （1） 稀释倍数等于稀释液0.38ml+血20μL（0.02ml）/0.02ml，为20倍。 （2） 计数室4个大方格容积为13130.134= 0.4 mm3。

[方法评估]

采用显微镜目视计数法为血液红、白细胞数量测定的最常用的基本方法，目前虽有各种自动化分析方法，但该方法由于经典、方便、实用，仍较广泛用于血液检验和科研实践中。 [应用意义]

红细胞是血液中数量最多的有形成分，在正常情况下几乎占血容量的1／2，故使血液呈红色粘稠混悬液。红细胞数量正常情况下保持相对稳定的。多数鱼100—300万个/mm，高者可达400万个/mm3 低者数十万/ mm3。

鱼类红细胞数也因性别不同而有差异，一般雄鱼的红细胞数比雌鱼多。此外鱼类红细胞数量常因鱼种、年龄、外界环境变化、机体不同生理状况（运动状况、患病、营养状况等）而出现一定的差异。环境变化如长期缺氧红细胞代偿性增多。

鱼类白细胞数量随种类、年龄、生理状况（产卵）、疾病以及一些外界环境因素影响而

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变化，此外，鱼类白细胞还与饲养条件、营养状况有关：饱食消化力旺盛时多，长期饥饿白细胞（特别是嗜酸性白细胞）显著减少。

[注意事项]

1、各种用具要事前清洗。清洗吸管时按照蒸馏水（两次）→ 95%酒精（两次）→ 乙醚（两次）的方法清洗。计数室用蒸馏水洗后，再用软纱布或擦镜纸吸干。

2、采血要求迅速、准确，不能凝血，也不能有气泡，否则弃去重采。 3、血吸管用完后必须立即清洗干净，以防血液凝固堵塞管口。

[思考题]

1、综合实验所得结果，与红、白细胞的正常值相对照，有何变异？为什么？

2、为什么机体正常血细胞数可维持在相对稳定的数量水平？ 3、试讨论鱼类红细胞的正常值及其应用意义？ 4、白细胞数量的变化有何生理意义？

5、血细胞计数室中央的大方各中每一种方格的容积是多少？

附 血细胞稀释液

1、白细胞稀释液

冰醋酸（破坏红细胞） 1.5毫升 1%龙胆紫（染白细胞核便于计数） 1毫升 蒸馏水 加至100毫升 2、红细胞稀释液

NaCl (维持渗透压) 0.5克

Na2SO4 (使溶液比重增加，红细胞分布不易下沉) 2.5克 HgCl （固定红细胞形状） 0.25克

蒸馏水 加至100毫升

实验12 血红蛋白含量的测定（必修）

方法一、酸化血红蛋白稀释测定法（改良沙利氏法）

[目的与原理]

掌握测定鱼类血红蛋白含量的原理和方法，应用改良沙利氏法测定不同鱼类血红蛋白含量。

本实验是应用比色法测定鱼的血红蛋白量。血红蛋白本身的色泽，常随所结合的氧量多少而改变，不便比色。但是加入稀盐酸于血液中可使血红蛋白变成不易变色的高铁血红蛋白，这就可以与标准色相比，从而测出其含量。通常以每100ml血液中含血红蛋白克数来表示，正常鱼血红蛋白含量为7—8g。

[实验对象]

鲤、鲫或草鱼。 [试剂与器材]

血红蛋白比色计，血吸管，注射器，凹瓷盘，小试管，试管架，蒸馏水，75%酒精，棉球，0.1mol/L盐酸，蒸馏水，滴管，纱布，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。 [实验步骤]

1、了解血红蛋白比色计的构成 血红蛋白计主要包括吸血管、比色计和比色管等部件。吸血管为一厚壁毛细玻璃管，其上有10μl、20μl的刻度，尾端连有橡皮头，供吸血用。

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比色计的两侧，装有标准浓度的高铁血红蛋白溶液，也有用比色玻璃柱（或片）来代替的。

比色管可插在比色计中，与两侧的标准比色柱进行比色。比色管的两侧通常刻有两行刻度。一行为血红蛋白的绝对值，以g计数（每100毫升血液中所含血红蛋白的克数）来表示，刻度范围为2～22。另一行为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，

刻度范围为10%～160%。目前测定常用绝对值来表示。

2、用蒸馏水将比色管洗净，吸血管则依次用蒸馏水，95%酒精和乙醚洗净干燥备用。 3、用滴管加0.1mol/L盐酸4—6滴到刻度比色管内，约加到管下端刻度“2”或“10%”处为止。

4、采血：采血方法见实验49，用吸血管吸血至20μl刻度（要准确）。用绵球仔细将管尖端外面的血拭去。

5、将吸血管中血液轻轻地滴到比色管中盐酸底部，并用上层较清的盐酸溶液反复清洗吸血管3次。使吸血管内的血液完全洗净。切勿带入空气，以至形成气泡影响比色。吸血管尖端残留的液体，应在比色管内壁上沥净。取出吸血管后，轻轻摇动比色管使血液与盐酸充分混合，静置15分钟使管内的盐酸和血红蛋白作用完全，形成棕色的高铁血红蛋白。 6、把比色管插入标准比色架两色柱中央的空格中，使无刻度的两侧面位于空格的前后方，便于透光和比色。

7、用吸管将蒸馏水逐滴地加入比色管内，每加一滴都应充分混匀并观察比色管内的颜色，直到比色管内溶液的色度和血红蛋白计上标准色度相同时为准，读出管内液面所在的刻度数，（读数应以溶液凹面最低点相一致的刻度为佳）。即为每100ml血液中所含血红蛋白的克数（用g/100ml表示）。

8、实验完毕应将吸血管和比色管洗净，放回盒内。

[方法评估]

采用目视比色法测定血红蛋白含量是比较常用及简便的方法，但此法误差较大，而且同仪器的准确度有关。

[应用意义]

血红蛋白含量与年令、性别、性周期、营养状况、活动情况、季节变化等有关，营养不良或长期饥饿可引起血红蛋白量显著降低。

[注意事项]

1、用吸血管吸血过程应仔细、认真，准确把握住吸入的血液量是初学者的一个难点，也是实验结果准确与否的一个关键。

2、血红蛋白吸管很容易被损坏，应妥善爱护。管内有凝血块时不可用金属丝疏通，可浸泡入氨水或45%尿素溶液中，待血块去除后再用水洗净，并按蒸馏水→ 95%酒精→ 乙醚的顺序清洗，最后吹干吸管。

3、盐酸浓度不可过稀。血液与盐酸作用时间不可过短，必须在10分钟以上方可稀释比色，否则血红蛋白不能充分转变成高铁血红蛋白。最好在30分钟内比色完毕。

4、滴加蒸馏水时，宜少量多次，逐滴加入后混匀比色，以免稀释过度，得不到准确结果。

5、比色应在自然光线下进行，避免在阴暗处或有色灯光下比色，并将比色管刻度转向两侧，以免影响比色效果。

方法二、氰化高铁血红蛋白测定法

[目的与原理]

应用氰化高铁血红蛋白（HiCN）法，测定不同鱼类血红蛋白含量。

血红蛋白(Hb)被高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]氧化为高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子结合成

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