血清总蛋白测定方法学评价

临床生物化学 临床生化检验方法学评价试验 杨 梅 J检验0701 3071113009 双缩脲法测定血清总蛋白的方法： 加入物(ml) 血清 蒸馏水 双缩脲试剂 B － 0.10 5.0 S － 0.10 － 5.0 U 0.10 － － 5.0 蛋白标准液（78.6g/L） － 混匀，置25℃30min或37℃10min，在波长540nm处比色，用空白管调零，测各管吸光度。 计算：血清总蛋白(g/L)?AU?蛋白标准液浓度(g/L) As 一、重复性实验 1、操作 将血清标本用双缩脲法法作5轮，每轮4次血清总蛋白测定，即可获得20个测定数据。 2、计算 （1）检验20次测定数据中的离群值 如存在异常值时应剔除。对小样本测定来讲，可采用Grubbs检验公式是：G??d??S（Xd为离群值； X为包括离群值在内的测定值的均数；s为包括离群值在内的测定值的标准差） （2）按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数(X)、标准差(s)和变异系数（CV%）。 ????/测定轮数（m） 批内均数?每轮测定值均数之和批内标准差（Sw）??Sm2i （S2i?(??i??)2n?1） 变异系数（CV%）?批内标准差Sw/批内均数?100% 3、 批内重复性试验的数据处理 测定 批数 1 2 3 4 5 每轮测定次数（n）及测定值（Xi） ∑Xi ? Si Si2 4、评价 批内不精密度的判断限是1/4允许误差范围。批间不精密度的判断限是1/3允许误差范围。 二、回收试验 第 1 页 共 3 页 临床生物化学 1、操作 （1）样品制备 基础样品：血清0.9ml+0.1ml生理盐水。 回收样品Ⅰ：血清0.9ml+0.01ml蛋白标准液+0.09ml生理盐水。 回收样品Ⅱ：血清0.9ml+0.06ml蛋白标准液+0.04ml生理盐水。 回收样品Ⅲ：血清0.9ml+0.09ml 蛋白标准液+0.01ml生理盐水。 （2）按双缩脲法测定方法测定各制备样品的血清总蛋白的浓度，每份样品作双份检测，取平均值 。 2、计算 加入浓度（g/L）?标准液浓度?标准液量（ml） 血清量（ml）?标准液量（ml）?生理盐水（ml）回收量?回收样品测得值?基础样品测得值 回收率（%）?回收量?100% 加入浓度3、回收试验的数据处理 样 品 基础样品 回收样品Ⅰ 回收样品Ⅱ 回收样品Ⅲ 平均回收率 测定浓度（g/L） 加入蛋白标准液浓度（g/L） 回收浓度（g/L） 回收率（%） 4、评价 一般检验方法，要求回收率在95-105%之间，最理想的回收率应为100% 。 三、干扰试验 1、尿素含肽键（-CO-NH-），两个尿素分子缩合后可与铜离子反应生成紫红色络合物，增加显色强度，产生干扰。 2、操作 （1）样品制备 基础样品：血清0.9ml+蒸馏水0.1ml 干扰样品Ⅰ：血清0.9ml+尿素标准液0.05ml+蒸馏水0.05ml 干扰样品Ⅱ：血清0.9ml+尿素标准液0.1ml 尿酸样品：蒸馏水0.9ml+尿素标准液0.1ml （2）按双缩脲法测定方法测定各制备样品的血清总蛋白的浓度，每份样品作双份检测，取平均值 。 3、计算 干扰物加入值?干扰物溶液浓度?干扰物溶液量（ml） 血清量（ml）?干扰物溶液量（ml）?蒸馏水量（ml）干扰值（g/L）?干扰样品测定值?基础样品测定值 干扰率（%）?干扰值/基础值?100% 第 2 页 共 3 页 临床生物化学 4、干扰试验的数据处理 样 品 基础样品 干扰样品Ⅰ 干扰样品Ⅱ 尿酸样品 总蛋白测定值（g/L） 加入尿素值（g/L） 干扰值（g/L） 干扰率（%） 四、方法比较试验 1、本实验以紫外吸收法测定血清总蛋白的方法作对比来评价双缩脲法测定血清总蛋白的总系统误差 2、取40-100份血清标本，每份标本用双缩脲法和紫外吸收法两种方法，分别作双份测定。 紫外吸收法测定血清总蛋白的方法： 部分纯化的蛋白质常含有核酸， 核酸、核苷酸和碱基等物质在紫外区也有强的光吸收，常与蛋白质类相互干扰。 但二者的紫外吸收特性不一样， 由于核酸类物质在 260nm 有最大吸收值， 因此， 可利用蛋白质 280nm 和 260nm 的吸收差法来测定计算蛋白质浓度。 （1）取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中，于751型分光光度计波长280nm和260nm，分别读取A280和A260，用蒸馏水（缓冲溶液或盐溶液，视样品溶液而定）为比色空白对照。 （2）根据下列公式计算样品中的蛋白质含量：蛋白质含量（g/L）=1.45A280—0.74A260 3、方法比较试验数据处理 样品号 1 2 … 20 双缩脲法（X轴） 紫外吸收法（Y轴） 样品号 双缩脲法（X轴） 紫外吸收法（Y轴） 21 22 … 40 4、作散点图 5、计算 （1）如果x、y之间呈直线关系，可作直线回归的统计处理，计算：回归方程y=a+bx和相关系数r。其结果可以显示实验方法的测定结果有无系统误差存在：截距a反映恒定系统误差的大小；斜率b反映比例系统误差的大小；相关系数r反映两种方法相关性的密切程度 （2）在方法比较试验中，相关系数（r）可作为被评价方法可否被接受的一项统计学指标。对相关系数还应作相关系数的t检验。相关系数（r）的t检验统计学公式是：tr?rn?2 21?r（3）方法比较试验的数据属于配对资料，因而可作配对t检验，其统计学公式是：t?dsdn ?（差值标准差（Sd）（d?d）d???22?(?d)2/nn?1n?1由度（），自?）?n?1 在计算t值公式中的分子部分是两种方法的偏差值，表明方法间系统误差的大小。分母是平均偏差标准误，反映方法比较实验中随机误差的大小。因此t值时方法比较试验中系统误差和随机误差的比值。 4、 评价 在评价一个实验方法时，最理想的情况是回归直线呈45°角通过零点，这时a=0，b（x/y比值）=1.0，表明恒定系统误差和比例系统误差均不存在。但x和y都会有随机误差，a和b只是估计值，会有所波动，只要偏离程度比较小，该方法就能用于临床检验的常规分析。 第 3 页 共 3 页

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