综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取

综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取

（一） 柠檬酸发酵

一、实验原理

柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羧生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。但就柠檬酸产生菌而言，由于其顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：

2 C6H12O6 + 3 O2→2 C6H8O7 + 4 H2O

国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。 二、实验器材 （一）材料

1．菌种：黑曲霉 2．蔗糖、硫酸铵等 （二）主要仪器设备

1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等 三、操作步骤

1．种子培养基制备：

马铃薯培养基配方:(1000ml) 马铃薯（去皮） 200g 葡萄糖（或蔗糖）20g 琼脂 15~25g 水1000ml 自然pH

2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。

3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。

4．发酵培养基制备：蔗糖 15%，硫酸铵 0.4%，磷酸二氢钾 0.1%，7水合硫酸镁 0.025%。 5. 上罐灭菌（操作同实验一）

5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、200r/min条件下发酵4天。

6.分别在0，24，48，72，96小时测定一下参数。 四、实验结果

1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。

2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。

3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。

总反应式：2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O 180 192 理论转化率=192/180=106.7%

（二）生长曲线测定

1. 将烘干的离心管称重，记录重量

2. 取10ml发酵液离心，5000rpm，10min（上清液留作下步用），将试管倒置10min，80℃烘干1h。

3. 称重，计算菌丝体干重。

4. 以时间为横坐标，菌丝体重量为纵坐标作图。

（三）酸度测定——产物生成曲线

试剂: 0.1% 酚酞指示剂, 0.1429M NaOH 溶液 酸度：100ml发酵液中柠檬酸的克数。

酸度的测定方法：取发酵液1ml，加入19ml蒸馏水，以酚酞为指示剂用0.1429M的NaOH

溶液滴定至粉红色，所消耗的NaOH毫升数，即为发酵液酸度。 以时间为横坐标，酸度为纵坐标作图。

（二） 还原糖的测定——糖利用曲线

一、实验原理

在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

三、试剂和器材

1、试剂

6.5g DNS溶于200-300ml去离子水，配制2mol/l NaOH 溶液 325ml，3. 45g 甘油（丙三醇）三者混合定容至1000ml即可。

葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。

2、材料 发酵液 3、器材

WFJ UV－2000型分光光度计，水浴锅，电炉，试管。 四、操作方法

1、葡萄糖标准曲线制作

水迅速冷却，各加入蒸馏水12.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量（mg）

为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 蔗糖酸解

取2ml离心后的上清液，置于干净的试管中，加入2ml 2M盐酸摇匀，置于沸水浴中水解25min，使蔗糖水解成单糖。水解液用2ml 2M NaOH调至中性，全量倒入100ml容量瓶中，定容。

3、样品中含糖量的测定

各加入蒸馏水12.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。（如果测量的OD值高于标准曲线的最高值，稀释后重新测量，注意计算稀释率）。

3、结果处理

发酵液含糖量（g/ml）=[(A×N)/1000]*100

A:为由吸光度查标准曲线所得的还原糖的毫克数 N：为稀释倍数。

（三） 柠檬酸的提取——柠檬酸钙的制备

一、实验原理

在成熟的柠檬发酵液中大部分是柠檬酸，但还含有部分山芋粉渣、菌丝体以及其它的代谢产物的杂质。柠檬酸的提取是柠檬酸生产中极为重要的工序，柠檬酸的提取方法有钙盐沉淀法、离子交换法、电渗折法及萃取法等，目前广泛用于国内生产的是钙盐沉淀法，其原理是利用柠檬酸与碳酸钙反应形成不溶性的柠檬酸钙而将柠檬酸从发酵液中分离出来，并利和硫酸酸解从而获得柠檬酸粗液，经活性炭、离子交换树脂的脱色及脱盐，再经浓缩，结晶干燥等精制后获得柠檬酸成品，其中和及酸解反应式如下： 中和：2C6H8O7·H2O+3CaCO3→Ca3（C6H5O7）2·4H2O↓+3CO2↑+H2O

酸解：Ca3（C6H5O7）2·4H2O+3H2SO4+4H2O→2C6H8O7·H2O +3CaSO4·2H2O↓ 本实验以提取柠檬酸钙盐为主。 二、实验器材 （一）实验材料

1．柠檬酸发酵液、轻质碳酸钙（200目）、0.1429N氢氧化钠溶液、1%酚酞指示剂 （二）仪器设备

1．制备式离心分离机、滴定管、烘箱 三、实验步骤

1．发酵液预处理：将成熟的柠檬酸发酵液加热至80℃，保温10~20分钟，趁热进行离心分离，取滤液备用并记录滤液总体积。

2．发酵液总酸的测定：取滤液1ml，加5ml蒸馏水于洁净三角瓶人加入1滴酚酞指示剂用0.1429N NaOH滴定于初显红色为止，记下NaOH的消耗量。

3．中和：将发酵滤液加热至70℃，同时加入发酵液总酸量72%的轻质碳酸钙进行中和至pH 5.8，残酸0.2%~0.3%，并于85℃条件下搅拌并保温30min。

4．离心及洗糖：将中和液趁热离心，倾去上清液后加入滤液总量1/2的80℃热水洗糖，

再次离心所得固体即为柠檬酸钙盐。

5．将所得柠檬酸钙置于干燥洁净的表面皿中，于105℃烘干称重。 四、实验结果

1．计算发酵液中总酸浓度及发酵所得的总酸量。 2．根据所得的钙盐重量计算钙盐提取的提取收率。 3．简述发酵液预处理的意义及洗糖的目的。

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