1、氨基酸的分离鉴定--纸层析法

实验一：氨基酸的分离鉴定--纸层析法

一、目的：

通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理：

层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。

层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。

层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。

纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。纸层析属于分配层析法。分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。

纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。

在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数，用ａ表示）不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。

一种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是分配系数（?）。

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分配系数不同：

物质在溶剂I中的浓度

???= ———————————

物质在溶剂II中的浓度

某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf值基本上是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、纸层析纸的质量（新华一号）和层析温度等因素有关。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置Rf值（比移）来表示：

原点到层析点中心的距离 Rf = ————————————— 原点到溶剂前沿的距离

印三酮颜色反应：印三酮在弱酸溶液中与?-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧、脱羧反应，最后印三酮与反应产物--氨和还原印三酮（hydrindantin）发生作用，生成紫色物质（NH3与印三酮反应形成紫色化合物）。用纸层析法或柱层析把各种氨基酸分开后，利用印三酮显色可以定性鉴定应用分光光度法在570nm定量测定各种氨基酸。

两个亚氨基酸，脯氨基酸和羟脯氨基酸与印三酮反应不释放NH3，而直接产生亮黄色化合物，最大光吸收在440nm。

亮氨酸 苯丙氨酸 缬氨酸 脯氨酸（黄色） 赖氨酸

三、器材；

1、层析缸（两人一组，四组共用一个层析缸）；2、培养皿（两人一组）；3、毛细管（药品是两组共用一套）；4、喷雾器；5、层析滤纸（新华一号） 四、试剂

1、 扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物（p.123）；（水饱和的正丁醇和乙酸的混

合物。其中被滤纸吸附的水为固定相，正丁醇为流动相 ，乙酸为层析提供酸性环境。） 2、 氨基酸溶液: 0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各

组分均为0.5%）；

3、 显色剂：0.1%水合印三酮正丁醇溶液 五、操作：

1、 平衡：将盛有平衡溶剂的培养皿放入密闭的层析缸中，倒1厘米厚的扩展剂； 2、 滤纸（新华一号或者Whatman-1号）：在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔划一条直线，在

直线上每隔2cm作一记号（如书p.123），共6个记号，这个记号是样品Rf值计算的原点； 3、 点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，点样量以30~40μL为宜，每点一次样，用吹风机吹干，然后再点一次；重复点样3~4次。

注意：点样时毛细管垂直轻轻接触滤纸，一触即止，每个点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。

4、 扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触（避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动

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过快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值）。滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm。待溶剂上升15cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或吹风机吹干。

5、 显色：用喷雾器均匀喷上0.1%印三酮正丁醇溶液（与水不混溶且挥发性较大的溶剂），用

热风吹干（或烘箱100℃烘烤5分钟）显出个层析斑点（为什么这儿要热风？氨基酸与印三酮共热反应显色）。

六、结果与分析：计算各种氨基酸的Rf值。

【注意事项】

1、取滤纸之前要将手洗干净，防止手上的汗渍污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；在条件允许的情况下也可戴一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在干净的报纸上，千万不要放在实验台上，以防止污染。

2、点样点（垂直点样）的直径不能超过3mm，否则分离效果不好，并且样品用量过大，会造成“拖尾”现象；点样一次后立即吹干，然后再点。

平衡剂的作用：平衡剂起到使纸层析上吸附的溶剂达到饱和，使物质在展开剂和纸层析上吸附的溶剂中溶解度不同而分离。

展层方式有上行、下行和环行。虽然其方式可以不同，但其共同点都是将点好样品的滤纸固定，让溶剂扩展，层析缸内保持恒定的蒸气压并保持恒温，减少温度波动使溶剂走的不均匀，从而改变Rf值。上行层析是比较常用的方法，它的优点是可以在两个方向上进行（双向层析）。下行层析适用于一些Rf值接近的混合物。此时不能测定Rf值，而只能与标准参考物相比较。

附：影响Rf值的因素

1、物质结构的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸的极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf值低于后者。氨基酸的极性愈大，Rf值愈小。

—CH2—基（亚甲基）是疏水性基团，如果分子中极性基数不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值也随之增加。例如氨基酸的Rf值 ：甘氨酸〈 丙氨酸 〈 亮氨酸 ；二羧基氨基酸中，天门冬氨酸〈 谷氨酸。

极性基团的位置不同也会引起Rf值变化。

纸层析时，由于各个氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的Rf值，因此被分开（可以用双向纸层析法）。当混合物中所含的氨基酸种类较少，Rf值彼此差距比较大，则在同一溶剂系统进行单向层析即可。

2、溶剂的影响：同一种物质在不同溶剂中Rf值不同，选择溶剂系统时应该使被分离物质在适当Rf值范围内（0.05-0.85之间），并且不同物质的Rf值至少差别为0.05才能彼此分开。

溶剂的极性大小也影响物质的Rf值，在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着

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溶剂碳原子数目的增加而降低。

3、pH的影响：溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式。对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。带电荷愈少亲水性愈小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。

溶剂的pH还可以影响有机溶剂的含水量，溶剂酸碱度大，则含水量高。对于极性物质来说Rf值增加，非极性物质则减少。若pH值不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf值也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸中用酸或碱气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。

4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密、有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中有Ca、Mg、Cu等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸洗涤滤纸除去之。一般分析工作可采用新华1号滤纸（或者Whatman 1号），若有较多样品需要在纸上分离提纯时则适合采用新华3号（或Whatman 3号）厚纸，但厚纸的分辨率比1号滤纸差。溶剂顺着纸的纹道扩展速度快，否则速度慢。

5、温度和时间的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对Rf值影响很大，所以层析时最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5C。当所有条件相同时，氨基酸层析时间短，Rf值则小。

除上述影响因素外，样品中含有盐份和其它杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。必要时，使用前可将滤纸用缓冲液浸泡或经乙酰化作用进行化学修饰。

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