环孢素A丙烯酸树脂L100纳米粒的研究 - 图文

硕 士 学 位 论 文

（2008届）

环孢素A丙烯酸树脂L100纳米粒的

研究

Study on the cyclosporine A-loaded Eudragit L100

nanoparticles

研究生姓名 潘萍 指导教师姓名 张学农（教授） 专 业 名 称 药物化学 研 究 方 向 药物新技术与新剂型 论文提交日期 2008年5月

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目录

前言……………………………………………………………………………………1 第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺……………………………………………… 2 §1.1实验仪器与材料…………………………………………………………………2 §1.2方法与结果………………………………………………………………………3 一、环孢素A体外含量测定方法的建立……………………………………………3 1. 色谱条件………………………………………………………………………… 3 2. 线性关系的考察………………………………………………………………… 3 2.1 标准母液的配制…………………………………………………………………3 2.2 标准曲线的绘制…………………………………………………………………3 3. 回收率实验………………………………………………………………………4 4. 精密度实验………………………………………………………………………4 5. 最小检出量的测定………………………………………………………………5 6. 色谱方法专一性的考察…………………………………………………………5 7. 样品的测定方法…………………………………………………………………5 7.1 纳米粒总药量的测定………………………………………………………… 5 7.2 纳米粒包封率的测定………………………………………………………… 5 7.3 回收率、包封率、载药量的计算方法……………………………………… 6 二、环孢素A纳米粒(CyA-L100-NP)制备工艺优化…………………………… 6 1. 处方前药物环孢素A理化性质的研究……………………………………… 6 2. 单因素考察……………………………………………………………………… 7 2.1 乳化剂泊洛沙姆的含量…………………………………………………………7 2.2 载体材料的含量…………………………………………………………………7 2.3 搅拌速度…………………………………………………………………………7 2.4 挥发时间…………………………………………………………………………7 2.5 温度………………………………………………………………………………7 2.6油相与水相比例…………………………………………………………………7 2.7其他因素的影响…………………………………………………………………7

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3. 环孢素A纳米粒(CyA-L100-NP)的制备方法……………………………………7 4. 均匀设计实验及处方的优化……………………………………………………8 4.1 均匀设计…………………………………………………………………………8 4.2结果评价…………………………………………………………………………8 4.3 数据处理…………………………………………………………………………9 4.4最佳处方…………………………………………………………………………9 4.5 验证实验……………………………………………………………………… 9 三、 环孢素A纳米粒的理化性质…………………………………………………10 1.环孢素A纳米粒的形态特征…………………………………………………10 2.环孢素A粒径大小及分布……………………………………………………10 3.X衍射图 ………………………………………………………………………11 §1.3讨论与小结……………………………………………………………………11 §1.4总结……………………………………………………………………………12 第二章 环孢素A纳米粒稳定性与冻干工艺的初步研究………………………13 §2.1实验仪器与材料………………………………………………………………13 §2.2方法与结果……………………………………………………………………13 一、环孢素A纳米粒溶液稳定性实验……………………………………………14 二、环孢素A纳米粒冻干工艺的初步研究………………………………………15 1.冷冻干燥简介……………………………………………………………………15 2.纳米粒冻干工艺研究……………………………………………………………16 2.1纳米粒溶液的浓缩………………………………………………………………16 2.2.冻干保护剂的粗筛选……………………………………………………………16 2.2.1不同保护剂的冻融实验………………………………………………………16 2.2.2不同保护剂的冻干实验………………………………………………………17 2.3乳糖和蔗糖冻干保护剂浓度的筛选 …………………………………………18 2.4 低浓度乳糖冻干保护剂的进一步筛选………………………………………19 2.5 冻干工艺的初步建立…………………………………………………………20 2.5.1 冻干曲线的绘制……………………………………………………………20 2.5.2 重现性实验…………………………………………………………………20

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2.5.3冻干品的粒径分布图………………………………………………………21 §2.3讨论及小结…………………………………………………………………22 §2.4总结……………………………………………………………………………23 第三章 环孢素A 纳米粒的体外释药性质研究…………………………………24 §3.1实验仪器与材料………………………………………………………………24 §3.2方法与结果……………………………………………………………………24 一、体外释放介质的选择…………………………………………………………24 二、纳米粒体外释放实验…………………………………………………………25 §3.3讨论及小结……………………………………………………………………26 §3.4 总结……………………………………………………………………………27 第四章 环孢素A纳米粒小鼠组织分布研究…………………………28 §4.1实验仪器与材料………………………………………………………………28 §4.2方法与结果……………………………………………………………………29 一、RP-HPLC法分析CyA生物样品浓度方法的建立……………………………29 1.生物样品的处理方法…………………………………………………………… 29 1.1血及各器官组织预处理……………………………………………………… 29 1.2血样处理方法……………………………………………………………………29 1.3组织样品处理方法………………………………………………………………29 2.色谱条件………………………………………………………………………… 29 3.色谱行为…………………………………………………………………………29 4. 标准品溶液的配制………………………………………………………………32 4.1 CyD内标母液的配制……………………………………………………………32 4.2 CyA标准母液的配制……………………………………………………………33 4.4 标准曲线的制备……………………………………………………………… 33 4.5 回收率及精密度实验………………………………………………………… 33 4.5.1提取回收率实验………………………………………………………………33 4.5.1.1内标CyD提取回收率………………………………………………………33 4.5.1.2 药物CyA的提取回收率…………………………………………………34 4.5.2 方法回收率及精密度实验…………………………………………………35

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二、小鼠体内药物动力学及组织分布研究………………………………………35 1.样品的配制………………………………………………………………………35 1.1 对照组新山地明微乳溶液（Neoral）的配制………………………………35 1.2 制剂组环孢素A纳米粒溶液（CyA-L100-NP）的配制……………………35 2.实验方法…………………………………………………………………………35 2.1 分组及给药方法………………………………………………………………35 2.2取样方法及取样点的设计……………………………………………………35 3. 数据处理…………………………………………………………………………36 3.1含量测定结果……………………………………………………………………36 3.2 药物相对含量比较……………………………………………………………41 3.3单点横向比较…………………………………………………………………45 3.4.药动学解析……………………………………………………………………48 3.4.1 相对生物利用度的计算……………………………………………………48 3.4.2 房室模型拟合………………………………………………………………49 3.5 靶向性评价……………………………………………………………………52 §4.3讨论及小结……………………………………………………………………54 §4.4总结……………………………………………………………………………55 全文总结……………………………………………………………………………57 参考文献……………………………………………………………………………58 综述…………………………………………………………………………………61 综述参考文献………………………………………………………………………71 个人简历和发表文章………………………………………………………………75 致谢…………………………………………………………………………………76

苏州大学硕士学位论文 中文摘要

中文摘要

目的：优化环孢素A丙烯酸树脂L100纳米粒（CyA-L100-NP）的制备工艺，考察纳米粒溶液的放置稳定性,冷冻干燥技术及体外释放特性，研究其体内药物动力学和组织分布特性。

方法：以高分子材料丙烯酸树脂Eudragit L100为载体材料，以泊洛沙姆188（P188）为乳化剂，应用乳化-溶剂扩散技术制备环孢素A纳米粒，以纳米粒粒径、包封率和载药量等为综合指标， 均匀设计U7（76）优化处方工艺。动态激光散射法测定纳米粒的粒径分布，透射电镜观察纳米粒表面形态，X-衍射法观察纳米粒的物理特性。考察样品在4、25、40℃条件下放置两个月，粒径、含量和纳米粒包封率的稳定性。

考察2%、4%、6%的海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇作冻干保护剂对纳米粒的冻干保护作用，从中筛选出最佳冻干保护剂，确立冻干工艺并进行验证。以新山地明（Neoral）为对照制剂，研究纳米粒在pH1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.8、7.4含0.1%SDS的缓冲溶液中的释放情况，比较两种制剂释药差异。昆明种小鼠120只（♂）,按照CyA25mg/kg剂量灌胃给予Neoral和CyA-L100-NP溶液，于给药后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24h，共10个时相点，小鼠摘眼球取血，取心、肝、脾、肺、肾组织研磨，匀浆，加入内标环孢素D（CyD）,液-液萃取法提取药物后，HPLC法测定含量。3P87程序拟合房室模型，梯形面积法计算药动学参数，并进行靶向性评价。

结果：纳米粒平均粒径为39.75?0.50nm,包封率为99.57?0.04%，回收率为92.21?2.06%，载药量为15.37?0.34%，通过电镜照片可知，纳米粒粒子小，呈圆形或椭圆形，分布均匀。由X-衍射图可知环孢素A被包裹于纳米粒中，不再显示药物峰。纳米粒溶液在4℃及25℃下可以稳定放置2个月，粒径、含量和包封率没有显著变化，在40℃时放置1个月后粒径显著增大，提示应避免高温放置。采用2%的乳糖作为冻干保护剂，冻干保护效果好，冻干复溶后可使纳米粒平均粒径控制在100nm左右。新山地明在各pH值条件下释放行为没有显著性差异，释药量均＞82%，环孢素A纳米粒药物释放量随pH值的增加而增加。Neoral和CyA-L100-NP在血液中的药动学行为均可用二室模型描述（权重为1）。与

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Neoral相比，CyA-L100-NP的相对生物利用度为118.3%。组织分布实验结果表明CyA-L100-NP没有显著靶向性，但改变了药物在体内的分布，相对提高了在 脾和肺中的分布，降低了肝和肾中的分布，从而推测有利于降低药物的肝毒性和肾毒性。

结论：本文系统优化纳米粒制备及冻干技术，获得相对稳定的纳米粒制备工艺，通过HPLC色谱条件及可靠的生物样品处理方法的建立，综合评价了小鼠口服纳米粒后的药动学和组织分布特性，为环孢素A纳米粒给药系统的开发和应用奠定了理论基础。

关键词：环孢素A Eudragit L100 纳米粒 均匀设计 冷冻干燥 体外释药 组织分布

M.S. Thesis of Soochow University Abstract

Abstract

Objective: The cyclosporine A-loaded Eudragit L100 nanoparticles (CyA-L100-NP) were prepared by optimal technological procedure, its stability of storage, freeze-drying technique and the characteristic of drug release in vitro were investigated. The pharmacokinetics and distribution characteristics were also studied.

Method: CyA-L100-NP were prepared by quasi-emulsion solvent diffusion technique，choosed Eudragit L100 as the carrier material and poloxamer 188 as the

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emulsifying agent . The uniform experimental design ﹝U（﹞ was applied to the 77）

optimization of the formulation based on the particle size, the drug loading and entrapped efficiency etc. CyA-L100-NP was analyzed by dynamic light scattering for the particle size, transmission electron microscopy for morphology and x-ray diffractometer for physical characteristics. CyA-L100-NP were stored under 4,25,40℃ during two months. The stability of the sample about the particle sizes , the content of CyA and the drug entrapped was investigated.

The cryoprotectants of 2%, 4% and 6% trehalose, sucrose , lactose ,glucose, sorbitol and mannitol were studied in freeze-drying test in order to evaluating the protection of nanoparticles. The best cryoprotectant was chosen and the freeze-drying technique was established. CyA-L100-NP or Neoral were dispersed into the phosphate buffer containing 0.1% SDS at different pH values such as 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 6.8, 7.4 respectively. The defference of drug release between the two preparations was compared.120 mice , ♂, were oral administration Neoral or CyA-L100-NP at the dose of 25mg/kg. After oral administration, at the different times such as 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12h, the blood was obtained by culling the eyeballs. After executing mice by cutting down their cervicums ,the heart ,liver, spleen, lung and kidney were rapidly removed ,grinded into homogenate, added internal standard Cyclosporine D(CyD), the drug was extracted by liquid-liquid extraction method and determined by HPLC. Their compartment models were fitting by 3p87 software and their pharmacokinetics parameters were calculated using trapezoidal rule. The

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targeting properties were evaluated.

Results: The average particle size of nanoparticles was 39.75±0.50 nm, the yield was 92.21±2.06%, the drug entrapped efficiency was 99.57±0.04% and the drug loading was 15.37±0.34%. The nanoparticles had small size , were look around or ellipse and regular under TEM. The drug peak was disappeared in the x-ray diffraction pattern, showed that CyA was enveloped in the nanoparticles. The nanoparticle colloids solution could stored under 4,25℃ during two months, without changing of the particle size, drug content and entrapped efficiency. The size of nanoparticles became bigger after 1 month under 40℃,showed that the solution can’t be stored under high temperature.2% lactose was chosen as cryoprotectant, which had a good effecttion of freeze-drying. The average particle size of nanoparticles by freeze-thaw using water could be controlled at about 100nm. Neoral’s releasing behavior had no significant difference at different pH value and the releasing rate was over 80% in 2h.The release rate of CyA-L100-NP was increased with the higher pH value .Two-compartment model(weight 1) was adaorive to describe the pharmacokinetic charateristics of Neoral and CyA-L100-NP in blood of mice. Compared with Neoral ,the relative bioavailability of CyA-L100-NP were 118.3%. The distribution experiment showed that CyA-L100-NP had no targeting effect compared to Neoral, but it changed the distribution of drug in vivo, the drug was dispersed more in spleen and lung, less in liver and kidney .It was supposed that it might be profit to reducing hepatotoxicity and nephrotoxicity of CyA.

Conclusion: In this paper, the technique of preparing nanoparticles and freeze-drying was optimized systematically. The stable techonolgy of preparation was abtained. Based on the HPLC method and dependable sample treatment method of biological specimen, the pharmacokinetics and distribution characteristics of mice after oral administration were syntheticly assessed.This paper supported the theory foundation for the development and application of CyA-loaded nanoparticle drug delivery system.

Key word: Cyclosporine A; CyA; Eudragit L100; nanoparticle; uniform experimental design; freeze-drying; in vitro release; distribution

苏州大学硕士学位论文 前言

前言

环孢素A（Cyclosporine，CyA）是Tolypocladium真菌的一种代谢产物，是一种由十一个氨基酸组成的环状多肽，能特异而可逆地作用于淋巴细胞，而不影响造血及吞噬细胞的功能，是一种强效的免疫抑制剂，现已被广泛应用于肝、肾、肺、骨髓、胰等器官移植病人抗排斥反应以及自身免疫疾病如银屑病、类风湿关节炎等疾病的治疗。环孢素A具有较大分子量（1202.6），强亲脂性（lgP=2.92）和低水溶性（37℃，1.73μg/ml）,且高度依赖胆汁吸收，并具有广泛的胃肠道代谢作用， 因而口服吸收差，生物利用度低，个体差异大，限制了其在临床上的广泛应用[1-3]。而市售制剂新山地明（Neoral）口服遇胃肠液后能够自动乳化成30nm左右的微乳，改善了CyA口服生物利用度低，药动学变异性大的缺点。但是自微乳中含有的增溶剂Cremophor? EL能引起严重的肾脏毒性和过敏反应。

为解决上述存在问题，国内外应用药物制剂新技术将环孢素A制成微乳(microemulsions)，纳米粒(nanoparticles)，脂质体(liposomes)等。其中纳米粒具备了其他输送体系所无法比拟的优点，如靶向性给药，改变药物体内分布，调节释药速度，改善药物口服吸收，提高生物利用度，降低药物毒副作用等。由于其独特的药物保护作用及控制释放特性，可作为难溶性药物以及蛋白质多肽基因等不稳定药物的有效载体，具有极高的研究价值和开发潜力。

本课题以高分子聚合材料丙烯酸树脂Eudragit L100作为载体材料，以泊洛沙姆P188为乳化剂，采用乳化溶剂扩散法制备了CyA纳米粒(CyA-L100-NP)。以粒径大小、分布、回收率、包封率及载药量为指标，均匀试验法筛选最佳制备工艺，并对纳米粒表面形态及物理特征进行研究。此外，初步研究了纳米粒的稳定性和冻干工艺以及体外释药特性。以市售制剂Neoral为对照，通过小鼠口服给药研究药物体内药动学及组织分布，评价纳米粒能否提高CyA相对生物利用度以及是否具有靶向性，为制剂的进一步开发应用打下理论基础。

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苏州大学硕士学位论文 第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺

第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺

纳米粒是当前药剂学研究的新型亚微粒给药系统，具有靶向性给药，改变药物体内分布，调节释药速度，改善药物口服吸收，提高生物利用度，降低药物毒副作用等优点，已成为国内外药剂学研究的热点领域。纳米粒的制备方法通常有乳化-溶剂蒸发法、乳化-溶剂扩散法、聚合法、薄膜-超声法、高压乳匀法等等[4]，可根据药物性质选择不同的制备方法，通常采用药物粒径大小、包封率、回收率、载药量等指标来对纳米粒的制备工艺进行评价。本文根据实验室条件并参考相关文献[5]，采用改良的乳化溶剂扩散法来制备载药纳米粒，考察了泊洛沙姆P188量、载体材料量、温度、搅拌时间、油水比例等因素对纳米粒制备的影响，以粒径、回收率、包封率、载药量等作为综合指标，通过均匀设计法优化纳米粒制备工艺，确定了最佳处方。

§1.1 实验材料 1.试剂及药品

环孢素A（福建科瑞药业有限公司，批号 060801 ，纯度99.3%）；Eudragit L100(德国R?hm 公司)；泊洛沙姆188 (Poloxamer 188，P188，沈阳药大集琦药业有限责任公司)；无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈及甲醇均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；水系蒸馏水 2.主要仪器

DF-101S集热式恒温磁力搅拌器（巩义市英屿华中仪器厂）；W370-1红外快速干燥箱（巩义市英屿华中仪器厂）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LG-5真空冷冻干燥机（上海市离心机械研究所）；PB203-N电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Optima Max 超速冷冻离心机(贝克曼库尔特有限公司)；Zetasizer HPPS激光粒度分布仪（英国马尔文仪器有限公司）；H600型透射电镜（日立公司）； LC-10A高效液相色谱(日本岛津)

医学统计学程序（PEMS）程序：由四川大学医学院统计学教研室编制

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§1.2 方法与结果

一、环孢素A体外含量测定方法的建立 1. 色谱条件

参照有关文献的HPLC法[5-17]，改进后用于本实验中CyA的含量测定。 色谱柱：phenomenex (luna 5μ C18 (2)，100R,250×4.6mm，5 micron，广州菲罗门公司)

流动相：乙腈:甲醇:水=80:10:10(v:v:v) 流速：1.0 mL/min 柱温：70 ℃ 检测波长：210nm 进样量：20μL 2. 线性关系的考察 2.1 标准母液的配制

精密称取环孢素A原料药10.27mg于100mL容量瓶中，用甲醇定容，配成102.7μg/mL的标准母液备用，-4℃冰箱储存。 2.2 标准曲线的绘制

精密吸取CyA标准母液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL、8.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成不同浓度的系列标准液，取20μL进样，记录药物峰面积，数据见表1-1。

表1-1 CyA的浓度及峰面积

Tab 1-1 The calibration of CyA (μg/mL)

Conc 1.027 2.054 4.108 8.216 10.270 20.540 30.810 41.080 51.350 61.620 102.700 A 31360 64985 131689 255759 325821 660962 1035566 1326230 1680831 2042330 3486188

以峰面积（y）对浓度（x）作回归，得到线性方程为：y =33765x－20740，r=0.9997。线性范围：1.027~102.7μg/mL，标准曲线图见图1-1。

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4000000350000030000002500000200000015000001000000500000002040Conc6080100A

图1-1 CyA标准曲线 Fig 1-1 Standard Curve of CyA

3. 回收率实验

取空白纳米粒适量于10mL容量瓶中，按照标准曲线项操作配制4.108、20.54、51.35μg/mL低、中、高三种浓度的溶液，进样20μL，测定回收率，结果见表1-2。

表1-2 CyA 回收率结果(n=3)

Tab 1-2 The result of the recovery of CyA (n=3) Conc. added (μg/mL)

4.108 20.54 51.35

Conc. determined (μg/mL) 4.514±0.009 20.190±0.279 50.395±0.404

Mean recovery (%) 109.893 98.294 98.139

RSD (%) 0.206 1.382 0.801

4. 精密度实验

取空白纳米粒适量于10mL容量瓶中，按标准曲线项制备4.108、20.54、51.35μg/mL三种浓度的溶液，于一天内连续进样3次，计算日内精密度（n=3），并且连续三天进样(n=3)，计算日间精密度，数据见表1-3。

表1-3 方法精密度(n=3)

Tab 1-3 Precision of the method (n=3) Conc (μg/mL) 4.108 20.54 51.35

Within-run Conc(μg/mL)±SD 4.619±0.026 20.460±0.257 51.102±0.322

RSD (%) 0.559

1.258 0.631

4

Between-run Conc(μg/mL)±SD 4.876±0.081 21.116±0.181 52.227±0.736

RSD (%) 1.651

0.856 1.410

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5. 最小检出量的测定

按峰高为基线噪音的3倍计算，CyA最低检出量为30ng。 6. 色谱方法专一性的考察

取空白纳米粒适量用甲醇超声溶解，样品离心后进样，其色谱图见图1-2，与CyA标准液的色谱图（图1-3）作比较。由图可知，环孢素A峰面积的保留时间为7.5min左右，空白纳米粒在相应位置无吸收峰出现，即载体材料和辅料不影响药物的测定。

图1-2 空白纳米粒HPLC色谱图

Fig1-2 HPLC chromatogram of blank nanoparticle

图1-3 CyA标准品HPLC色谱图

Fig1-3 HPLC chromatogram of CyA standard

7. 样品的测定方法 7.1 纳米粒总药量的测定

精密吸取环孢素A纳米粒0.5mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，取20μL进样，记录CyA的峰面积，同时精密称取CyA对照品配制成约50μg/mL的溶液作为外标，同法测定其中CyA的峰面积。 7.2 纳米粒包封率的测定

取纳米粒胶体溶液适量，经0.45μm微孔滤膜除去不溶的载体材料和析出的CyA微晶，取续滤液在10℃，离心力为25000×g条件下超速离心2h，分离上

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清液。进样20μL，HPLC法测定上清液中CyA的含量。 7.3 回收率、包封率、载药量的计算方法

回收率(%)=

c1?v?100% wc包封率(%)=

?c1?c2??v?100%

c1?v载药量(%)=

?c1?c2??vwz?100%

式中c1：纳米粒胶体续滤液中CyA的浓度；c2：上清液中游离CyA的浓度；v：续滤液体积；wc：CyA理论投药量；wz：载体材料理论投药量。 二、环孢素A纳米粒(CyA-L100-NP)制备工艺优化 1. 处方前药物环孢素A理化性质的研究[18] ? 分子式及分子量：C62H111N11O12；M=1202.63 ? 分子结构：

? 性状：为白色或类白色粉末；无臭。

? 溶解性：在甲醇、乙醇或乙腈中极易溶解，在乙酸乙酯中易溶，在丙酮或

乙醚中溶解，在水中几乎不溶，37℃时溶解度为1.73μg/mL（实验值）。 ? 油水分配系数：lgP=2.92（文献值）[19] ? 稳定性：避光保存。

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2. 单因素考察

2.1 乳化剂泊洛沙姆的含量

文献[5]报道，20～30℃的泊洛沙姆188水溶液中CyA的溶解度小于在纯水中的溶解度，因此本文在纳米粒的制备方法中应用泊洛沙姆188作为表面活性剂具有重要意义，不仅可以降低纳米粒的表面张力，增加其在胶体溶液中的稳定性，还具有提高CyA包封率的作用。实验中发现泊洛沙姆188的含量为0.1%-0.7%时，较为适宜，过大或过小均不利于纳米粒的形成。 2.2 载体材料的含量

在实验中固定药物的总量，预实验发现，随着载体量的增大，溶液的乳光越强，当载体在200～500mg范围内粒径分布均匀，纳米粒载药量大。 2.3 搅拌速度

通过预实验发现搅拌速度对粒径有一定影响，速度过小或过大，形成的纳米粒分布不均，固定搅拌速度在300～900r/min。 2.4 挥发时间

挥发时间过长，纳米粒粒径显著增大，胶体溶液颜色变深。时间过短，乙醇挥发不完全，实验中将其范围固定在3-6h。 2.5 温度

水浴温度过高，纳米粒粒径显著变大，溶液由浅蓝色变成乳白色，温度过低则不利于乙醇的挥发。预实验表明水浴温度在30～65℃为宜。 2.6油相与水相比例

油/水比例在1: 5－4: 5下形成的纳米粒数量多，粒径大小呈现正态分布。 2.7其他因素的影响

实验中还对注射器针头大小，注射速度进行了考察，发现注射针头越小，注射速度越快越匀速，所得纳米粒粒径越小，分布越均匀。 3. 环孢素A纳米粒(CyA-L100-NP)的制备方法

称取适量的药物环孢素A和载体材料Eugdragit L100于50mL小烧杯中，用无水乙醇溶解构成有机相，取泊洛沙姆P188适量溶解于水中构成水相。在室温条件下，将有机相快速注入以恒定速率搅拌的水相中，注射完毕，继续搅拌10min，然后转移至水浴中挥发乙醇，所得溶液即为CyA-L100-NP胶体溶液。

7

苏州大学硕士学位论文 第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺

4. 均匀设计实验及处方的优化 4.1 均匀设计

根据预实验及单因素实验，确定影响CyA-L100-NP粒径及包封率等的主要因素有六个，分别为乳化剂泊洛沙姆P188的含量（X1），载体材料的含量（X2），搅拌速度（X3），挥发时间（X4），温度（X5），油水比例（X6）。按照均匀设计原理选择U7（76）均匀设计表安排实验，具体见下表Tab1-4, Tab 1-5。

表1-4 因素与水平

Tab1-4 Factors and levels

Factors

1

X1(%) X2(mg) X3(rpm) X4(h) X5(℃) X6(O:W,v:v)

表1-5 均匀设计U7(76)表 Tab1-5 Uniform design U7(76) No. 1 2 3 4 5 6 7

A 125 188 250 313 375 438 500

B 250 350 450 200 300 400 500

factors C 500 800 400 700 300 600 900

D 4.5 3 5 3.5 5.5 4 6

E 55 45 35 60 50 40 65

F 87.5:125 75:125 62.5:125 50:125 37.5:125 25:125 100:125

0.1 350 350 3 35 1:5

2 0.2 400 400 3.5 40 1.5:5

3 0.3 450 450 4 45 2: 5

Levels 4 0.4 500 500 4.5 50 2.5:5

5 0.5 550 550 5 55 3:5

6 0.6 600 600 5.5 60 3.5:5

7 0.7 650 650 6 65 4:5

4.2结果评价

以不同处方所得粒径，主峰百分比，回收率，包封率和载药量五个指标进行综合评分，采用多指标公式评分法处理数据。评分标准：总分为100分，粒径指标权重为0.4，以40nm为满分，小于40nm的均为满分,大于40nm的,每比40nm多20nm,相应减去1分；主峰百分比权重为0.1，以100%为满分；回收率权重为0.2，以100%为满分；包封率权重为0.2，以100%为满分；载药量权重为0.1，以20%为满分。综合得分见表1-6。

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苏州大学硕士学位论文 第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺

表1-6 综合评分 Tab1-6 Comprehend score

Formula NO.

Mean Percentage partical size of main (nm) peak

(%) 214.93 93.82 71.68 39.81 46.21 61.19 626.9

97.33 100 99.33 86.33 95.33 80.67 67.67

Yield (%)

Entrapped efficiency (%) 99.54 98.67 98.61 98.56 99.48 99.24 99.64

Loading (%)

Comprehend

score

1 2 3 4 5 6 7

91.18 92.8 93.9 74.42 89.16 86.16 73.17 18.24 13.26 10.43 18.60 14.86 10.77 7.32 88.25 92.23 92.07 92.53 94.38 89.47 55.64

4.3 数据处理

将上述数据代入医学统计学程序（PEMS）程序作回归，得到下列线性方程：

Y=134.6339-89.1335X1-10.1676X6

复相关系数R=0.994，剩余标准差S=1.686，回归方差与剩余方差之比为F0=169.329，F0.05(2,4)=8.944272，方程显著,优化结果为：X1=0.1%；X6=1:5，其它因素无明显影响。 4.4最佳处方

根据试验条件和计算机软件统计结论，结合粒径和外观形态，并通过对其余因素的进一步比较，最后确定最佳的处方工艺为：F68：125mg；载体量：300mg；搅拌时间：3.0h；温度：60℃；搅拌速度：400rpm；油相：水相＝1: 5（v/v）。 4.5 验证实验

将最佳处方重复三份，结果见表1-7。由表可知，处方重复稳定，所得纳米粒粒径小，包封率高，达到了优化的目的。

表1-7 重复最佳处方

Tab 1-7 Repeat of the best formula

No.

Mean Percentage partical size of main (nm) peak

(%) 39.18 39.99 40.08 39.75?0.50

100 100 100 100

Yield

(%) Entrapped efficiency

(%)

Loading (%) Comprehend

score

1 2 3 ?x?SD

90.01 92.55 94.08 92.21?2.06

99.62 99.56 99.54 99.57?0.04

15.00 15.42 15.68 15.37?0.34

95.43 96.14 96.56 96.04?0.57

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苏州大学硕士学位论文 第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺

三、环孢素A纳米粒的理化性质 1. 环孢素A纳米粒的形态特征

取新鲜制备的纳米粒胶体溶液1滴置于覆有支撑膜的铜网上，固定 2～3分钟后用滤纸小片从铜网边缘吸干多余的液体，经2%的磷钨酸液染色2～3分钟，吸干多余染液，自然干燥，置于透射电镜下观察其形态，见图1-4。

图1-4 CyA-L100-NP电镜照片(×40,000)

Fig1-4 The Microscope photograph of CyA-L100-NP (×40,000)

2. 环孢素A粒径大小及分布

取上述纳米粒,用适量蒸馏水稀释后，用Zetasizer 3000HS动态激光粒度分析仪测定其粒径及分布，结果见图1-5。

图1-5 CyA-L100-NP粒径统计学分布

Fig 1-5 Size distribution by statistics of CyA-L100-NP

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苏州大学硕士学位论文 第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺

3. X衍射图

对CyA（A）、Eudragit L100和P188的物理混匀物（B）、Eudragit L100、P188和药物的物理混匀物（C）及CyA-L100-NP（D）进行X衍射。条件为：Cu靶/石墨单色器,电压30kV,电流20mA,扫描速度0.1°/s,采样时间1s,扫描范围4.8-50℃，X衍射图见图1-6。

图1-6X-衍射图：(A) CyA； (B) Eudragit L100和P188的物理混匀物；(C) Eudragit L100、

P188和药物的物理混匀物；(D) CyA-L100-NP

Fig 1-6 X-ray diffraction of (A) CyA； (B) physical mixture of Eudragit L100 and P188； (C)

physical mixture of CyA,P188,Eudragit L100；(D) CyA-L100-NP

§1.3 讨论与小结

1. 国内外文献报道环孢素A的柱效与温度呈正比,在常温下测定峰形较钝,柱效低,随着温度的升高柱效逐渐上升,一般测定温度在70-75℃之间。本文采用70℃柱温来测定环孢素A，理论塔板数＞1000。文献报道的流动相通常有二元,三元流动相,本文尝试了流动相①甲醇:水(85:15),②乙腈:水(80:20),③乙腈:甲醇:水=80:10:10,在流速为1.0ml/min时,流动相③药物保留时间最短,柱效最高,有利于节约时间及试剂。

2. 包封率的测定方法主要有透析法,超滤法,离心法等,本文尝试了超滤法,发现超滤板对药物有很强的阻滞作用,游离药物不易透过。因而采用离心法。按文献

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苏州大学硕士学位论文 第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺

方法[5]纳米粒仅分层，界面模糊。实际实验中发现在离心力为250000×g条件下离心2h，纳米粒和药物达到了较佳分离。

3. 制备纳米粒的方法有乳化-溶剂蒸发法、乳化-溶剂扩散法、聚合法、薄膜-超声法、高压乳匀法等等。本文参考相关文献，采用改良的乳化溶剂扩散法来制备纳米粒，所得纳米粒其平均粒径可控制在约40nm，且操作简单，重现性好，适用于脂溶性药物制备纳米粒。

4. 由于纳米粒的质量涉及其包封率，载药量，收率以及粒径大小和分布等多种指标，均匀试验设计筛选出多因素多水平的处方工艺时，根据纳米粒的质量控制要求采用多指标综合评分，即按照每项指标对质量控制体系的贡献大小进行分级，并确定分值。同一因素中数值最大者为满分，其它因素以最大值之比进行评分，因此所得指标的分值及总分均具有客观性。均匀设计得出的最佳因素。 §1.4总结

本文建立的环孢素A体外分析方法可以快速准确测定纳米粒胶体溶液中环孢素A的含量，采用改良的乳化溶剂扩散法并通过均匀设计来优化的所制备的纳米粒粒径在40nm左右，回收率大于90%，包封率高达99.6%，载药量约为15.37%，结果较好。通过电镜照片可知，纳米粒粒子小，呈圆形或椭圆形，分布均匀。由X-衍射图可知环孢素A被包裹于纳米粒中，不再显示药物峰。

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苏州大学硕士学位论文 第二章 环孢素A纳米粒稳定性及冻干工艺的初步研究

第二章 环孢素A纳米粒稳定性及冻干工艺

的初步研究

纳米粒系统属于高度分散的胶体体系，具有较大的表面自由能，在水溶液中长期贮存易出现聚集和粒径增大的现象，为了提高纳米粒的贮存稳定性，常用冷冻干燥技术对纳米粒混悬液进行干燥得到固体冻干品。本文考察了温度对纳米粒溶液贮存稳定性的影响并初步研究了纳米粒冻干工艺。

§2.1实验材料与仪器 1.材料

CyA-L100-NP纳米粒溶液（自制）；乙腈、甲醇均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；水系三蒸水；无水乙醇，海藻糖，葡萄糖，甘露醇，山梨醇，蔗糖，乳糖均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。 2.仪器

Vivaflow超滤机(satoris,德国) ；PB203-N电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SHZ-82 恒温震荡器（金坛市福华仪器有限公司）；85-2A恒温磁力搅拌器（金坛市福华仪器有限公司）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Zetasizer 3000HS激光粒度分析仪（马尔文，英国）；Optima Max 超速冷冻离心机(贝克曼库尔特有限公司)；LG-5真空冷冻干燥机（上海市离心机械研究所）；LC-10A高效液相色谱(日本岛津）；YG120药物光照实验箱（上海恒谊制药有限公司）

§2.2 方法与结果

一、环孢素A纳米粒溶液稳定性实验[20]

制备了三个批号的环孢素A纳米粒溶液，将其分装于西林瓶中，密封，分别置于4℃冰箱，25℃室温下以及40℃恒温烘箱中，于0，0.5，1，1.5，2月各取出样品测定其粒径,含量及包封率，观察温度对纳米粒贮存稳定性的影响，采用spss统计软件处理数据，结果见表2-1至表2-3。

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苏州大学硕士学位论文 第二章 环孢素A纳米粒稳定性及冻干工艺的初步研究

表2-1 纳米粒溶液的粒径

Tab 2-1 The particle size of CyA-L100-NP solution

Time (month) 0 0.5 1 1.5 2 *: P＜0.05；**:P＜0.01

表2-2 纳米粒溶液的含量

Tab 2-2 The concentration of CyA-L100-NP solution

Time (month)

0

Concentration（μg/mL）

NO.

4℃ 1178.59 986.66 1104.57 1192.44 978.50 1091.22 1212.20 1020.52 1121.51 1163.41 960.40 1094.69 1114.60 918.04 1042.73

25℃ 1178.59 986.66 1104.57 1178.83 932.27 1129.77 1224.00 997.09 1154.44 1281.67 970.48 1115.79 1111.22 916.98 1003.56

40℃ 1178.59 986.66 1104.57 1048.35 993.71 1154.64 1172.83 1011.86 1149.76 1166.53 967.19 1138.60 1057.65 877.89 1000.89

Particle size(nm)

NO. 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 4℃ 46.3 43.72 43.05 50.85 38.33 40.61 45.74 41.82 51.18 46.64 39.40 49.48 52.31 48.21 55.89 25℃ 46.3 43.72 43.05 40.87 38.13 51.64 43.55 38.61 52.73 49.61 50.73 46.07 52.02 50.32 52.27 40℃ 46.3 43.72 43.05 42.63 37.15 41.23 58.54* 51.77 47.55 63.09** 58.77 57.41 75.69** 64.35 67.05

0.5

1 1.5 2

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

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表2-3 纳米粒溶液的包封率

Tab 2-3 The drug envelopment rate of CyA-L100-NP

Time (month) 0 0.5 1 1.5 2 Drug envelopment rate（%）

NO. 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 4℃ 99.66 99.54 99.57 99.60 99.47 99.52 99.56 99.51 99.52 99.56 99.43 99.51 99.48 99.49 99.63 25℃ 99.66 99.54 99.57 99.67 99.52 99.61 99.63 99.49 99.52 99.59 99.45 99.57 97.78 99.47 99.60 40℃ 99.66 99.54 99.57 99.63 99.57 99.68 99.64 99.51 99.57 99.62 99.48 99.56 98.93 99.46 99.61 二、环孢素A纳米粒冻干工艺的初步研究 1.冷冻干燥简介[21]

冷冻干燥方法（freeze-drying）是指将含有大量水分的物质，预先进行降温冻结成冰点以下的固体，然后在真空条件下使水分子直接升华出来，并用冷凝方法捕获升华的水气，使物质干燥脱水。冷冻干燥可以避免药物受热分解，产品质地疏松，加水后能迅速溶解，稳定性好，有利于贮存。

冷冻干燥一般分三步进行。即预冻、升华干燥（或称第一阶段干燥）、解析干燥（或称第二阶段干燥）。样品溶液首先进行预冷冻，目的是将样品中的自由水固化，便于在真空下进行升华，在冰晶体升华干燥过程中，物质的重要组分被保留并成形，因此干品的形状和冷冻态的湿体形状是基本一致的。同时，由于干燥过程是在低温条件下进行的，药物受破坏的程度及挥发性组分的损失最小。升华干燥阶段是药物制品冷冻干燥的关键阶段。在升华干燥的过程中，随着升华的进行，水分和能量同时减少，保持制品一定的升华速度要供给热量，使其处于―匀速升华‖的干燥状态。但此热量必须加以控制，不能因加热而增加制品的温度，致使形成制品的局部熔融或液化，影响外观质量。在一次干燥过程结束后，还有

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苏州大学硕士学位论文 第二章 环孢素A纳米粒稳定性及冻干工艺的初步研究

约10 %未被冻结的水未排除，当达到一定含量就为微生物的生长繁殖和某些化学反应提供了条件。二次干燥的目的是进一步去除制品中低温的、一次干燥中尚没能随着冰晶体升华的那部分水分，改善产品的贮存稳定性，延长其保存期。 2.纳米粒冻干工艺研究[22-23] 2.1纳米粒溶液的浓缩

取自制的纳米粒溶液若干，采用超滤法（截留分子量30,000）进一步浓缩至原来体积的30%，得纳米粒胶体浓缩溶液备用。 2.2.冻干保护剂的粗筛选

纳米粒在冷冻干燥过程中容易受到破坏和聚集，冻干保护剂对纳米粒有一定保护作用，而其种类与浓度对纳米粒粒径的稳定性各不相同，因此需要选择合适种类及浓度的冻干保护剂作为纳米粒溶液的支撑剂和保护剂。 2.2.1不同保护剂的冻融实验

以海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇和乳糖为冻干保护剂，各取0.2、0.4 和0.6g，加至8mL上述超滤所得的纳米粒胶体溶液中，加水至10mL，混匀，将其置于25℃，以100r/min速度振荡的恒温震荡箱器，振荡若干时间，加速保护剂的溶解并使纳米粒和保护剂混合均匀。取适量装于10mL安瓿中，置－70℃冰箱预冻12h后，转移至30℃水浴中融化，重复冻融3 次。另取未加冻干保护剂的纳米粒胶体溶液同法操作。与新鲜制备的纳米粒溶液进行比较。以纳米粒的外观和粒径变化为评价指标，考察不同保护剂的保护作用。各指标采用10分制，以得分最高者为好，给分标准以及冻融结果分别见表2-4，2-5。

表2-4 给分标准

Tab 2-4 Standard of score

Score 0-1 2-4 5-8 9-10

）

Aggregation1

）Opalescence2

）

Average particle size

(nm)

＞300 100～300 60～100 ＜60

）

PDI value ＞0.4 0.3～0.4 0.1～0.3 ＜0.1

3 2 1 0 - + ++ +++

注：10、1、2、3分别表示目测无聚集、少量聚集、显著聚集及沉淀不溶；2+++、++、+、- 分别表示乳光强烈、乳光较弱、乳光微弱、几无乳光，下表同。

））

Note: 10,1,2,3 means no aggregation, small aggregation, large aggregation and sediment; 2+++,++,+,- means significant opalescence, poor opalescence, tenuity opalescence and no opalescence, similar to the following tables.

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表2-5 不同冻干保护剂冻融结果（n=3）

Tab 2-5 The result of freeze-thawing of different cryoprotectants（n=3） Sample Initial CyA-L100-NP

Aggregation Opalescence

— — 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Average particle size (nm) 42.9 ±4.2 47.04 ±4.3 46.4 47.2 63.2 70.7 64.4 54.5 52.2 54.6 49.3 40.9 42.8 46.1 48.1 47.3 55.8 42.5 51.6 44.4

PDI value 0.075 ±0.010 0.242 ±0.068 0.079 0.098 0.240 0.187 0.155 0.088 0.173 0.229 0.202 0.083 0.095 0.132 0.195 0.037 0.201 0.073 0.193 0.120

Sore — — 40 40 33 34 35 39 36 35 36 40 40 38 37 40 35 40 36 38

Without cryoprotectants

sucrose lactose mannitol sorbitol glucose trehalose

2% 4% 6% 2% 4% 6% 2% 4% 6% 2% 4% 6% 2% 4% 6% 2% 4% 6%

由上表可以直观看出，上述保护剂对纳米粒均能起到保护作用而相互之间没有显著性差异。

2.2.2不同保护剂的冻干实验

取上述已添加保护剂的纳米粒2ml于称量瓶中（n=3），置－70℃冷冻12h后，置真空冷冻干燥机内冷冻干燥24h，得纳米粒冻干品。将冻干品添加水复溶，以纳米粒的外观和粒径变化为评价指标,根据上述给分标准打分，结果见表2-6。

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表2-6不同冻干保护剂冻干结果（n=3）

Tab 2-6 The result of freeze-drying of different cryoprotectants（n=3） Sample

Initial CyA-L100-NP Without cryoprotectants

2% sucrose 4%

6%

2% lactose 4%

6%

2% mannitol 4%

6%

2% sorbitol 4%

6%

2% glucose 4%

6%

trehalose

2% 4% 6%

Aggregation Opalescence

— 3 1 1 2 1 1 2 3 3 3 2 3 3 2 2 3 2 2 2

+++ - +++ ++ + +++ +++ ++ - + - + + - ++ + - + + +

Average particle size (nm)

PDI value

Sore — — 33 29 24 31 29 29 0 1 0 18 7 4 21 19 6 8 16 15

42.9±4.2 0.0746±0.010 2609.5±613.1 1.000±0.000 54.0±0.3 0.141±0.033 67.6±2.5 0.155±0.037 113.3±7.5 0.243±0.023 75.2±20.7 0.181±0.103 81.9±4.5 0.205±0.010 64.6±0.45 0.157±0.017 1633.5±272.2 1.000±0.000 2956.5±335.9 1.000±0.000 3204±685.9 0.804±0.278 136.4±13.7 0.248±0.006 191.4±76.3 0.309±0.111 167.3±94.9 0.408±0.010 81.7±7.1 0.183±0.054 82.3±28.7 0.257±0.145 193.4±38.7 379.8±235.3 126.2±12.2 157.5±18.6

0.357±0.130 0.507±0.148 0.306±0.051 0.311±0.081

2.3乳糖和蔗糖冻干保护剂浓度的筛选

通过上述结果可知，以蔗糖和乳糖为冻干保护剂对纳米粒的保护作用比较理想，得分较高，复溶后的纳米粒乳光强，粒径变化相对较小。对其进行进一步筛选，分别取蔗糖0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5g，取乳糖0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0g，按照2.2.2项方法操作，结果见下表2-7。

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表 2-7不同浓度的蔗糖和乳糖冻干试验结果（n=3）

Tab2-7 The result of freeze-drying test of different concentration of sucrose and lactose Sample

Initial CyA-L100-NP Without cryoprotectants sucrose 2% 3% 4% 5%

6%

Lactose

8% 10% 12% 15% 2% 3% 4% 5% 6% 8% 10%

Aggregation Opalescence

0 3 1 1 1 2 2 3 3 3 3 0 1 1 2 2 3 3 +++ - ++ + + + + - + - - +++ +++ +++ ++ + - - Average particle size (nm) 39.4 125.5±26.4 103.7±12.9 147.3±47.4 149.4±13.7 189.7±42.9 174.9±31.6 152.9±10.6 162.7±15.0 190.9±32.2 238.7±107.1 103.2±9.7 98.6±7.3 91.9±2.4 111.7±7.4 118.9±11.0 131.9±26.0 201.3±18.1 PDI

value 0.053 0.262±0.238 0.314±0.076 0.240±0.031 0.332±0.044 0.356±0.092 0.35±0.145 0.323±0.061 0.365±0.099 0.309±0.057 0.483±0.154 0.267±0.105 0.277±0.022 0.244±0.007 0.327±0.078 0.363±0.0298 0.374±0.089 0.449±0.091

Sore － － 22 21 17 14 14 7 9 7 1 29 27 28 19 16 6 3 结果表明， 2%、3%、4%的乳糖得分较高，以其为冻干保护剂的纳米粒冻干品复水化后粒径与冻干前差异相对最小，乳光强。保护剂浓度越高，得分越低，说明蔗糖及高浓度的乳糖在冻干过程中不如低浓度的乳糖效果好。 2.4 低浓度乳糖冻干保护剂的进一步筛选

分别以乳糖0.2、0.3、0.4g为冻干保护剂，按照2.2.2项方法操作，结果见下表2-8。

表2-8 低浓度乳糖为冻干保护剂的冻干结果 （n=5）

Tab2-8 The result of freeze-drying test of low degree of lactose as cryoprotectants Sample Initial CyA-L100-NP

2% 3% 4%

19

Aggregation Opalescence

3 0 1 1

- +++ +++ ++

Average particle size (nm) 125.5±26.4 91.8±15.1 95.9±24.1 91.0±12.2

PDI value 0.262±0.238 0.314±0.057 0.321±0.094 0.307±0.055

Sore 29 26 23

苏州大学硕士学位论文 第二章 环孢素A纳米粒稳定性及冻干工艺的初步研究

结果表明，低浓度乳糖保护剂效果都比较好，以2%乳糖为冻干保护剂的冻干效果最为理想。 2.5 冻干工艺的初步建立 2.5.1 冻干曲线的绘制

记录各个时间点样品温度、搁板温度以及真空度，绘制冻干曲线，见下图2-1。

temperature(℃)vacuumdegree(Pa)302520151050-50-10-15time(h)3025201510481216202450 ABCD图2-1 CsA-L100-NP冻干曲线

A：板层温度；B：样品温度；C：冷阱真空度；D：工作室真空度

Fig 2-1 Freeze-drying curve of CsA-L100-NP

A：Temperature of the layers ；B：Temperature of the sample ；C：Vacuum degree of the ice trap ；

D：Vacuum of the work room

2.5.2 重现性实验

以2%乳糖为冻干保护剂，添加至浓缩的CyA-L100-NP溶液中，按照2.2.2项操作（n=5）,结果见下表2-9。

20

苏州大学硕士学位论文 第二章 环孢素A纳米粒稳定性及冻干工艺的初步研究

表2-9 冻干纳米粒水复溶结果

Tab 2-9 The result of lyophilized CyA-L100-NP after dissolved by water NO. 1 2 3 4 5 Average

Aggregation Opalescence

1 0 1 1 0

++ +++ +++ ++ +++

Average particle size (nm) 93.43 87.87 94.37 110.7 92.84 95.84±8.68

PDI

value 0.211 0.272 0.361 0.328 0.359 0.306±0.064

Sore 25 31 24 22 28 26±3.54

2.5.3冻干品的粒径分布图

取上述冻干好的纳米粒,用适量蒸馏水复溶后,用Zetasizer 3000HS动态激光粒度分析仪测定其粒径及分布，结果见图2-2及2-3。

图2-2 冻干纳米粒的粒径分布

Fig 2-2 Size distribution of freeze-drying CyA-L100-NP

21

苏州大学硕士学位论文 第二章 环孢素A纳米粒稳定性及冻干工艺的初步研究

图2-3 冻干纳米粒的粒径统计学分布

Fig2-3 Size distribution by statistics of freeze-drying CyA-L100-NP

§2.3讨论与小结

1.纳米粒溶液中粒子高度分散，具有较高表面自由能，属于热力学和动力学不稳定体系。在长期贮存过程中容易引起聚集沉淀。本文稳定性实验发现纳米粒溶液于40℃下放置一个月后粒径显著变化，并且随着时间的增加粒径越来越增大，其含量和包封率在两个月时间内没有显著变化，提示纳米粒溶液应在低温下保存。实验表明纳米粒溶液可以在4℃和25℃条件下稳定放置两个月，粒径、含量和包封率均没有显著变化。

2.为了提高纳米粒贮存稳定性，采用真空冷冻干燥法制备纳米粒冻干固体。在冷冻干燥过程中，冰晶的形成与生长以及升华均会破坏纳米粒，因而需要选择合适的支架剂来保护纳米粒。冻干保护剂多为多羟基糖类或多元醇类物质。多羟基类化合物在冷冻过程中能与水形成低共熔混合物或玻璃态物质，能抑制冰晶的生长，使冰晶以无定形或微晶的状态存在，从而降低了其对纳米粒的挤压和机械损伤作用。同时还可以降低由于冰晶形成所致的浓度局部增大。此外，还可通过羟基与纳米粒表面集团形成氢键，从而在脱水过程中代替水的作用，抑制纳米粒的聚集。冻干保护剂还可在干燥过程中起到支撑剂的作用，避免纳米粒的相互聚集。本文对纳米粒冻干工艺进行初步研究，最终选择2%的乳糖作为冻干保护剂。冻干后的纳米粒呈多孔白色絮状物，吸湿性强，可复溶为具有乳光的纳米粒溶液，平均粒径可＜100nm，但与冻干前相比，粒径显著增加，

22

苏州大学硕士学位论文 第二章 环孢素A纳米粒稳定性及冻干工艺的初步研究

结果不太理想。因此，还需对冻干保护剂和冻干品制备工艺作进一步研究。 §2.4 总结

本文采用HPLC法测定了纳米粒溶液中CyA的含量，超速离心法测定其包封率，考察了温度对纳米粒稳定性的影响，结果表明纳米粒溶液在40℃下不稳定，放置一个月后，粒径显著增大，在4℃及25℃稳定。本文初步探讨了纳米粒真空冷冻干燥工艺，以2%的乳糖为保护，-70℃冰箱预冻12h后于真空冷冻干燥机内干燥24h，得到纳米粒冻干品，加水可复溶为100nm左右的纳米粒溶液。

23

苏州大学硕士学位论文 第三章 环孢素A纳米粒体外释放实验

第三章 环孢素A纳米粒体外释放实验

对纳米粒体外释放药物规律的研究，有助于了解其释药机理和体内释药行为，为药物在体内的吸收提供一定的理论依据。本文以新山地明作为参比制剂，以自制纳米粒溶液为制剂组，考察两种制剂在不同PH值条件下的体外释药情况。

§3.1材料和仪器 1.材料

CyA-L100-NP胶体溶液（实验室自制）；新山地明（Lot：S0015A，诺华制药）；环孢素A（福建科瑞药业有限公司，批号 060801，纯度99.3%）；无水乙醇、磷酸二氢纳、磷酸氢二钠、磷酸、十二烷基硫酸钠、氢氧化钠均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司） 2.仪器

KQ-100DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PB203-N电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；PSH-3TC 数显精密酸度计（上海天达仪器有限公司）；SHZ-82恒温振荡箱（金坛富华仪器有限公司），LC-10AT高效液相色谱仪（日本导津公司）；Optima Max 超速冷冻离心机(贝克曼库尔特有限公司)

§3.2方法与结果

一、 体外释放介质的选择：

环孢素A是由十一个氨基酸组成的环状多肽，难溶于水，为满足体外释放所需的漏槽条件，选择蒸馏水， 40%乙醇-水，0.1% SDS水溶液，0.25% SDS水溶液，0.5% SDS水溶液作为候选释放介质。

称取药物35mg，分别加入到20 mL的各候选释放介质中超声分散，置于37℃恒温振荡器，以100 r/min速度恒温振荡2h，溶液经0.22μm微孔滤膜过滤，HPLC法测定其中药物含量，计算药物溶解度，根据漏槽条件的要求，选择合适的释放

24

苏州大学硕士学位论文 第三章 环孢素A纳米粒体外释放实验

介质。释放介质的溶解度如下表3-1所示。

表3-1 不同释放介质中CyA的溶解度

Tab3-1 Solubility of cycolsporin A in different mediums

NO. 1 2 3 4 5

Dissolution medium water

40% alcohol aqueous solution 0.1%SDS aqueous solution 0.25% SDS aqueous solution 0.5% SDS aqueous solution

Solubility（μg/mL）

1.73 1714.58 410.87 1527.23 1530.56

根据以上的测定结果，并结合药物释放的研究需要，0.1%的SDS水溶液即可满足释放漏槽条件，故最终选0.1%的SDS水溶液为释放介质。 二、纳米粒体外释放实验[24]

精密吸取CyA-L100-NP胶体溶液和Neoral溶液0.2mL（CyA：2.5mg/mL）分别置于25mL的pH为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.8、7.4的磷酸盐缓冲溶液（含0.1%SDS）中，放置于37℃，以100r/min速度振荡的恒温振荡箱中。振荡2h后，取适量释放介质在离心力250000×g，10℃条件下超速离心2h，分取上层清液，进样20?L，HPLC法分别测定上清液中的CyA含量。HPLC方法同第一章环孢素A含量测定方法。计算CyA的释放百分率，结果见下表3-2及图3-1：

表3-2 不同pH值下Neoral 和CyA-L100-NP的释放百分率（n=3）

Tab 3-2 The release rate of Neoral and CyA-L100-NP in different pH value（n=3）

Sample

pH 1.0

pH 2.0

pH 3.0

The release rate(%,mean±SD) pH 4.0

pH 5.0

pH 6.0

pH 6.8

pH 7.4

Neoral 82.12±3.56 92.24±1.05 92.90±1.17 90.70±1.41 96.77±2.28 98.31±0.71 91.67±3.92 93.15±0.96

CyA-L100-NP 49.39±0.42 49.84±0.94 49.90±3.16 54.94±2.11 56.60±2.44 60.60±2.29 64.26±2.08 67.42±0.42

25

苏州大学硕士学位论文 第三章 环孢素A纳米粒体外释放实验

100908070605040302010001234pH56Release rate(%)NeoralCyA-L100-NP78

图3-1 Neoral和CyA-L100-NP在不同pH值缓冲液中的体外释放曲线

Fig 3-1 In vitro drug release profiles from Neoral and CyA-L100-NP in several PBS value

（0.1%SDS）(n=3)

从上述图表，可以看出Neoral 在不同pH值下释放量均在82%以上，差不多完全释放，pH值对其释放几乎没有影响。CyA-L100-NP的释放行为与Neoral不同，在低pH值下，纳米粒释药量几乎不变，释放百分率接近50%，随着pH值的升高，药物释放百分率逐渐增大，当pH≥6.0时，释药量均﹥60%。CyA-L100-NP总体释放量＜68%。与Neoral相比，CyA-L100-NP的释放表现出一定的pH依赖性，高pH值更有利于药物的释放。 §3.3讨论与小结

1. 环孢素A是由十一个氨基酸组成的环状多肽，是水难溶性药物，根据《2005版中国药典》附录XIX D，缓释、控释和迟释制剂释放介质指导原则，对难溶性药物不宜采用有机溶剂，可加少量表面活性剂（如十二烷基硫酸钠等），同时根据溶解度实验结果，最终选择0.1%SDS水溶液为释放介质，使用稀盐酸、磷酸、氢氧化钠和磷酸盐缓冲液来调节不同PH值。

2. 释放介质中若含有十二烷基硫酸钠，那么调节不同PH值所用的磷酸盐只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS(十二烷基硫酸钠)会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。配酸性缓冲液：pH＝1～4，应用磷酸二氢纳；配中性缓冲液：pH＝6～8，可用磷酸二氢纳和磷酸氢二钠两种磷酸盐的混合溶液，同时参照药典附录来配不同PH值的缓冲液，药典上没有的pH值缓冲液，采用pH计来配制。

26

苏州大学硕士学位论文 第三章 环孢素A纳米粒体外释放实验

3. 为了考察纳米粒在胃部存不存在释放，根据胃排空速率，取释放后两小时的时间点。

4. 本文制备纳米粒所使用的材料是丙烯酸树脂Eudragit L100,其为阴离子型聚合物，由甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯按1：1比例共聚而得。该材料溶于乙醇，不溶于水，乙醚，在丙酮中膨胀，它的溶解度与pH值有关，pH阈值在6.0以上。由体外释放实验可知，CyA-L100-NP在不同pH值条件下，药物释放率均＞49%，而载体材料Eudragit L100应该在pH6.0以上的水溶液中才能被溶解，因而，可以推测，药物有很大一部分吸附在纳米粒表面，通过扩散作用溶解于介质中。当pH≥6.0时，达到Eudragit L100的溶解阈值，载体材料逐渐被溶蚀，将内部药物释放出来，由体外释放曲线可知溶蚀速度较慢，在pH为7.4的高pH条件下释放量不超过68%。 §3.4总结

采用超速离心法进行体外释放实验，结果发现CyA-L100-NP体外释放行为与Neoral不同，有一定的pH值依赖性，药物释放率随着pH值的升高而增大。

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苏州大学硕士学位论文 第四章 环孢素A纳米粒小鼠组织分布研究

第四章 环孢素A纳米粒小鼠组织分布研究

纳米粒载药能够避免药物胃肠道的降解，提高药物靶向性，改变药物组织分布，降低药物毒副作用，提高药物生物利用度等。为了研究CyA-L100-NP在体内的吸收与分布情况，本实验以市售新山地明为对照， HPLC法测定小鼠灌胃给予CyA-L100-NP制剂和对照制剂后全血及各组织器官内CyA的含量，计算有关药动学参数，探讨CyA-L100-NP的生物利用度及靶向性。

§4.1实验材料与仪器 1.实验材料

环孢素A（CyA，批号：0608019（N），纯度>99.3%，福建科瑞药业有限公司）；Eudragit L100（德国R?hm 公司 ）；泊洛沙姆188（Poloxamer 188，P188，沈阳药大集琦药业有限责任公司）；新山地明（Sandimmun Neoral,批号：S0015A, 规格25mg/粒，诺华制药有限公司）；环孢素D（CyD,含量大于96.5%，福建科瑞药业有限公司）；乙醚（分析纯，南京化学试剂有限公司）；正己烷（色谱纯，沃凯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；肝素钠（批号：F20070404，国药集团化学试剂有限公司）；浓盐酸（昆山金城试剂厂）；氢氧化钠（中国试剂总厂）；偏重亚硫酸钠（上海凌峰化学试剂有限公司）；水系三蒸水。

2.主要实验仪器

HSC-24A型氮吹仪（HENGAO T＆D）；MS2型涡旋器（德国IKA公司）；低速大容量多管离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）；KA-1000型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器（江苏金坛市环宇科学仪器厂）；SHZ-82型恒温振荡箱（金坛富华仪器有限公司），LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）。 3.实验动物

昆明种小鼠，体重18-24g，♂，苏州大学医学院实验动物中心提供,清洁级[许可证号：SYXK（苏）2007-0035]。

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苏州大学硕士学位论文 第四章 环孢素A纳米粒小鼠组织分布研究

§4.2方法与结果[25-32]

一、RP-HPLC法分析CyA生物样品浓度方法的建立 1.生物样品的处理方法 1.1血及各器官组织预处理

小鼠摘眼球取血于肝素化的离心管中。断颈处死后将各器官（心，肝，脾，肺，肾）取出，称重，于-70℃冰箱中保存。分析时，将血于30℃水浴中孵化5min待测，组织加入10倍量三蒸水，组织匀浆器匀浆。 1.2血样处理方法

精密吸取0.5mL全血于15mL具塞塑料离心管中，加入21.2μg/mL内标液CyD50μL，加入180mmoL/L的盐酸溶液1mL，涡旋1min；加5mL乙醚，密塞，于恒温振荡箱中，100r/min，振荡15min，4000r/min，离心15min；吸取上层有色醚层于另一干净离心管中，加入1%偏重亚硫酸钠溶液2.5mL和95mmoL/L氢氧化钠溶液1mL，密塞，于恒温振荡箱中，100r/min，振荡15min,4000r/min,离心l5min；将无色醚层转移至5mL玻璃离心管中，于40℃水浴中氮气流吹干。残渣加入100μL的重组液（乙腈：水=70：30，v:v），涡旋2min，加入1mL正己烷，涡旋2min，3500r/min,离心10min；弃去上层液，再分别加1mL正己烷和0.5mL正己烷，各重复一次上述操作，最终吸取下层液20μL进样。 1.3组织样品处理方法

精密吸取1mL组织匀浆液于15mL具塞塑料离心管中，处理基本与血样操作相同，但是残渣用1mL正己烷洗涤2次后，再分别用0.5mL正己烷洗涤2次，最终吸取下层清夜20μL进样。 2.色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18 (2)（100R,250×4.6mm,5μ，广州菲罗门科学仪器有限公司)

流动相：乙腈：（甲醇：水）（1：1，v:v）=67：33（v:v） 流速：1.3mL/min 检测波长：210nm 柱温度：70℃ 3.色谱行为

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苏州大学硕士学位论文 第四章 环孢素A纳米粒小鼠组织分布研究

按照―生物样品的处理方法‖项处理各组织样品，进样后约在6.5min和8.1min出现两个色谱峰，其中，6.5min的色谱峰为CyA药物峰，8.1min的色谱峰为CyD内标峰，各组织匀浆液中物质基本不干扰药物CyA和内标CyD的测定，内标与各组织样品中CyA达基线分离。样品色谱图见图4-1至图4-6。

mAU40210nm,8nm (1.00)7530mAU210nm,8nm (1.00)/6.592/2762042050102500-10-20-25 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0min

A.空白全血 B.含有CyA和内标CyD的血样

A .blank blood B. blood sample contained CyA and internal standard CyD

图4-1 血液HPLC色谱图

Fig4-1 HPLC Chromatograms of blood

1.02.03.04.05.06.07.08.09.010.0min-300.07060504030mAU210nm,8nm (1.00)403020100mAU210nm8nm (1.00)20-1010-200-30-100.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.0min0.01.02.03.04.05.06.07.08.0min/6.538/162384/8.048/243014/8.125/179636

A .空白心脏 B.含有CyA和内标CyD的心脏样品 A. blank heart B. heart sample contained CyA and internal standard CyD

图4-2 心脏HPLC色谱图

Fig4-2 HPLC Chromatograms of heart

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苏州大学硕士学位论文 第四章 环孢素A纳米粒小鼠组织分布研究

2520151055mAU210nm,8nm (1.00)25201510mAU210nm8nm (1.00)/6.555/11550400-5-5-10-10-150.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min-150.01.02.03.04.05.06.07.08.0min/8.081/54924

A .空白肝脏 B. 含有CyA和内标CyD的肝脏样品 A. blank liver B. liver sample contained CyA and internal standard CyD

图4-3肝脏HPLC色谱图

Fig4-3 HPLC Chromatograms of liver

mAU210nm,8nm (1.00)3040mAU210nm,8nm (1.00)/6.719/39340820301020010-100-20-10-30-20/8.286/1821470.02.55.07.510.012.5min0.01.02.03.04.05.06.07.08.0min

A .空白脾脏 B. 含有CyA和内标CyD的脾脏样品 A. blank spleen B. liver sample contained CyA and internal standard CyD

图4-4脾脏HPLC色谱图

Fig4-4 HPLC Chromatograms of spleen

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mAU210nm,8nm (1.00)2015105706050mAU210nm8nm (1.00)/6.523/2609544030020-5-10-15-20-250.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min100-10-20-300.01.02.03.04.05.06.0/8.029/2293607.08.0min

A .空白肺 B. 含有CyA和内标CyD的肺样品 A. blank lung B. lung sample contained CyA and internal standard CyD

图4-5肺HPLC色谱图

Fig4-5 HPLC Chromatograms of lung

mAU210nm,8nm (1.00)60504030302020101000-10-100.02.55.07.510.012.5min0.01.02.03.04.05.06.07.08.0minmAU60210nm,8nm (1.00)5040/6.671/398435/8.242/170836

A .空白肾 B. 含有CyA和内标CyD的肾样品 A. blank kidney B. kidney sample contained CyA and internal standard CyD

图4-6肾HPLC色谱图

Fig4-6 HPLC Chromatograms of kidney

4. 标准品溶液的配制 4.1 CyD内标母液的配制：

精密称取2.12mgCyD于100ml容量瓶中，甲醇定容，配制成21.2μg/ml的

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苏州大学硕士学位论文 第四章 环孢素A纳米粒小鼠组织分布研究

标准液，-4℃冰箱保存。 4.2 CyA标准母液的配制：

精密称取10.03mgCyA原药于100mL的容量瓶中，甲醇定容，配制成100.3μg/mL 的标准液于-4℃冰箱保存。 4.3 CyA系列工作液的配制：

精密吸取CyA标准母液0.05、0.1、0.5、1、2、4mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容稀释成浓度分别为0.5015、1.003、5.015、10.03、20.06、40.12μg/mL的系列工作液。 4.4 标准曲线的制备

精密吸取空白全血0.5mL，加入CyA系列工作液和CyD内标液各50μL，使成浓度依次为0.05015、0.1003、0.5015、1.003、2.006、4.012μg/mL的血样，或精密吸取空白组织液1mL，加入CyA系列工作液和CyD内标液各50μL，使成浓度依次为0.2508、0.5015、2.508、5.015、10.03、20.06μg/g的组织样品。按照―生物样品的处理方法‖项提取测定药物，以浓度对Ai（CyA与CyD的峰面积之比）作线性回归，得到线性方程，结果见下表4-1。

表4-1 全血及组织中药物的线性范围和线性方程

Tab4-1 The equation of the calibration curve and the liner range of drug in blood and tissues Sample blood heart liver spleen lung kidney

Linear range 0.05015～4.012μg/mL 0.2508～20.06μg/g 0.2508～20.06μg/g 0.2508～20.06μg/g 0.2508～20.06μg/g 0.2508～20.06μg/g

Equation of the calibration curve

Ai=0.8196C+0.0184 Ai=0.1806C-0.0531 Ai=0.2185C-0.055 Ai=0.1747C-0.045 Ai=0.1584 C-0.0239 Ai=0.1551C+0.0037

r 0.9999 0.9992 0.9986 0.9997 0.9991 0.9994

4.5 回收率及精密度实验 4.5.1提取回收率实验 4.5.1.1内标CyD提取回收率

取0.5mL空白全血或者1mL各空白组织匀浆液加入CyD内标溶液50μL，按照―生物样品的处理方法‖项处理样品，进样记录峰面积为A1，同时进样相同浓度未经处理的CyD内标溶液,记录峰面积为A2，按照下列公式计算提取回收率，结果见下表4-2。

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苏州大学硕士学位论文 第四章 环孢素A纳米粒小鼠组织分布研究

提取回收率（%）=

A1?100% A2表4-2 小鼠血及组织中CyD的提取回收率（n=3）

Tab 4-2 The extraction recoveries of CyD from blood and tissues in mice (n=3) Sample blood heart liver spleen lung kidney

1 66.97 97.72 72.86 89.63 96.42 91.51

2 77.98 99.81 73.78 89.47 93.58 90.73

3 81.02 100.8 72.36 92.96 101.8 89.84

Mean (%) 75.32±7.392 99.44±1.572 73.00±0.7203 90.69±1.970 97.27±4.175 90.69±0.8356

RSD (%) 9.814

1.581 0.9867 2.173 4.292 0.9214

4.5.1.2 药物CyA的提取回收率

取0.5mL空白全血或1mL各空白组织匀浆液，加入低、中、高三种浓度CyA标准液，涡旋混合，按照―生物样品的处理方法‖项处理样品，进样记录峰面积，同时进样相同浓度未经处理的CyA标准溶液,记录峰面积，按照提取回收率公式计算提取回收率，结果见下表4-3。

表4-3小鼠血及组织中CyA的提取回收率（n=3）

Tab 4-3 The extraction recoveries of CyA from blood and tissues of mice (n=3) Sample blood heart liver spleen lung kidney

Concentration(μg/mL)

0.5015 1.003 2.006 2.508 5.015 10.03 2.508 5.015 10.03 2.508 5.015 10.03 2.508 5.015 10.03 2.508 5.015 10.03

Recovery (%) 73.19±2.124 77.74±3.401 70.36±1.027 90.82±1.782 108.3±1.485 113.3±2.633 73.00±4.151 60.01±0.524 64.19±7.423 89.25±5.310 95.03±5.897 84.95±1.103 85.75±1.159 93.75±15.14 106.4±4.830 85.14±5.685 81.59±4.561 99.41±5.313

Mean (%)

73.76±3.723 104.1±11.80 65.73±6.631 89.74±5.058 95.30±10.41 88.71±9.432

RSD (%)

5.048 11.33 10.09 5.636 10.91 10.63

4.5.2 方法回收率及精密度实验

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按提取回收率试验方法制备相关浓度的提取样品，进样测定，考察标准曲线的方法回收率及日内、日间精密度，结果见下表4-4。由表4-4可见低、中、高三种浓度不同组织样品的平均回收率在89.67～97.75%之间，方法准确度较高，满足生物样品测定要求。低、中、高三种浓度不同组织匀浆样品的日内RSD＜10%，日间RSD＜15%，亦满足生物样品测定要求。

表4-4 测定小鼠血及组织中CyA的方法回收率和精密度

Tab 4-4 The methodological recovery and precision of CyA from blood and tissues of mice (n=3) Sample

Low level

blood heart liver spleen lung kidney

Recovery(%) Mid level

High level 100.1±4.725 99.89±1.129 97.89±13.76 96.71±8.280 95.59±3.965 95.49±5.718

Mean 97.75

95.43 89.67 97.30 95.94 90.74

92.05±3.251 101.2±3.416 98.07±1.610 88.33±2.121 82.11±0.2993 89.02±12.280 97.23±9.225 97.97±0.1466 99.08±0.7156 93.15±3.455 93.36±4.617 83.38±2.512

Intra-day RSD(%) 3.170

1.725 7.580 1.840 0.8536 4.909

Inter-day RSD(%) 4.750 2.346 13.38 8.566 3.701 5.989

二、小鼠体内药物动力学及组织分布研究 1.样品的配制

1.1 对照组新山地明微乳溶液（Neoral）的配制

取标示量含CyA25mg的新山地明软胶囊3颗于一小烧杯中，用剪刀沿缝隙剪开，加入适量三蒸水稀释，转移至50mL容量瓶中，分次洗涤小烧杯，合并洗涤液转移至容量瓶中，用三蒸水定容（HPLC测定其确切含量）。 1.2 制剂组环孢素A纳米粒溶液（CyA-L100-NP）的配制

按照最佳处方工艺制备3个样品，合并纳米粒溶液，采用VIVA/FLOW50超滤机超滤浓缩至CyA含量与新山地明微乳溶液相同（采用HPLC法定量）。 2.实验方法

2.1 分组及给药方法

取小鼠120只（18-26g，♂），随机分成20组，每组6只，给药前禁食12h，自由饮水，前10组小鼠按25mg/kg的剂量灌胃给予新山地明微乳溶液，后10组小鼠灌胃给予相同剂量的环孢素A纳米粒溶液。 2.2取样方法及取样点的设计

给药后各组分别在0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24h将小鼠摘眼

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球取血，置于1%肝素钠润洗过的1.5mLEP管中，于-70℃冰箱中保存；断颈处死后，取出各只小鼠的心、肝、脾、肺、肾，用三蒸水清洗血渍，并吸干水分，精密称重，于-70℃冰箱中保存。 3.数据处理 3.1含量测定结果

小鼠口服新山地明微乳（Neoral组）和环孢素A纳米粒溶液（CyA-L100-NP组）后取出各时间点样品，按―生物样品的处理方法‖项提取处理后分别进样，测定CyA在小鼠体内的浓度，并对其进行t体检和单因素方差分析，具体结果见表4-5，4-6。并且绘制药物在血液和各组织中的浓度曲线见下图4-7至图4-12。

表4-5 口服新山地明微乳溶液后血及各组织中CyA平均浓度(n=6,x?s) Tab4-5 The mean concentration of CyA in blood and tissues after oral administration of Neoral

(n=6, x?s)

Time (h) 0.25 0.5 1 1.5 2 4 6 8 12 24

表4-6 口服环孢素A纳米粒溶液后血及各组织中CyA平均浓度(n=6,x?s) Tab4-6 The mean concentration of CyA in blood and tissues after oral administration of

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Blood (ug/mL) 1.271 ±0.1228 1.747 ±0.1652 1.607 ±0.4163 1.116 ±0.1621 1.042 ±0.2977 0.7127 ±0.2972 0.6521 ±0.4475 0.5851 ±0.1877 0.2725 ±0.2000 0.1296 ±0.09239

Heart (μg/g) 1.506 ±0.1417 4.204 ±0.1756 6.223 ±0.5073 4.387 ±0.3695 3.835 ±0.2325 3.319 ±0.1972 2.492 ±0.3365 2.330 ±0.1154 1.325 ±0.1061 0.9183 ±0.1728

Liver (μg/g) 6.772 ±0.6206 11.00 ±0.9408 10.63 ±1.5126 5.286 ±0.3676 5.093 ±0.5631 3.984 ±0.2827 3.191 ±0.4013 3.851 ±0.3320 2.272 ±0.1978 1.613 ±0.2090

Spleen (μg/g) 1.992 ±0.4848 5.362 ±0.6591 8.726 ±1.2426 7.921 ±1.200 7.085 ±0.4292 5.752 ±0.4798 4.007 ±0.1696 4.165 ±0.06416 1.927 ±0.2111 1.587 ±0.2996

Lung (μg/g) 2.023 ±0.2075 6.095 ±0.5158 5.703 ±0.6480 3.798 ±0.6791 3.477 ±0.5123 2.944 ±0.2934 2.502 ±0.1955 2.559 ±0.1580 1.232 ±0.09741 0.8903 ±0.04990

Kidney (μg/g) 2.948 ±0.4418 9.891 ±2.183 12.230 ±1.647 8.492 ±0.4111 7.952 ±0.7284 6.564 ±0.3978 4.576 ±0.2475 5.185 ±0.3952 2.796 ±0.1529 2.160 ±0.3454

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CyA-L100-NP (n=6,x?s)

Time (h) 0.25 0.5 1 1.5 2 4 6 8 12 24

Blood (μg/mL) 1.543 ±0.3151 2.274 ±0.3970* 1.842 ±0.2045 1.471 ±0.3386 1.312 ±0.3831 1.215 ±0.2159* 0.8309 ±0.2554 0.6885 ±0.2141 0.3174 ±0.04269 0.1063 ±0.02440

Heart

(μg/g) 1.772 ±0.3745 4.260 ±2.132 6.522 ±0.2919 5.875 ±0.1641* 4.567 ±0.9362 4.040 ±0.3056* 3.105 ±0.1861 2.454 ±0.07555 0.7860 ±0.06155* 0.4685 ±0.02872

Liver

(μg/g) 8.554 ±0.8968* 11.30 ±1.231 10.27 ±0.9062 9.445 ±0.4516* 6.953 ±0.6282* 5.292 ±0.8651* 4.683 ±0.1299* 3.911 ±0.2974 1.526 ±0.09782* 0.7631 ±0.03804*

Spleen

(μg/g) 2.962 ±0.1963* 10.70 ±1.437* 13.18 ±1.251* 13.62 ±1.099* 8.572 ±0.3429* 7.686 ±0.4511* 5.350 ±0.3704* 4.636 ±0.2725* 1.597 ±0.1756 0.6229 ±0.02778*

Lung

(μg/g) 5.557 ±0.3067* 7.429 ±0.5179* 7.127 ±1.065* 6.104 ±0.8235* 3.939 ±0.2010 4.316 ±0.1258* 3.157 ±0.2486* 2.912 ±0.1339* 1.073 ±0.03227* 0.5284 ±0.05177*

Kidney

(μg/g) 4.120 ±0.2468* 15.28 ±1.409* 14.20 ±1.126* 14.77 ±0.4829* 6.722 ±1.277* 5.923 ±0.2634 5.364 ±0.3162* 4.681 ±0.1847* 1.667 ±0.09264* 0.6202 ±0.03650*

*与Neoral作比较，t检验和单因素方差分析P均＜0.05

*Compared to Neoral, the result of both t test and one-way analysis of variance are P ＜0.05

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blood32.521.510.50024681012141618202224time(h)

图4-7 血药经时曲线(n=6,x?s)

Fig4-7 The profile of CyA concentration and time in blood (n=6,x?s)

NeoralCyA-L100-NPC(μg/ml)heart876543210024681012141618time(h)

图4-8 心药浓经时曲线

Fig4-8 The profile of CyA concentration and time in heart (n=6,x?s)

NeoralCyA-L100-NPC(μg/g)202224 38

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liver1412108642002468time(h)

图4-9 肝药浓经时曲线

Fig4-9 The profile of CyA concentration and time in liver (n=6,x?s)

NeoralCyA-L100-NPC(μg/g)1012141618202224spleen2015NeoralCyA-L100-NPC(μg/g)1050024681012141618202224time(h)

图4-10 脾药浓经时曲线

Fig4-10 The profile of CyA concentration and time in spleen (n=6,x?s)

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lung108NeoralCyA-L100-NPC(μg/g)6420024681012141618202224time(h)

图4-11 肺药浓经时曲线

Fig4-11 The profile of CyA concentration and time in lung (n=6,x?s)

kidney2015NeoralCyA-L100-NPC(μg/g)1050024681012141618202224time(h)

图4-12 肾药浓经时曲线

Fig4-12 The profile of CyA concentration and time in kidney (n=6,x?s)

由表4-5，4-6可以看出，灌胃给予Neoral和CyA-L100-NP后，两种制剂在脾及肾中药物达峰时间Tmax发生了变化，CyA-L100-NP组在脾及肾中的Tmax分别为1.5h和0.5h，比Neoral组分别延迟和提前了0.5h。t检验和方差分析可知CyA-L100-NP组在血液中的Cmax显著高于Neoral组，在其他组织中（除心外），大部分时间点与Neoral组相比具有显著性差异（P ＜0.05），表明

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