病毒TCID50测定

病毒TCID50测定

操作步骤 (1) 准备细胞

取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细 胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。 (2) 稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法 B法参照书将液体量减少后的结果

病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500μl，即10-1为50μl加入450μl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100μl加入900μl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。 【！此步操作注意事项：

1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。 2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。

2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】 (3) 接种

取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】

37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200μl继续在37℃ CO2培养箱中培养。 (4) 培养

将培养板放置于CO2培养箱。培养温度 ，培养 天。 (5) 测定结果

取出培养板，显微镜下观察细胞病变。 计算方法

1) Spearman-Karber 法

LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1） X0 = 全部病变最低稀释度对数 d = 稀释因数对数

N1 = 每个稀释度所种的孔数

R1 = 病变孔数 ∑ = 积和

LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.7 2) Reed-Muench法 观察CPE,

找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50

TCID50 是指组织培养物（细胞）半数致死计量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度； 2）它是一个单位；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。

首先我们来看一下这个表示法的意思：

病毒浓度为10^8.2TCID50/ml

它表示的是每ml病毒溶液里含有10^8.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理。

经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10^xx。这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有多少个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒溶度是xxTCID50/ml.

理解了TCID50的概念之后，我们再来看看TCID50是如何计算的？

请看例子：

每个所加液体的体积是0.08ml。图中给出的计算方法是有问题的，请先忽略不看。

从图中我们可以知道半数致死的稀释度肯定是介于10^-6到10^－7之间，肯定可以表

示成10^-6.xx。那么这个.xx到到底是多少呢？ 这实际上是一个线性插值的问题。求解见下图：

PD/[log(dilution above 50%)-log(dilution below 50%)]=[(%next above 50%)-50%]/[(%next above 50%)-(%next below 50%)]

＊注意：如果你的病毒是以3倍3倍地稀释那么上面这个公式的log就应该是以3为底的log，其他稀释度与此相类似。 在本例子中

PD/[(-6)-(-7)]=(80%-50%)/(80%-0%) PD=0.375

log(50％的致死的稀释度)=-6-0.375=-6.375 求解得到50％的致死的稀释度为10^-6.375

根据TCID50的定义，就把这个稀释度所含的病毒的量定义为1个TCID50. 在本例中即定义把病毒稀释到10^－6.375梯度后取0.080ml所含的病毒的量为1个TCID50.

接下来我们就可以根据这个定义来求原液的病毒溶度。通常求解每ml含有多少个TCID50的病毒。

我们先要来求解这个问题：已知把病毒稀释到10^－6.375梯度后取0.080ml所含的病毒的量为1个TCID50，那么病毒原液直接取0.080ml有多少个TCID50.

很显然0.080ml病毒原液有10^6.375个TCID50。再求解1ml有多少个TCID50就简单了：

设1ml这样的病毒原液就有x个TCID50 x/1ml＝10^6.375/0.080ml x=10^6.375/0.08=2.9*10^8

所以每ml这样的病毒原液有2.9＊10^8个TCID50，即该病毒原液的溶度为2.9*10^8TCID50/ml

[如果对于上面我说的“很显然“你一时显然不起来的话，我可以帮你举这样的一个例子：你把溶度未知的DNA溶液稀释100倍(即稀释到10^-2稀释度)后取 0.080ml去测0D值结果发现这0.08ml的稀释液含有1个ug的DNA，那么很显然可以知道如果直接取0.080ml的原液就应该含有100ug 的DNA，该DNA 溶液的溶度为

100ug/0.080ml=1250ug/ml。如果你还很显然不起来的话，建议你不要从事和理工科相关的工作，你可去当总统什么的，千万别当财政部部长！]

说明：我们已经证实，TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7。 将TCID50/ml转换为PFU/ml：

T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml≈4×107 PFU/ml。 两次重复试验得到的滴度值应相差≤0.7个log10值（100.7）。

MOI 是multiplicity of

infection的缩写，中文译为感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell

设1ml这样的病毒原液就有x个TCID50 x/1ml＝10^6.375/0.080ml x=10^6.375/0.08=2.9*10^8

所以每ml这样的病毒原液有2.9＊10^8个TCID50，即该病毒原液的溶度为2.9*10^8TCID50/ml

[如果对于上面我说的“很显然“你一时显然不起来的话，我可以帮你举这样的一个例子：你把溶度未知的DNA溶液稀释100倍(即稀释到10^-2稀释度)后取 0.080ml去测0D值结果发现这0.08ml的稀释液含有1个ug的DNA，那么很显然可以知道如果直接取0.080ml的原液就应该含有100ug 的DNA，该DNA 溶液的溶度为

100ug/0.080ml=1250ug/ml。如果你还很显然不起来的话，建议你不要从事和理工科相关的工作，你可去当总统什么的，千万别当财政部部长！]

说明：我们已经证实，TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7。 将TCID50/ml转换为PFU/ml：

T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml≈4×107 PFU/ml。 两次重复试验得到的滴度值应相差≤0.7个log10值（100.7）。

MOI 是multiplicity of

infection的缩写，中文译为感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell

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