基因工程习题及答案

第二章习题

一、 单选题

1. 在基因操作中所用的限制性核酸内切酶是指（ B ）

A ． I 类限制酶 B. II 类限制酶 C. III 类限制酶 D. 核酸内切酶 E. RNAase

2. 下列关于同裂酶的叙述错误的是 ( B )

A. 是从不同菌种分离到的不同的酶 , 也称异源同工酶。 B. 它们的识别序列完全相同。

C. 它们的切割方式可以相同，也可以不同。

D. 有些同裂酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。 E. 两种同裂酶的切割产物连接后，可能会丢失这两个同裂酶的识别位点。 3. 多数限制酶消化 DNA 的最佳温度是（ A ）

A. 37 ℃ B.30 ℃ C.25 ℃ D.16 ℃ E.33 ℃ 4. 下列关于限制酶的叙述错误的是 ( B )

A. I 类限制酶反应需要 Mg2+ 、 ATP 和 S- 腺苷蛋氨酸。 B. II 类限制酶反应需要 Mg2+ 、 ATP 。

C. III 类限制酶反应需要 Mg2+ 、 ATP ， S- 腺苷蛋氨酸能促进反应，但不是绝对需要。

D. I 、 III 类限制酶对 DNA 有切割和甲基化活性， II 类限制酶对 DNA 只有切割活性而无甲基化活性。 E. II 类限制酶要求严格的识别序列和切割点，具有高度精确性。

5. 如果一个限制酶识别长度为 6bp , 则其在 DNA 上识别 6bp 的切割概率为 ( D ) A. 1/44 B. 1/66 C. 1/64 D.1/46 E. 1/106 6. 多数 II 类限制酶反应最适 PH 是 ( C )

A. PH:2-4 B. PH:4-6 C. PH:6-8 D. PH:8-10 E. PH:4-10 7. 下列关于限制酶反应的说法错误的是 ( D )

A. 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，可能会阻碍限制酶的酶解活性。 B. 许多限制酶对线性 DNA 和超螺旋 DNA 底物的切割活性是有明显差异的。 C. 有些限制酶对同一 DNA 底物上不同酶切位点的切割速率会有差异。

D. 限制酶反应缓冲系统一般不用磷酸缓冲液，是由于磷酸根会抑制限制酶反应。

E. BSA 对许多限制酶的切割活性都有促进作用，所以酶切反应中常加入一定量的 BSA 。 8. II 类限制酶反应中必须的阳离子是（ C ）

A. Na + B. Ca2+ C. Mg2+ D. Zn2+ E. Mn2+ 9. RFLP 形成的原因是 （ A ）

A. 由于遗传变异造成同源染色体中碱基的随机变化。 B. 使用不同的限制性内切酶进行切割。 C. 杂交时使用不同的探针。 D. 每种染色体存在两条。 E. 提取不同的染色体 DNA 酶切。

10. 下列关于限制酶命名的表示方法，正确的是（ E ）

A. Sau.3A I B. B.amH I C. pst I D. Ecor I E. Hind III 11. 需进行 DNA 部分酶切时，控制下列哪种条件最合适（ D ） A. 反应时间 B. 反应体积 C. PH D. 限制酶量 E. 反应温度 12. 下列酶在反应中不需要 ATP 的是 ( D )

A. E coK B. T4DNA 连接酶 C. BamH I D. EcoB E. DNA pol I 13. 限制性内切酶可特异性识别 ( B )

A. 双链 DNA 的特定碱基对 B. 双链 DNA 的特定碱基序列 C. 单链 RNA 的特定碱基序列 D. 单链 DNA 的特定碱基序列 E 双链 RNA 的特定碱基对

14. 下列与 RFLP 相关的一条是 ( D )

A. 不同限制酶在单个染色体 DNA 上的限制性图谱。 B. 两种物种个体间的限制性图谱。 C. 同一个体等位基因的限制性图谱。 D. 同一物种不同个体的限制性图谱。

E. 非同源染色体用同种限制酶切形成的限制酶图谱。 15 ． 限制酶的星号活性是指在非正常条件下，限制酶（ A ）

A. 识别和切割序列发生变化。 B. 切割活性大大提高。 C. 识别和切割序列与原来完全不同。 D.

可以任意切割 DNA 。 E. 只能部分切割 DNA 。 二、多选题

1. 下列因素中影响限制酶切割的有 ( A,B,C,D,E)

A. EDTA 浓度 B. 甘油浓度 C. DNA 纯度 D. 酶的自身活性 E. 盐浓度

2. 限制酶反应中出现星活性的可能原因是（ A B D E ）

A ．酶浓度太高 B 低盐 C 盐浓度过高 D 高 PH E 甘油浓度 >5% （ V/V ） 3 ． 限制酶切割后的 DNA 电泳得到的电泳条带有些扩散，可能原因是（ B ， C ， D ， E ） A ．酶失活 B 有蛋白质与 DNA 结合 C 酶切条件不合适 D 有外切核酸酶污染 E 星号活性

4 ． 下列有关回文序列的描述正确的是（ A ， B ， C ）

A ． 是 II 类限制酶的识别序列 B 是某些蛋白的识别序列 C 是基因的旁侧序列 D 是高度重复序列 E 是卫星序列 5 ． 下列有关回文序列的一般特征正确的是（ B ， C ， D ， E ） A ． 可增强基因表达 B 有对称轴 C 是自我互补的序列

D ． 两条链从 5 ‘ 3 ‘方向的序列一致 E 是 II 类限制酶的识别序列 6 ． 关于 II 类限制酶说法正确的是（ B ， D ） A ． 具内切核酸酶和甲基化酶活性 B ． 仅有内切核酸酶活性 C ． 只识别非甲基化的 DNA 序列 D ． II 类限制酶反应条件只需要 Mg2+ E ． II 类限制酶反应需要 Mg2+,ATP

7 ．通过限制性片段分析，可对等位基因进行精确比较是因为（ B ， C ） A ． 限制酶只切割两个变异等位基因中的一个 B ． 限制酶位点可作为遗传标记

C ． 它不依赖变异的等位基因的产物的功能 D ． 不同组织等位基因的核苷酸序列存在差异 E ． 同一组织等位基因核苷酸序列不会完全相同

8. 下列关于 II 类限制酶的叙述正确的是（ B ， C ， D ， E ） A ． 它既有内切酶的活性，也有外切酶活性 B ． 在特异位点对 DNA 进行切割

C ． 同一限制酶切割双链 DNA 时产生相同的末端序列 D ． 有些限制酶切割双链 DNA 产生粘末端 E ． 有些限制酶切割双链 DNA 产生平末端

9 ． 限制酶反应结果若显示没有切割，可能原因是（ A ， B ， C ， D ， E ）

A ． 限制酶无活性 B 存在抑制剂如 SDS ， EDTA C DNA 不纯 D ． 缓冲液组成不合适 E DNA 甲基化 10 ．下列关于限制酶的叙述正确的是（ B ， C ， D ）

A ． 在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他限制酶就不能切割了。 B ． 限制酶在 DNA 中的识别 / 切割位点的二、三级结构影响酶切效率。

C ． 如果限制酶的识别位点位于 DNA 分子末端，那么接近末端的程度也影响切割。

D ． 已知某限制酶在一环状 DNA 上有 3 个切点，因此该酶切割这一环状 DNA ，可得到 3 个片段。 E ． 能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中没有该酶识别的序列。 11 ．酶在储存过程中迅速失活，可能原因是（ A ， B ， C ， E ） A ． 储存温度不合适 B 稀释后储存 C 储存缓冲液不合适 D ． 分装后储存 E 储存缓冲液中蛋白浓度低

12 ．限制酶切反应结果显示为部分切割，可能原因是（ A ， B ， C ， D ， E ） A ． 限制酶失活 B 有抑制剂如 SDS ， EDTA 等存在 C 反应条件不合适 D DNA 不纯 E DNA 结构（线形或超螺旋）的影响

13 ．如果用限制酶切割 DNA 后得到的片段比预期的多，可能原因是（ B ， C ， E ） A ． 限制酶失活 B 限制酶的星号活性 C 有其他限制酶污染 D 有抑制剂存在 E 测试 DNA 中有其他 DNA 污染

14 ．限制酶切割后的产物连接反应效果差，可能原因是（ A ， B ， C ， E ） A ．限制酶去除不完全 B 平端连接 C 核酸外切酶污染 D ．连接反应温度低于 16 ℃

E ．从限制酶消化中带来太高浓度的磷酸盐或其他盐类 15 ．下列限制酶属同裂酶的是（ A ， B ， D ， E ） A ． BamHI G ↓ GATCC Sau3AI ↓ GATC CCTAG ↑ G CTAG ↑

B ． Sal I G ↓ TCGAC Xho I C ↓ TCGAG CAGCT ↓ G GAGCT ↓ C C ． BamH I G ↓ GATCC EcoR I G ↓ AATTC CCTAG ↓ G CTTAA ↓ G D. Hpa II G ↓ CGC Msp I C ↓ CGG

CGC ↓ G GGC ↓ C E. Xba I T ↓ CTAGA Nhe I G ↓ CTAGC AGATC ↓ T CGATC ↓ G

三．填空题

1 ．限制酶是一类专门切割 DNA 的酶，它能特异性识别切割 双 链（单、双） DNA 。 2 ． II 型限制酶识别位点一般长度为 4~6 个核苷酸对。

3 ．个体之间 DNA 限制酶片段长度存在差异称 限制性片段长度多态性（ RFLP ）。

4 ．限制酶命名采用 Smith 和 A thens 提议的方案，第一个字母大写取自来源细菌的 属名 ；第二、三个字母取自来源细菌的 种名；第四个字母（如果有）取自来源菌的 株系。

5 ．需要部分酶切时可采取的方法有（ 1 ）减少酶的用量 （ 2 ）缩短反应时间 （ 3 ）增大反应体积。 6 ．限制酶识别序列为 n 个碱基，则其切割频率的理论值应是 4n 。 7 ．限制性内切酶通常保存在 50% 浓度的甘油溶液中。

8 ．甘油浓度是导致一些酶的星活性的原因之一，在酶切时反应体系中的甘油浓度应控制在 5% 以下。

9 ．限制与修饰是宿主的一种保护体系，它是通过对外源 DNA 的 限制 和对自身 DNA 的 修饰 来实现的。 10 ． II 型限制酶既具有 识别位点 的专一性，也具有 切割位点 的专一性。它作用时需要 Mg2+ 离子作辅助因子。

四．简答题

1 ．在酶切缓冲液中加入牛血清白蛋白（ BSA ）的目的与机理是什么？

答：目的是保护酶的活性；机理是通过提高反应体系中蛋白质的浓度，防止内切酶失活。 2 ．如果用 EcoR I 酶切 DNA 时出现星活性，试分析原因？

答：主要原因有：酶浓度太高；高 PH ；低盐；含 Mn2+ 、 Cu2+ 等非 Mg2+ 金属离子；甘油浓度高于 5% ；存在某些有机溶剂。

3 ．下列序列中哪些可能是 II 类限制酶的识别序列？ ATATCG CCCGGG GATATC AGCCGA GAGTC 答： CCCGGG GATATC GAGTC

4 ．用 Klenow 酶可将 5 ‘粘末端填补成平末端，而导致某些限制位点消失，下列酶切后用 klenow 处理再连接不会丢失识别位点的是哪些？

XmaI C ↓ CCGGG BssH II G ↓ CGCGC PstI CTGCA ↓ G HhaI GCG ↓ C HpaII G ↓ CGC 答： BssH II, HpaII

5 ．当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？为什么？

答：要避免星活性及部分酶切。（ 1 ）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（ 2 ）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将 DNA 重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（ 3 ）先低温酶，后高温酶；（ 4 ）使用通用缓冲液。

6 ．试计算下列三种限制酶各自在某染色体 DNA 序列上的切割概率 Sau3A I GATC Pst I CTGCAG Hinf I GANTC Acy I GPuCGPyC

答： 1/44 ； 1/46 ； 1/44 ；（ 1/44 ） x(1/22)

7 ．一长为 4.2kb 的 DNA 片段，分别用 EcoRI 、 PstI 及 EcoRI+PstI 消化，电泳结果如下图所示，请根据结果绘出该片段限制性图谱

0.7kb

0.7kb 0.8kb 1.5kb 1.4kb 2.0kb 2.0kb 2.8kb

EcoRI Pst I EcoRI + Pst I 答： EcoRI PstI EcoRI

0.7kb 0.7kb 0.8kb 2.0kb

回收与连接

一．单选题

1 ．用 DEAE 膜片法回收电泳分离的 DNA 片段时，在紧靠目的 DNA 片段前方的凝胶切一裂缝，以插入 DEAE 纤维素膜，该裂缝长度与 DNA 条带相比应（ C ）

A ． 略短 B. 等长 C. 略长 D. A 或 B 都可 E . A 、 B 、 C 都可

2 ．用透析膜插片凝胶电泳法回收 DNA 片段时，再区带前挖一小槽，将透析膜置于槽中，这时应注意（ B ） A ．透析膜要接触 DNA 区带一侧的胶缘 。 B ．透析膜不能接触 DNA 区带一侧的胶缘 。 C ．透析膜要接触 DNA 区带相对一侧的胶缘 。

D ．透析膜不能接触 DNA 区带相对一侧的胶缘 。 E ．随意插入槽中即可。

3 ．在回收 DNA 片段时，观察电泳结果为尽量减少对 DNA 的照射损伤应使用（ A ）

A ．长波长紫外 B. 短波长紫外 C . 长波长红外 D. 短波长红外 E. ABCD 都不可 4 ． DNA 回收时，如要除去 EB （溴化乙锭）可用下列那种试剂（ A ） A ．正丁醇 B. 苯酚 C. 氯仿 D. 异戊醇 E. 乙醇 5 ．在 DNA 分子克隆时，常用到部分填补法，填补时应注意（ E ） A ．控制反应温度 B. 控制酶的反应时间 C. 控制 DNA 聚合酶的用量 D. 控制反应 PH E. 限制 dNTP 的种类 6 ．下列关于平末端连接的说法正确的是（ B ） A ． 同等条件下连接效率高于粘末端连接的连接效率。 B ． 加入凝聚剂 PEG8000 可促进平末端连接。 C ． 平末端连接时反应温度要比粘末端连接温度高。

D ． 平末端连接方法的使用仅限于酶切后产生的两个平末端之间的连接。 E ． 平末端连接比粘末端连接更易产生自身环化。

7 ．用同一种酶切割载体和目的基因后进行连接，连接产物会含大量自身环化载体，采用下列哪种酶处理，可防止自身环化（ E ）

A ．核酸内切酶 B. 核苷酸激酶 C. 核酸外切酶 D. 末端转移酶 E. 碱性磷酸酶 8 ．分子克隆中用 T 载体主要是与下列哪种产物连接（ D ）

A ．单酶切产物 B. 双酶切产物 C. 同裂酶产物 D. PCR 产物 E. 酶切后形成的平末端产物 9 ．采用 BamH I 单切载体和目的基因后，进行重组连接前要（ D ） A ． 65 ℃处理 10 分钟使 BamH I 灭活。 B ． 用碱性磷酸酶处理载体防止其自身环化。 C ． 电泳检测酶切结果。 D ． A 、 B 、 C 都正确。 E ． 只有 A 、 C 正确。

10 ．粘末端连接的优点是操作简便且（ C ）

A ．可产生新的酶切位点 B. 载体易自身环化 C. 易于回收片段 D ．具有方向性 E. 选时更简便

二．多选题

1 ．重组连接时，反应体系必须的组分有（ A 、 C ） A ． Mg2+ B. BSA C. ATP D. PO43- E . EDTA

2 ． DNA 片段重组连接可用下列哪些方法（ A 、 B 、 C 、 D 、 E ） A ．平末端连接 B. 粘末端连接 C. 加接头连接 D. 同聚尾连接 E . T 载体连接

3 ．酚抽提法回收 DNA 片段后残余的哪些物质可能会影响连接反应（ A 、 C ） A ．酚 B. 微量的 EB C. 琼脂糖 D. 少量的乙酸钠 E . 少量的乙醇 4 ．产生平末端的方法主要有（ A 、 B 、 E ） A ．用产生平末端的限制酶切 。 B ．用 klenow 片段补齐 5 ‘粘末端。 C ．用末端转移酶补齐粘末端。 D ．用 Taq 聚合酶补齐粘末端。 E ．用 S1 核酸酶降解粘末端。

5 ．在 DNA 重组连接时，常采用连接头连接（ linker ligation ），其作用是（ A 、 B 、 C 、 E ） A ．引入某些限制酶切位点。 B. 人工构建载体。 C ．增加调控元件。 D. 调整阅读框。

E ．通过接头引入与目的基因相同的限制酶位点，并对目的基因相应酶切点进行甲基化修饰保护，可保护目的基因不受限制酶破坏。

6 ．构建载体时，使用双酶切相对于单酶切的优点在于（ A 、 B 、 C 、 D ） A ．避免载体自身环化 B. 提高连接效率 C. 控制外源基因的插入方向 D. 便于转化后的筛选 E . 便于修改阅读框

7 ．下列关于同聚物加尾法的说法正确的是（ A 、 B 、 C 、 D 、 E ）

A ．其核心是利用末端转移酶的功能，将载体和外源 DNA 的 3 ‘端再加上一端寡核苷酸。 B ．不易自身环化。 C. 连接效率高 D. 适用于 CDNA 克隆 E ．可能会产生某种限制酶切位点。

8 ．下列与 DNA 重组连接相关的说法正确的是 （ A 、 D 、 E ） A ．不匹配的粘末端可通过部分填补后连接。

B ． 同聚尾法连接不仅连接效率高，也易回收插入的片段。

C ．限制酶切割 DNA 后加入 EDTA-SDS 终止液抑制限制酶活性，将有利于重组连接。

D ． Mg2+-ATP 是 T4DNA 连接酶反应时的必须因素。

E ．平末端连接时，在反应体系中加入适量凝聚剂可提高连接效率。 9 ．下列哪些因素对保证较高连接效率是有利的（ A 、 C 、 D ） A ．高纯度 DNA 。

B ．载体与目的基因摩尔数之比为 1 ： 1 。 C ．载体与目的基因摩尔数之比为 1 ： 3~5 。 D ．连接反应体系中 DNA 浓度较高。 E ．连接反应体系中 DNA 浓度较低。

10 ．如果 DNA 分子重组时，需要用平端连接，下列哪些方法可形成平末端（ B 、 C 、 D 、 E ）。 A ． 3 ‘突出的粘末端用 DNA 聚合酶加 dNTPs 填平。 B ． 3 ‘突出的粘末端用核酸酶切平。

C ． 5 ‘突出的粘末端用 DNA 聚合酶 加 dNTPs 填平。 D ． 5 ‘突出的粘末端用核酸酶切平。 E ．利用切口为平末端的限制酶。

三、填空题

1 ．形成平末端的方法有 用产生平末端的限制酶切，用 S1 核酸酶切除粘末端 ，用 DNA 聚合酶填平粘末端。 2 ．载体与 CDNA 连接重组可用的方法有 同聚尾连接酶，加人工接头连接法。

3 ． DNA 片段重组连接时，如要克隆 PCR 产物， PCR 产物可直接用 T 载体连接，而无须用限制酶处理。 4 ．回收 DNA 片段时，在确定 DNA 条带位置时，应使用 长 波长紫外灯，以最大限度减少对 DNA 的照射损伤。 5 ．回收 DNA 片段时，常用 正丁醇 处理以除去 EB 。

6 ．在用单一限制酶切载体和目的基因并进行连接时，为防止载体自身环化，常用 碱性磷酸酶 处理载体，或用 α - 互补 进行筛选。

7 ． DNA 片段重组连接的方法主要有 平端连接、粘端连接、同聚尾连接、加接头连接 。

四．简答题

1 ．如何将一平末端的 DNA 片段与 BamH I 形成的粘末端连接？

答：使用加接头连接法。人工合成一段含 BamH I 酶切位点的 DNA 短片段，然后与该平末端片段两端连起来，用 BamH I 切割连接片段，即可形成 BamH I 的粘末端。 2 ．什么是同聚尾连接法？具有哪些优缺点？

答：同聚尾连接法是利用末端转移酶在载体和外源 DNA 的 3 ‘端各加上一段互补的寡聚核苷酸，形成人工粘性末端，然后在 DNA 连接酶的作用下，连接成重组 DNA 。

其优点在于（ 1 ）由于同一 DNA 两端粘尾相同，不会自身环化；（ 2 ）连接效率高；（ 3 ）用任何一种方法制备的 DNA 都可用这种方法连接。

其缺点在于（ 1 ）方法复杂；（ 2 ）外源片段较难回收；（ 3 ）由于添加了同聚尾，可能会影响外源基因表达。 3 ．什么是接头连接法？

答：人工合成或来源于某一质粒的小段含某限制酶位点的 DNA 与载体或外源 DNA 分子相连，这样便在载体或外源 DNA 上制造出新的酶切位点，即接头连接。 4 ．为什么用同裂酶进行体外重组效率最高？

答：同裂酶是指来源不同的限制酶切割 DNA 后，产生相同的末端。多数同裂酶产生的粘性末端并非完全一致而是有四个碱基相同，这样用同裂酶切割载体和目的基因后的连接产物常会失去原有的限制酶位点，这样用同裂酶进行重组时，限制酶切割反应后不用将该酶失活，即可直接进行重组连接，由于连接体系中原有限制酶存在，载体自连不会发生，从而保证了载体只同外源 DNA 的连接。

转化

一．单选题

1 ．下列哪种 DNA 结构在转化时能获得最高转化效率（ ） A ．线形双链 DNA B. 单链线形 DNA C. 完整的环状双链 DNA D ．开口环状双链 DNA E. A 和 C

2 ．下列表型中，哪种是基因工程上的理想的受体菌表型（ B ）

A. r+m+rec+ B. r-m-rec- C. r- m+rec+ D. r+m+rec- E. r-m-rec+

3 ．大肠杆菌出现感受态的生理期是 （ B ）

A ．潜伏期 B. 对数期 C. 对数后期 D. 平衡期 E. 衰亡期 4 ． CaCl2 法制备 E.coli 感受态细胞时，摄入ＤＮＡ温度是（ E ） A ． 0 ℃ B. 16 ℃ C. 37 ℃ D. 25 ℃ E. 42 ℃ 5 ．关于感受态细胞的下列说法不正确的是（ C ） A ．有人工感受态细胞和自然感受态细胞。 B ．具有可诱导性。 C ．有可转移性。

D ．不同种细菌出现感受态的生理时期不同。 E ．不同种细菌出现感受态的比例不同。

二．多选题

1 ． C aCl2 诱导 E.coli 感受态细胞时，下列哪些因素会影响转化效率（ A 、 B 、 C 、 D 、 E ） A ． Ca2+ 浓度 B. DNA 纯度与构象 C. DMSO D. 温度 E. PH 2 ．人工诱导感受态细胞，下列方法哪些正确（ A 、 B 、 C 、 D ）

A ． CaCl2 处理 B. 核酸酶抑制法 C. 饥饿法 D. PEG 处理 E. DMSO

3 ．下列有关利用粘尾质粒将外源 DNA 导入 E.coli 中的说法正确的是（ B 、 C 、 D 、 E ） A ．空 cosmid 质粒可直接体外包装导入 E.coli ，也可用 CaCl2 法导入 E.coli 。 B ． Cosmid/DNA 与头部蛋白、尾部蛋白混合，体外包装后可进入 E.coli 。 C ． Cosmid 虽然只有 4~6kb , 但可容纳约 40~50kb 的外源 DNA 。 D ． Cos 序列是 DNA 包装到λ噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。 E ． Cosmid/DNA 重组体包装后以双链线性分子形式导入 E.coli 。 4 ．下列有关λ DNA 重组体导入 E.coli 说法正确的是（ A 、 B 、 C ） A ．λ DNA 重组体必须有效包装后才能有感染 E.coli 的活性。 B ．λ DNA 重组体包装要有头部蛋白、尾部蛋白的参与。 C ．λ DNA 重组体包装长度为野生型λ DNA 的 75~105% 。 D ．λ DNA 重组体是以双链环状形式导入 E.coli 。

E ．λ DNA 重组体用 CaCl2 法导入 E.coli 也能取得高转化率。

5 ．下列关于 CaCl2 处理获得感受态方法的说法正确的是（ A 、 B 、 C 、 D ） A ． DNA 与 Ca2+ 结合后吸附在细胞表面，该复合物可抵抗细胞表面的 DNAase 作用。 B ． DNA — Ca2+ 在 0 ℃时吸附于细胞表面，温度高或温度波动会大大降低转化效率。 C ．有可能将两种质粒转入同一细胞但最终选择板上的菌落只含一种质粒。 D ． 42 ℃热休克是为了让 DNA 进入感受态细胞。

E ．热休克后要 37 ℃温育 1 小时，目的是使含有外源 DNA 的细胞分裂 1~2 代，更易筛到重组子。三．填空题

1 ．感受态细胞是指 具有摄取外源 DNA 分子能力 的细胞。

2 ．λ噬菌体蛋白对重组 DNA 体外包装时，包装长度为野生型λ DNA 的 75~105% 。 3 ．感受态大肠杆菌细胞在温度为 0 ℃ 时吸附 DNA ， 42 ℃ 时摄入 DNA 。

4 ． CaCl2 法制备感受态细胞转化 DNA 时， DNA 以 DNA-Ca2+ 复合物形式吸附于细胞表面。

5 ．基因工程受体菌的基因型常为 r-m-rec-, r- 表示 限制缺陷型， m- 表示 修饰缺陷型 ，缺陷型。

rec- 表示重组 6 ． CaCl2 法制备感受态细胞转化 DNA 时，热休克的温度是 42 ℃。 7 ． E.coli 感受态出现的生理时期是 对数期。 四．简答题

1 ．简述在 CaCl2 法制备感受态细胞转化 DNA 时，影响转化效率的各种因素。

答：影响因素有： Ca2+ 浓度、 PH 值、感受态细胞活力、 DNA 浓度、 DNA 纯度和构象、温度、 DMSO 处理、还原剂处理、氯化六氨合高钴处理。

2 ． CaCl2 法制备感受态细胞转化 DNA 时，低温的主要目的是什么？热休克温度和目的是什么？

答：低温目的：（ 1 ）抑制细胞的旺盛生理代谢；（ 2 ）有助于 DNA — Ca2+ 吸附于细胞表面；（ 3 ）防止 DNAase 降解 DNA 。

热休克温度是 42 ℃；目的是使细胞摄入吸附于其表面的 DNA 。 3 ．简述利用 Cosmid 将外源 DNA 导入 E.coli 的特点是什么？

答：（ 1 ） Cosmid 大小为 4~6 kb ，可用常规 CaCl2 法直接导入 E.coli 扩增。

（ 2 ） Cosmid 含 cos 位点，是 DNA 包装到λ噬菌体蛋白颗粒中所需的 DNA 序列， cosmid/DNA 重组体需与λ噬菌体头、尾部蛋白混合体外包装后，才能导入 E.coli 。

（ 3 ）其包装长度为野生型λ噬菌体 DNA 的 75~105% ，可容纳较大片段（ 30~50kb ） DNA ，可用于建立真核细胞文库。

（ 4 ）只有重组体可包装，未重组 cosmid 不能包装，因而不能进入 E.coli 有利于克隆的筛选。

第三章习题

选择题

1. 关于 PCR 扩增停滞的原因有很多种，但下列各项中（ B ）项不是主要原因。

A. 底物（模板）过剩 B.dNTP 的大量消耗 C. 产物的聚集 D. 非特异性产物的竞争性抑制

2.Clark 作了一个有趣的实验，发现 TaqDNA 聚合酶可以不需要模板，在双链 DNA 的末端加一个碱基，主要是加（ B ）

A. dGTP B.dATP C.dCTP D.dTTP

3. 有简并引物的 3’ 端尽量使用具有简并密码的氨基酸，这是因为（ A ）

A. TaqDNA 聚合酶具有一定的不精确性 B. 便于排除错误碱基的掺入 C. 易于退火 D. 易于重组连接

4.PCR 实验的特异性主要取决于（ C ）

A.DNA 聚合酶的种类 B. 反应体系中模板 DNA 的量 C. 引物序列的结构和长度 D. 四种 dNTP 的浓度 E. 循环周期的次数

5. 有关 PCR 的描述下列哪项不正确：（ D ） A. 是一种酶促反应 B. 引物决定了扩增的特异性 C. 扩增的产量按 Y=m(1+X)n D. 扩增的对象是氨基酸序列 E. 扩增的对象是 DNA 序列

6. 有关 PCR 的描述下列哪项正确： (ABC) A.polymerase chain reaction 的字首缩写 B.1993 年获诺贝尔化学奖 C. 已广泛的应用于医学各学科 D. 能够准确对扩增模板定量 E. 以上都对

7.PCR 反应产物的特异性取决于 (E)

A 镁离子浓度 B 退火温度 C 引物碱基组成和长度 D 循环次数 E.A+B+C 填空

1.Clark 发现用 TaqDNA 聚合酶得到的 PCR 反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链 DNA 分子。根据这一发现设计了克隆 PCR 产物的 。

2. 在简并引物的设计中，常常要用到 dI （次黄嘌呤），原因是 。 3. 简并引物 PCR 主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计 引物来合成相应的基因。

4.SSC 是由 NaCl 和柠檬酸钠组成的试剂，其中 NaCl 的作用是使 ，而柠檬酸钠的作用是 。 KEY 1.T- 载体

2.dI 可以和任何载体相匹配 3. 一组混合

4.DNA 溶解；作为螯合剂抑制核酸酶的活性

简答题

1. 你打算扩增下图所示的两段序列之间的 DNA ，请从所列出引物中选出合适的一对， 5’-GACCTGTGGAAGC CATACGGGATTG-3’ 3’-CTGGACACCTTCG GTATGCCCTAAC-5’ 引物 1 引物 2 5’-GACCTGTGGAAGC 5’-CATACGGGATTG 5’-CTGGACACCTTCG 5’-GTATGCCCTAAC 5’-CGAAGGTGTCCAG 5’-GTTAGGGCATAC 5’-GCTTCCACAGGTC 5’-CAATCCCGTATG

答：引物 1 ： 5’-GACCTGTGGAAGC ； 引物 2 ： 5’-CAATCCCGTATG

2.PCR 反应包括引物与 DNA 模板链间的解链与复性。讨论循环温度范围对引物 -DNA 双螺旋稳定性的影响及对 PCR 产率的影响。

答：由于 GC 对间是三个氢键的作用力，比两个氢键作用力的 AT 对要稳定，因此 DNA 的解链与退火都是依赖于 G+C 的含量与 A+T 的含量的比例。 GC 对普遍比 AT 对更倾向于非特异性的复性，所以 GC 含量高的引物比 AT 含量高的引物更适合于 PCR 反应。

PCR 的基本原理是什麽？用 PCR 扩增某一基因，必须预先得到什麽样的信息？

（ 1 ） 利用 DNA 半保留复制的原理，在体外进行 DNA 的变性、复性和引物延伸。 （ 2 ） 至少要预先知道足够合成一对引物的靶 DNA 序列。

3. 何谓简并引物？简并引物设计的一般原则是什麽？

答：简并引物是指根据肽链的氨基酸序列（或部分序列），并充分考虑密码子的简并性而设计的，用于 PCR 扩增的混合

引物之间具有不同的碱基组成，但碱基数量是相同的。由于充分考虑了密码的简并性，在这种混合引物中必定有一种引物可以和该基因的 DNA 序列精确互补。 简并引物设计的一般原则是：

（ 1 ） 选择保守区设计简并引物；

（ 2 ） 选择简并性低的氨基酸密码区设计引物； （ 3 ） 注意密码的偏爱性；

（ 4 ） 使用尽可能短的引物，以降低简并性，最短可用 15~20 个碱基。

（ 5 ） 由于 TaqDNA 聚合酶在 PCR 扩增时容易掺入错误碱基，所以设计的引物，其 3’ 端尽量使用具有

简并密码的氨基酸。

4. 在古生物学中，尚不知道恐龙是否是温血爬行动物，而不像今天的变温爬行动物。假如你得到一些恐龙的 DNA ，你如何通过 PCR 和基因克隆来检测恐龙是否是温血爬行动物？

答：用 PCR 扩增恐龙的高度保守的酶的基因，然后将扩增的 DNA 克隆到大肠杆菌表达载体，每可能被合成。然后测定酶的最适温度和热的稳定性并与相应的温血动物（如鸟类）进行比较。来自于冷血动物的酶与来自于温血动物的酶相比，温血动物最适的温度范围较宽。

5.PCR 反应同大肠杆菌体内的 DNA 复制有哪些不同？你认为最根本的差别在哪里？ 答： PCR 用双引物，体内复制用单引物。

染色体 DNA 的提取

选择题

1. 基因组是：（ D ）

A ．一个生物体内所有基因的分子总量 B ．一个二倍体细胞中的染色体数 C ．遗传单位 D ．生物体的一个特定细胞内所有基因的分子总量

2. 下列关于酵母和哺乳动物的陈述哪些是正确的？（ ABD ）

A ．大多数酵母基因没有内含子，而大多数哺乳动物基因有许多内含子 B ．酵母基因组的大部分基因比哺乳动物基因组的大部分基因小 C ．大多数酵母蛋白比哺乳动物相应的蛋白小

D ．尽管酵母基因比哺乳动物基因小，但大多数酵母蛋白与哺乳动物相应的蛋白大致相同

3. 下列哪些基因组特性随生物的复杂程度增加而上升？（ ABD ）

A ．基因组大小 B ．基因数量 C ．基因组中基因的密度 D ．单个基因的平均大小

4. 细胞器 DNA 能够编码下列哪几种基因产物？（ ABCDE ） A ． mRNAB ．大亚基 rRNAC ．小亚基 rRNAD ． tRNAE ． 4.5SrRNA

5. 从细胞或组织中分离 DNA 时，常用蔗糖溶液，目的是：（ B ）

A. 抑制核酸酶的活性 B. 保护 DNA ，防止断裂 C. 加速蛋白质变性 D. 有利于细胞破碎

6. 用 SDS- 酚来抽提 DNA 时， SDS 的浓度是十分重要的，当 SDS 的浓度为 0.1% 时：（ B ）

A. 只能将 DNA 抽提到水相 B. 只能将 RNA 抽提到水相 C. 可将 DNA 、 RNA 一起抽提到水相 D.DNA 和 RNA 都不能进入水相

7. 变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于 DNA 分离，原因主要是：（ A ） A. 氧化物可使 DNA 的磷酸二酯键断裂 B. 氧化物同 DNA 形成复合物 C. 氧化物会改变 pH 值 D. 氧化物在 DNA 分离后不易除去

8. 在分离 DNA 时，异戊醇的作用是：（ D ）

A ．使蛋白质脱水 B ．使 DNA 脱水 C ．帮助 DNA 进入水相； D ．减少气泡，促进分相 填空题

1. 酚是蛋白变性剂用酚抽提细胞 DNA 时，具有两方面的作用：（ 1 ） （ 2 ）

2. 用酚 - 氯仿抽提 DNA 时，通常要在氯仿或酚 - 氯仿中加少许异戊醇，这是因为：异戊醇

。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的水相，中间的变性蛋白及下层有机溶剂相维持稳定。

3. 同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶 K 具有两个显著的优点：（ 1 ） （ 2 ） 。

4. 在分离 DNA 时要使用金属离子螯合剂，如 EDTA 和柠檬酸钠等，其目的是

5. 用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在 DNA 溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 、 NaAc ，其目的是 。

6. 浓缩 DNA 的方法有（ 1 ） （ 2 ） （ 3 ） （ 4 ） 。

7. 通常可在三种温度下保存 DNA ： 4~5 ℃， -20 ℃， -70 ℃，其中以 最好。

8. 用于分离质粒 DNA 的细菌培养浓度达到 0.8 ? 109 细胞 /ml 时，即通过离心收集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以 为宜。

9. 在用 SDS 分离 DNA 时，要注意 SDS 的浓度， 0.1% 和 1% 的 SDS 的作用效果是不同的，前者 ，后者 。

10. 在 DNA 分离过程中，通常要进行透析，其目的是 。

11. 在 DNA 分离过程中造成 DNA 分子断裂的因素很多，主要有（ 1 ） （ 2 ） （ 3 ） 。

12. 在 DNA 分离过程时，常用（ 1 ） （ 2 ） （ 3 ） （ 4 ） 等方法去除蛋白质。 13. 在 DNA 保存液中，常加一滴氯仿，主要是起 的作用。

14. 在分离 DNA 时，要戴手套操作，原因是 。 15. 乙醇沉淀 DNA 的原理是 。 填空题答案：

1. （ 1 ）使蛋白质变性；（ 2 ）由于它能使蛋白质变性，故也能使核小体和核糖体解聚，释放出 DNA 和 RNA ，提高 DNA 的得率。

2. 是一种有机试剂，可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

3. （ 1 ）水解能力很强，作用范围广；（ 2 ）在 SDS 和 EDTA 中保持高活性，可以同 SDS 和 EDTA 同时使用。 4. 螯合 Mg2+ ，抑制核酸酶的活性。

5. 中和 DNA 分子的负电荷，增加 DNA 分子间的凝聚力。

6. （ 1 ）包埋吸水法 （ 2 ）蒸发 （ 3 ）膜过滤法 （ 4 ）有机溶剂抽提法 7. -70 ℃ 8.8000rpm

9. 只将 RNA 分离出来；可将 DNA 与 RNA 一起分离出来。 10. 除去小分子的无机离子。

11. （ 1 ）核酸酶降解；（ 2 ）化学降解；（ 3 ）物理减切 12. （ 1 ）酸变性；（ 2 ）碱变性；（ 3 ）热变性；（ 4 ）酶水解 13. 抑制真菌污染 14. 手上常有核酸酶 15. 乙醇使 DNA 分子脱水 简答题

1. 溶菌酶是破碎细菌细胞的有效方法，但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理？ 答：添加 DTT 、 ? - 巯基乙醇，或 8.0mol/L 的尿素等增加敏感性。

2. SDS 是分离 DNA 时常用的一种阴离子除垢剂，它在这里的主要作用是什麽？

答：（ 1 ）溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；（ 2 ）溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；（ 3 ）对 RNase 、 DNase 有一定的抑制作用；（ 4 ） SDS 能够与蛋白质结合形成 R-O-SO3-?R- 蛋白复合物，使蛋白质变性沉淀。

3. 比较基因的大小和基因组复杂性的不同：

一个基因组有两个序列，一个是 A ，另一个是 B ，各有 2000bp 长，其中一个是由 400bp 的序列重复 5 次而成，另一个则由 50bp 的序列重复 40 次而成，问：

（ 1 ） 这个基因组的大小怎样？ （ 2 ） 这个基因组的复杂性如何？

答：基因组的大小是指在基因组中 DNA 的总量。复杂性是指基因组中所有单一序列的总长度。这个基因组的大小为 4000bp ；复杂性为 450bp 。

4. 从细菌中分离总 DNA ，应采取哪些措施获得高分子量的 DNA ？ 答：添加酶抑制剂抑制核酸酶活性，温和操作，加保护剂等。 用于克隆的 DNA 在质量上有什麽要求？

答：（ 1 ）首先是稳定性：保持 DNA 的高分子量和原有的构型。 （ 2 ）低蛋白质含量

（ 3 ） DNA 样品中应不含 RNA （ 4 ）不含可透析的小分子

5. 为什么从细胞中分离 DNA 时往往会断裂？

答：（ 1 ）细胞内存在很高的核酸酶活性， DNA 裸露后，很容易遭到核酸酶的降解； （ 2 ）在分离 DNA 的过程中，要用到一些酸碱等化学试剂，也会使 DNA 断裂；

（ 3 ）在 DNA 的分离过程中要经过多次离心、吸取、转移等，产生的机械张力剪切会使 DNA 断裂。

实验习题

一、 填空

1 ．质粒提取中细菌的裂解可采用多种方法，包括： 非离子型或离子型去圬剂 ， 有机溶剂 ， 碱 或 加热 处理。 2 ．用于分离质粒 DNA 的细菌培养浓度达到 0.8 × 10 9 细胞 /ml 时，即可通过离心收集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以 8000r/min 为宜。

3 ．在分离质粒 DNA 的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处： 可以扩增质粒 DNA ； 抑制了菌体的数量，有利于裂解 。

4 ．常使用的质粒纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小 和 共价闭合环状 两个性质。

5 ．由于不同构型的 DNA 插入 EB 的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 DNA （ SC ）的泳动速度 最快 ，一条链断裂的开环状质粒 DNA （ OC ）泳动速度 最慢 ，二条链断裂的线性 DNA （ L ）居中，通过凝胶电泳和 EB 染色的方法可将不同构型的 DNA 分别开来。

6 ．超离心法纯化质粒 DNA 时，选用 CsCl 作介质的优点是： CsCl 与不同 DNA 起反应 ； CsCl 可以自动形成密度梯度 ，从而使不同分子量的 DNA 分子得以分开。

7 ． SDS 是分离 DNA 时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用： 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂 ； 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来 ； 对 RNase 、 Dnase 有一定的抑制作用 ； SDS 能够与蛋白质结合形成 R 1 -O-SO 3 - ? R 2 + - 蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀 。 8 ．碱裂解法所用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的体积比为： 2:4:3

9 ．质粒提取中溶液Ⅱ的主要成分为 SDS 和 NaOH 。

10 ． 溶液Ⅲ中钾是 3 mol/L ，乙酸根是 5 mol/L 11 ． LiCl 可沉淀 大量蛋白质 和 高分子 RNA 。 12 ． 1OD 260 = 50 μ g 质粒 DNA/ml 。

13 ． 在碱变形法提取质粒 DNA 实验中，聚乙二醇用于 沉淀 质粒 DNA 。 14 ． 残留在 DNA 样品中的酚可 抑制 酶的活性。

15 ． 质粒 DNA 提取中酚的 pH 值范围是 pH7.8 ～ pH8.0 。

16 ． 乙醇沉淀核酸的沉淀混合液中常用的单价阳离子的类型有： 乙酸铵 、 氯化钠 和 乙酸钠 。 17 ． SSCP 电泳方式为 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 。

18 ． SSCP 是依据 点突变引起单链 DNA 分子立体构象的改变 来实现电泳分离的。 19 ． 影响 SSCP 重复性的主要因素为 电泳的电压 和 温度 。 20 ． SSCP 中使 DNA 双链起变性作用的试剂是： 甲酰胺

21 ． 点突变对 SSCP 检出率的影响不仅仅取决于该点在 DNA 链上的位置，更取决于 该位置对维持立体构象作用的大小 。 二、 选择

1 ．质粒提取中溶液Ⅱ的主要成分为： B A. SDS 和 EDTA B. SDS 和 NaOH C. EDTA 和 NaOH D. SDS 和冰乙酸

2 ．分离质粒 DNA 时，用蔗糖的目的是： B A. 抑制核酸酶的活性 B. 保护 DNA ，防止断裂 C. 加速蛋白质变性 D. 有利于细胞破碎

3 ．关于碱解法分离质粒 DNA ，下面哪一种说法不正确？： D A. 溶液Ⅰ的作用是悬浮菌体 B. 溶液Ⅱ的作用是使 DNA 变性 C. 溶液Ⅲ的作用是使 DNA 复性

D. 质粒 DNA 分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性

4 ．质粒 DNA 提取中酚的 pH 值范围： D A. pH6.5 ～ pH7.0 B. pH8.0 ～ pH8.5 C. pH6.8 ～ pH7.0 D. Ph7.8 ～ pH8.0

5 ． CsCl-EB 密度梯度离心法纯化质粒 DNA 的原理是： C A. 氯化铯可以较多地插入到线状 DNA 中去 B. 氯化铯可以较多地插入到 SC DNA 中去 C. EB 可以较多地插入到线状 DNA 中去 D. EB 可以较多地插入到 SC DNA 中去

6 ．同一种质粒 DNA ，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：A. OC DNA>SC DNA>L DNA B. SC DNA>L DNA>OC DNA C. L DNA>OC DNA.SC DNA D. SC DNA>OC DNA>L DNA

7 ．用碱法分离质粒 DNA 时，染色体 DNA 之所以可以被除去，是因为： C A. 染色体 DNA 断成了碎片

B. 染色体 DNA 分子量大，而不能释放 C. 染色体变性后来不及复性 D. 染色体未同蛋白质分开而沉淀 8 ． 1OD 260 相当于每毫升质粒 DNA ： A A. 50 μ g B. 100 μ g C. 50ng D. 100ng

9 ．加入溶液Ⅲ后出现的白色絮状沉淀不包括： A A. 质粒 DNA 和小分子量 RNA B. 染色体 DNA 和高分子量 RNA C. 钾离子和 SDS D. 蛋白质和细胞膜

B

10 ． SSCP 电泳方式为： D A. 普通琼脂糖凝胶电泳 B. 低熔点琼脂糖凝胶电泳 C. 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 D. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

11 ． SSCP 中使 DNA 双链起变性作用的试剂是： B A. EDTA B. 甲酰胺 C. 溴酚兰 D. Tris-HCl

12 ． SSCP 分离单链 DNA 片段是依据： B A. 单链 DNA 分子量大小

B. 单链 DNA 片段空间构象的立体位阻大小 C. 单链 DNA 带电量的大小

D. 单链 DNA 分子量和带电量的大小 三、 是非

1 ．迄今发现的质粒都是环状的。（错）

2 ．质粒 DNA 提取时，溶液Ⅱ需新鲜配置。（对）

3 ．如果溶菌酶溶液中 pH 值低于 8.0 ，溶菌酶就不能有效发挥作用。（对） 4 ．碱法和煮沸法分离质粒 DNA 的原理是不同的。（错）

5 ． CsCl-EB 密度梯度离心法纯化 SC DNA 原理是根据 EB 可以较多地插入到 SC DNA 中，因而沉降速度较快。（错） 6 ．酚法和碱法分离质粒 DNA 都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对）

7 ．氯霉素扩增 DNA 时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够，加入时间过迟，菌龄过老，容易自溶。（对）

8 ．碱法和煮沸法分离质粒 DNA 的原理是不同的。（错）

9 ．酚法和碱法分离质粒 DNA 都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对） 10 ． SSCP 对长链 DNA 或 RNA 的点突变检出率要比短链的高。（错） 11 ． SSCP 分析中非变性 PAG 电泳分离不能反映出分子量的大小。（对） 12 ． SSCP 可以检测出所有的单点突变。（错）

13 点突变对 SSCP 检出率的影响取决于该点在 DNA 链上的位置，点突变在 DNA 链中部要比在近端部容易被 SSCP 检测出来。（错）

四、 简答

1 ．简述溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所包含成分及生化作用原理

溶液Ⅰ含葡萄糖和 EDTA ，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止 DNA 受机械作用而降解。 EDTA 可螯合 Mg 2+ 、 Ca 2+

等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用（ Dnase 作用时需要一定的金属离子作辅基），另外， EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

溶液Ⅱ含 NaOH 和 SDS ，核酸在 pH 大于 5 小于 9 的溶液中是稳定的，但当 pH 大于 12 或小于 3 时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的 NaOH 浓度为 0.2N ，加入抽提液液时，该系统的 pH 就高达 12.6 ，因而促使染色体 DNA 与质粒的变性。 SDS 是离子型表面活性剂，它主要功能有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白； SDS 能与蛋白质结合成为 R 1 -O-SO 3 - ? R 2 + - 蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用 Rnase 去除 RNA 时）受到干扰。

溶液Ⅲ是 NaAc-Hac 的缓冲液（ pH4.8 ）。用 pH4.8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12.6 的抽提液 pH 调回中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而高盐的 3MnaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA 、 RNA 以及 SDS- 蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与 SDS- 蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

2 ．小量制备质粒 DNA 时发现质粒 DNA 不能被限制酶所切割，分析可能原因及解决办法。

由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去除干净导致。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质，如果总是依然存在，可用离心柱纯化 DNA 。 3 ．溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理？

添加 DTT 、β - 巯基乙醇，或 8.0mol/L 的尿素等增加敏感性。 4 ．从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。

方法是先用酚：氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。原理：使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除去核酸制品中残量酚。（此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制 RNA 酶的活性，它还能溶解带有长 poly （ A ）段的 RNA 分子。使用酚：氯仿：异戊醇（ 25:24:1 ）混合液可以使这两个问题迎刃而解，）

5 ．在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.1-0.25M?

在 pH 为 8 左右的 DNA 溶液中， DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc 或 NaCl ，使 Na+ 中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 6 ． LiCl 在质粒 DNA 提取中的作用是什么？

沉淀大量蛋白质和高分子 RNA 。 7 ．简述 PCR-SSCP 基本过程。 1) PCR 扩增靶 DNA ；

2) 将特异的 PCR 扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链 DNA 分子； 3) 将适量单链 DNA 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；

4) 最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果，若发现单链 DNA 带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可

以判定该链构象发生改变，进而推断 DNA 片段中有碱基突变。

8 ．简述 RNA-SSCP 的基本原理。

RNA 有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达 90% 以上。另外， RNA 不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色。 9 ． SSCP 图谱一般是二条单链 DNA 带，有时可能只呈现一条 SSDNA 带或三条以上的原因是什么？

主要是由于两条单链 DNA 之间存在相似的立体构象，有时三条以上的 SSCP 图谱是由于野型 DNA 片段和突变型 DNA 片段共同存在的结果。

10 ．分子量相同的超螺旋环状、带切口环状和线状 DNA 在凝胶中迁移率大小顺序是什么？

超螺旋环状 DNA 迁移最快，其次为线状 DNA ，最慢为带切口环状 DNA 。 11 ． 影响 DNA 迁移率的因素有哪些？

影响 DNA 迁移率的因素有： DNA 分子的大小，琼脂糖浓度， DNA 的构象，所加电压，温度，嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。

基因工程复习题

2007年05月16日 星期三 21:36 基因工程复习题

1。举例说明基因工程的基本操作过程。

所谓基因工程，就是在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源性（DNA）基因在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地表达遗传给下一代的过程。

（例子自己找,多的是）

2.基因工程的研究意义和作用

基因工程在农业、林业、医药、食品、环保等行业和领域的研究和应用都取得了很大的进步，既为工农业生产和医药卫生等开拓了新途径，又给高等生物的细胞分化、生长发育、肿瘤发生等基础研究提供了有效的实验手段。在传统工业中，基因工程的运用可降低损耗、提高产量，同时不能减少污染，如今生物工业成为现代产业革命的重要组成部分。在农业生产中，转基因植物在抗病毒、抗虫、抗除草剂和品种改良等方面都取得了引人注目的成果，有的已被广泛应用于生产实践，使得相关农作物的产量得以显著提高。在生命科学领域，人们可以利用基因工程技术探明致病基因的结构和功能，了解其致病机制；建立基因诊断、治疗技术、并已开发出基因工程药物和疫苗广泛应用于临床，为疾病的预防、治疗提供了新方法，给患者带来了福音。

3.1 凝胶电泳的原理

凝胶电泳技术的原理是，在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。前者由DNA分子所带电荷量的多少而定，后者主要与DNA分子的大小及构型有关。DNA分子在通常使用的缓冲液中带负电，在电场中向正极移动。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系，大分子质量的DNA在电泳时比小分子质量的DNA移动得慢，这样我们能将不同大小的DNA分开。如将已知含有不同大小DNA片段的标准样品作电泳对照，那么可以在电泳后估计或计算出待测样品的分子质量。

PCR技术的原理

PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重

复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

DNA芯片原理

基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)，是指固着在固相载体上的高密度的DNA微点阵。就是将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地排列在如硅片、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上，这就是基因芯片。一套完整的基因芯片分析系统包括芯片阵列仪、激光扫描仪、计算机及生物信息软件处理系统等。

基本原理：用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织的mRNA分别标记制成探针，将探针混合后与芯片上的DNA片段进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，再通过计算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。

基因文库包括基因组文库和cDNA文库

基因组文库：从供体生物制备基因组DNA，并用限制性内切酶切割生成适于克隆的DNA片段，然后在体外将这些DNA片段同适当的载体连接成重组体分子，并转入到大肠杆菌的受体细胞中去。

DNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。

与基因组DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其间隔序列早已在拼接过程中被删除，而由这种成熟mRNA为模板转变而来的DNA基因，自然也不含有非编码序列。cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外，其构建比较简易可行，而且由于每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的概率也就较低。

基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受调控影响。cDNA文库编码的是不完全的编码DNA序列，因此受发育和调节因子的影响。

核苷酸测序有哪些方法，试述原理。

Sanger法是目前最常用的方法，也称酶法。在测序用的缓冲液中含有四种（2-脱氧的）dNTP及聚合酶。测序时分成四个反应，在每个反应中除上述成分外分别加入2，3-双脱氧的A，C，G，T核苷三磷酸ddNTP （即ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTP）。在第一个反应物中，ddATP会随机地代替dATP参加反应。一旦ddATP加入新合成的DNA链，由于其3位的羟基变成了氢，所以不能继续延伸。第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了；同理，第二个反应产生的都是以C结尾的，第三个反应的都以G结尾，第四个反应的都以T结尾，电泳后就可以读出序列了。

Maxam-Gilbert法：一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 鸟枪法测序的操作方法

1. 用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA, 并用Agarose凝胶电泳进行回收。

2. 对回收的大片段DNA用物理方法 (如超声波等) 进行切断处理，然后用T4 DNA Polymerase对小片段 DNA进行末端平滑化。

3. 进行Agarose电泳，切胶回收1 kbp ~ 2 kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的 3'端加上一个A碱基。

4. 把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。 5. 对阳性克隆（含1 kbp ~ 2 kbp Insert）进行DNA测序。 6. 对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。

Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:

(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。

(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。

(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。

应用Southern杂交技术，可产生和获得反映生物个体或群体特异性的RFLP图谱。

PCR技术应用

（一）遗传病的基因诊断

目前已有近百种遗传病可用PCR技术进行诊断和产前诊断。用PCR对遗传病进行诊断的前提是对致病基因的结构必须部分或全部清楚。

.如利用PCR-RFLP或Amp-FLP对遗传病家系进行连锁分析，进而作出基因诊断。 （二）传染病诊断

PCR已应用于多种病原体的特异性检测和鉴定

病原体基因扩增常用于检测及鉴定微生物，评价治疗反应和检测耐药性突变等。对感染性疾病的评价PCR已证明在许多情况下较传统方法更为优越，尤其是在鉴定不易培养，生长缓慢或不能培养的病原体时候，PCR可以快速（1~2小时内）提供诊断结果，并能同时分析多种样品；同时PCR不受药物治疗的干扰，可在治疗开始后确定感染原，为用药提供可靠的参考 1、病毒：如HBV，HCV，HIV，HPV等。

2、致病菌：如淋球菌、结核杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体等； （三）肿瘤基因诊断

1、原癌基因和抑癌基因突变，如ras,p53；癌基因扩增和表达分析。 2、利用微卫星不稳定性，直接诊断肿瘤，如膀胱癌等；

3、分析白血病（如CML）中异常染色体易位，检测微小残留病变（Minimal residual disease，MDR） 4、肿瘤多药耐药性（multi-drug resistance,MDR）检测 5、端粒酶活性检测

杂交组织化学是运用核酸分子间碱基互补的性质，并结合组织化学和免疫组织化学技术，在组织切片上显示特异性核酸（DNA或RNA）片段的一种技术。由于该反应是在组织（细胞）原位，通过核酸分子探针与靶核酸间的互补杂交来实现的，故又称原位分子杂交。原位核酸分子杂交技术简称原位杂交，是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物带一定颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。原位杂交临床应用在细胞遗传学、产前诊断、肿瘤和传染性疾病的诊断、生物学剂量测定和病毒学的病原学诊断等。

苏州大学基因工程（02级生物技术专业）试题（A卷）

（2005.12）

姓名 学号 得分

一 名词解释（4分/题，共20分）

1． 重叠基因

2．.锌指结构

3．.ScFv

4．.基因置换

5．基因敲除

二 填空题 （3分/题，共15分）

1. 细菌的移动基因存在着三种类型的转位因子包括 、 、 。

2. Klenow酶在 情况下，呈现DNA聚合酶活性，在 情况下呈现外切酶活性。

3. 外源基因在原核细胞中表达，常用的启动子有 、 、 、

、 。

4. 在LacI标记基因插入外源基因，经IPTG诱导，在X-gal培养基中显 色，

为 克隆，未插入基因的克隆显 色，为 性克隆。

5. 基因序列经碱基替代，缺失或插入后，可使遗传信息产生三种不同的后果，分别为 、 、 。

三 是非判断题 （2分/题，共10分）

1.DNA连接酶是一种能催化二条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，因此该酶既可修复基因序列中的缺口，也可修复裂口。

（ ）

2.质粒提取后，在琼脂糖电泳出现一条带时说明质粒提取纯度高，当为三条带时为纯度不高。

（ ）

3．COS位点，COS质粒，COS细胞它们均含有用于自身环化的12个碱基的互补粘性末端。

（ ）

4.入噬菌体的插入型载体只有一个单一限制酶切点，替换型载体有2个成对的限制性酶切点。

（ ）

5.原核细胞和真核细胞转录的mRNA均具有与rRNA结合的SD序列，以利于进行有效的转录。

（ ）

四．不定项选择题（3分/题，共15分）

1. 下列生物体的细胞基因组哪些会有断裂基因 （ ）

A.动物 B.人 C.细菌 D.噬菌体

2. 真核细胞基因表达的特点为 （ ）

A.单顺反子 B.多顺反子 C.转录和转译连续进行 D .转录和转译分开分步进行

3. 识别基因序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同的一类酶为 （ ）

A.同工酶 B.同尾酶 C.同裂酶 D.同位酶

4. pBR322质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件 （ ）

A.AmPr和Tetr B.ori复制子 C.LacZ标记 D.多克隆位点

5. λ噬菌体外包装目的基因片段的大小应为 （ ）

A.小于λ噬菌体DNA的50% B. 小于噬菌体DNA的75% C.大于λ噬菌体DNA的105% D.为λ噬菌体DNA的75%～105%

五 问答题 （8分/题，共40分）

1 真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？

2 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？

3 真核表达调控的顺式作用元件有哪些？其作用特点是什么？

4 基因工程疫苗研究开发应遵循的原则是什么？

5 有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。

基因工程原理-山西师范大学期末考试试题（卷） 2008-02-18 01:24

院系：密 封 山西师范大学期末考试试题（卷）

_____________ 专线 密

2006—2007学年第一学期 业：封 线 以 内 不

_______________ 班准 作 任 何 标

_生命科学学院 专业：_生物技术 考试科目：_基因级：_________ 学记 密院系：

工程原理_ 试卷号： B 卷 号：___________ 姓封 线

题 号 一 二 三 四 五 六 七 八 总分 名：_____________

分 数 评卷山 西 师 范 大 学

人 2006——2007 学 年 第 一

复查学 期 期 末 考 试 试 题

人 （卷）

一、名次解释（解释并翻译下列名词术语，每题4分，共20分）

1．魔斑： 2．转导与转染： 3．RNA干扰： 4. 融合蛋白： 5．考斯质粒：

二、说明下列各项在基因工程中的主要作用或功能（每题2分，共10分） 1. 核酶： 2. DNA探针： 3. Klenow酶： 4.分子克隆： 5.载体：

三、分别说出5种以上RNA的功能？（10分）

四、对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？（10分） 五、说明双脱氧链终止法（Sanger法）测定DNA一级结构的原理与方法？（10分）

六、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？（10分） 七、基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。（10分）

八、在PCR扩增时，（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么？有何对策？（2）PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么？应该如何改进？（20分） 山西师范大学期末考试答案及评分标准

山 西 师 范 密 封

大 学 线 密

2006—2007学年第一学期 2006——2007 封 线 以 内 不

学 年 第 一 准 作 任 何 标

__生命科学学院_ 专业：_生物技术 考试科目：_基因工程 试卷学 期 期 末 记 密院系：

号： A 卷 考 试 试 题 封 线

一、名次解释（解释并翻译下列名词术语，每题4分，共20分） （卷）

1．载体：vector，能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。

2．不相容性：incompatibility，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能共存于同一宿主细胞内。

3．cDNA基因文库：cDNA library，是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。

4．环腺苷酸受体蛋白.：cAMP receptor protein，CRP，cAMP与CRP结合后 所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 5．核酶：ribozyme，具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。

二、说明下列各项在基因工程中的主要作用或功能（每题2分，共10分） 1 SD序列：是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。.

2. Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’ 3’外切酶活性

3. 蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。

4. 互补干扰RNA：micRNA，或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。

5. 限制性内切核酸酶：常简称为限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列并由此切割DNA双链结构的水解酶。

三、典型的DNA重组实验通常包含几步？（10分）

①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。

②将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。 ③对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。

④对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。 四、PCR的基本反应过程包括哪些？反应体系需要什么条件？（10分） PCR的基本反应过程包括：变性、退火、延伸三个阶段。（5分）

需要具备的反应条件包括：a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的 DNA引物（约20个碱基左右）。b、具有热稳定性的酶如：TagDNA聚合酶。c、dNTP。d、作为模板的目的DNA序列。（5分） 五、植物遗传转化技术分为几类？分别举例说明。（10分）

按照基因引入受体植物细胞的方法，植物遗传转化技术大体可分为两类（2分）：

以载体为媒介的基因转移：就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将个源基因转入植物细胞的技术，如农杆菌介导的转化。（4分）

基因或DNA的直接转移：DNA的直接转移是指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术，如电激和电注射法、基因枪法、微注射法等。（4分）

六、分子克隆常用载体有哪些？它们都具备什么样的基本条件？根据DNA分子克隆的目的，载体可分为哪几类？（10分）

目前所用的载体有细菌的质粒(如大肠杆菌质粒)、噬菌体或病毒，更多的是经过人工改造的一些载体。（3分）

用于分子克隆的载体都应具备下述条件：① 在细胞内能自主复制，即具有复制原点，可以使所携带的外源DNA在受体细胞内忠实地复制； ② 有适宜的限制酶切位点。最好是对多种限制酶有单一切点，且酶切位点不在复制原点内。 ③具备对重组体易于检测的选择性遗传标记。 （4分） 根据DNA分子克隆目的，载体可分为克隆载体、穿梭载体和表达载体三类。（3分） 七、对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？（10分）

天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建： a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。（2分） b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 （2分）

c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。（2分） d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。（2分） e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。（2分）

八、PCR反应条件最关键的是温度、时间和循环数的选择，应该注意什么？（20分）

首先是温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃退火，然后快速升温至70～75℃使引物链沿模板延伸。

①变性温度与时间：变性温度低则解链不完全。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。（5分）

②退火(复性)温度与时间：变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。 退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。（5分）

③延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。（5分）

其次是循环次数的设置。循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。（5分）

山 西 师 范 密 封 山西师范大学期末考试答案及评分标准 大 学 线 密

2006—2007学年第一学期 2006——2007 封 线 以 内 不

学 年 第 一 准 作 任 何 标

__生命科学学院_ 专业：_生物技术 考试科目：_基因工程 试卷学 期 期 末 记 密院系：

号： B 卷 考 试 试 题 封 线

一、名次解释（解释并翻译下列名词术语，每题4分，共20分） （卷）

1．魔斑：magic spot，当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号

是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。

2．转导与转染：转导，transduction，指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。转染，transfection，指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。

3．RNA干扰：RNA interference, RNAi，是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制范畴。

4. 融合蛋白：fusion protein，真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。 5．考斯质粒：cosmid，是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。

二、说明下列各项在基因工程中的主要作用或功能（每题2分，共10分） 1. 核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。

2. DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。

3. Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’ 3’外切酶活性。

4.分子克隆：在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。

5.载体：能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。 三、分别说出5种以上RNA的功能？（10分） 1）转运RNA tRNA 转运氨基酸 （2分）

2）核蛋白体RNA rRNA 核蛋白体组成成 （2分） 3）信使RNA mRNA 蛋白质合成模板 （2分） 4）不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体 （2分） 5）小核RNA snRNA 参与hnRNA的剪接（2分）

6）小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分 7）反义RNA anRNA/micRNA 对基因的表达起调节作用 8）核 酶 Ribozyme RNA 有酶活性的RNA

四、对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？（10分）

天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建： a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。（2分） b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 （2分）

c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。（2分） d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。（2分） e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。（2分）

五、利用双脱氧末端终止法（Sanger法）测定DNA一级结构的原理与方法？（10分）

原理是采用核苷酸链终止剂—2，，3，-双脱氧核苷酸终止DNA的延长。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的3-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。 （6分）

方法是分成四组分别为ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反应后，聚丙烯酰胺凝胶电泳按泳带可读出DNA序列。 （4分）

六、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？（10分）

a、提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。 （3分）

b、将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。 （2分） c、对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。 （3分）

d、对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。（2分） 七、基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。（10分）

1）抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选 或PCR筛选、差式筛选、DNA探针 （2分） 2）多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。（3分）

3）在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。 如pUC质粒含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。（5分）

八、在PCR扩增时，（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么？有何对策？（2）PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么？应该如何改进？（20分）

（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+

离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。（5分）

其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。（5分） （2） PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。（5分）

其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数。（5分）

苏州大学基因工程(02级生物技术专业)试题(A卷) (2005.12)

姓名 学号 得分

一 名词解释(4分/题,共20分) 重叠基因

不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用,将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因 2..锌指结构

由两个半胱氨酸(Cys)残基和两个组氨酸(His)残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构, 并以锌辅基敖合形成的环状结构作为活性单位, 在指状突出区表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关 3..ScFv

它是由抗体重,轻链的可变区基因(VH,VL)之间通过一段编码连接肽基因,拼接后表达形成的重组蛋白.是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段,可在一些不需Fc段效应功能的实际应用中开展研究和应用.其优点是分子量小,易于穿透组织到达靶器官发挥功效,易于构建和生产,但易于被清除. 4..基因置换

是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换,使致病基因永久地得到更正. 5.基因敲除

基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变的基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术. 二 填空题 (3分/题,共15分)

1. 细菌的移动基因存在着三种类型的转位因子包括 插入序列 , 转位子 ,噬菌体Mu和D108 . 2. Klenow酶在 有 dNTP 情况下,呈现DNA聚合酶活性,在 没有dNTP 情况下呈现外切酶活性. 3. 外源基因在原核细胞中表达,常用的启动子有 乳糖启动子 ,Trp启动子 , Tac启动子 ,噬菌体的PL和PR启动子 , 脂蛋白启动子 .

4. 在LacI标记基因插入外源基因,经IPTG诱导,在X-gal培养基中显白 色,为 阳性 克隆,未插入基因的克隆显 蓝 色,为 阴 性克隆.

5. 基因序列经碱基替代,缺失或插入后,可使遗传信息产生三种不同的后果,分别为 同义突变 , 错义突变 ,无义突变 .

三 是非判断题 (2分/题,共10分)

1.DNA连接酶是一种能催化二条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶,因此该酶既可修复基因序列中的缺口,也可修复裂口. ( × )

2.质粒提取后,在琼脂糖电泳出现一条带时说明质粒提取纯度高,当为三条带时为纯度不高.( × ) 3.COS位点,COS质粒,COS细胞它们均含有用于自身环化的12个碱基的互补粘性末端.(× )

4.入噬菌体的插入型载体只有一个单一限制酶切点,替换型载体有2个成对的限制性酶切点.(√ ) 5.原核细胞和真核细胞转录的mRNA均具有与rRNA结合的SD序列,以利于进行有效的转录.(× ) 四.不定项选择题(3分/题,共15分)

1. 下列生物体的细胞基因组哪些会有断裂基因 ( AB ) A.动物 B.人 C.细菌 D.噬菌体

2. 真核细胞基因表达的特点为 ( AD )

A.单顺反子 B.多顺反子 C.转录和转译连续进行 D .转录和转译分开分步进行 3. 识别基因序列不同,但酶切后产生的粘性末端相同的一类酶为 ( B )

A.同工酶 B.同尾酶 C.同裂酶 D.同位酶

4. pBR322质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件 ( ABD ) A.AmPr和Tetr B.ori复制子 C.LacZ标记 D.多克隆位点 5. λ噬菌体外包装目的基因片段的大小应为 ( D ) A.小于λ噬菌体DNA的50% B. 小于噬菌体DNA的75%

C.大于λ噬菌体DNA的105% D.为λ噬菌体DNA的75%～105% 五 问答题 (8分/题,共40分)

真核细胞基因组中的基因常有内含子存在,能否在原核细胞中表达 能,为什么不能,为什么

不能,因为原核细胞缺乏对真核基因中内含子的剪接功能和转录后加工系统.原核生物必须有相应的原核RNA聚合酶可识别原核细胞的启动子, 以催化RNA的合成.

基因表达是以操纵子为单位,操纵子由数个相关的结构基因和调控功能的部位组成的.因此在构建原核表达载体时必须有1个强的原核启动子及其两侧的调控序列.

质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率

目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶(如EcoRI)消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末端, 称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端 ⑴ 高背景

载体经单一限制性核酸内切酶切割后, 载体分子易于自我环化, 既不利于目的基因的重组连接, 大大降低阳性克隆效率, 又可使非重组性载体造成高背景.为了防止载体的自我环化,通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5'-P以抑制DNA的自我环化.在连接反应中, 具有5'-P,的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接, 尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环, 但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复.如第二章图2-6 ⑵ 双向插入

经单一限制核酸内切酶(如EcoRI)切割的目的基因和载体, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在连接反应中, 目的基因可发生双向插入, 载体对目的基因表达是有方向的, 而目的基因可双向与之相连, 这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, 若以表达为目的, 我们就要对插入的片段进行方向鉴定, 因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的, 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA.若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体,可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组, 以便定向克隆.

真核表达调控的顺式作用元件有哪些 其作用特点是什么

顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列的DNA片段, 决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应,按功能可分为启动子,增强子,沉默子,衰减子和终止子等DNA序列片段. ⑴ 启动子

真核基因启动子是基因表达时与基因转录起始有关的5'端DNA序列,包括在-30bp区富含有AT的典型TATA盒(框)(TATA box)和在-70～-80bp区域(在TATA box上游)启动元件.前者是引导RNA聚合酶Ⅱ在正确起始位点转录mRNA所必需的DNA序列, 即保证转录的精确起始.后者UPE是调节转录起始频率和提高转录效率的调控序列,后者的序列常为GGTCAAT和GGGCCC序列, 称为GC box, 它们经协同作用,以调控基因的转录效率.

启动子的转录效率因细胞而异,因此需要根据宿主细胞的类型选择不同的启动子,以便真核基因的高效表达.常用的启动子有Rous肉瘤病毒启动子RSV和巨细胞病毒的启动子CMV.还有SV40早期启动子, 腺病毒的晚期启动子. ⑵ 增强子

增强子是使启动子的基因转录效率显著提高(增强转录活性)的一类顺式作用元件,其本身不具有启动子活性,是由多个独立的,具有特征性的核苷酸序列所组成.其基本的核心组件常由812bp组成, 以单拷贝或多拷贝串联的形式存在.增强子一般有以下特性:⑴增强子能提高同一条DNA链上基因转录的速率;⑵增强子对同源或异源基因都有效; ⑶增强子的位置可在基因5'上游,3'下游或内部; ⑷无方向性,增强子从5'→3'或是从3'→5'均可对启动子发挥作用; ⑸增强子可远离转录起始点; ⑹增强子一般无基因特异性, 对各种基因启动子均有作用, 但具有组织或细胞特异性.

典型的增强子首先发现于SV40的病毒中, 为SV40的早期基因增强子, 约200bp, 含2个72bp的重复序列, 位于早期启动子上游, 增强子可促使病毒基因转录效率提高100倍,因此具有这一增强子的载体已得到了广泛的应用.近些年来,来自于Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人类巨细胞病毒(CMV)增强子也已被广泛用于真核细胞的基因表达.

增强子能增强启动子的转录能力,有效的增强子能促进转录达10倍或100倍以上, 在某些情况下, 表达产物可能具有细胞毒效应.因此,最好使用一种可被外界刺激信号诱导表达外源基因的诱导型启动子, 诱导型启动子有热休克启动子,金属硫蛋白启动子,糖皮质激和固醇类激素诱导的启动子,热休克启动子的诱导可通过提高细胞的培养温度使启动子转录水平提高,重金属离子可有效地促进金属硫蛋白启动子的转录活性.

⑶ RNA剪接信号

多数高等的真核基因都含有内含子序列, 在细胞核内转录产生的前体mRNA要经过剪接过程去掉内含子顺序后才成为成熟的mRNA分子.虽然许多基因的cDNA转入哺乳类动物细胞后, 其表达不受有或无内含子的影响, 但有些基因在真核细胞中表达需要有内含子的存在.一般来说,在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序列的剪接信号, 以提供外源基因cDNA表达的需要.常用的内含子剪接序列有SV40的小t抗原的内含子序列等. ⑷ 负调控元件

沉默子和衰减子是抑制基因转录的DNA序列, 称为负调控元件, 它们与反式作用因子相互结合而起作用.这些负调控元件不受距离和方向的限制,并可对异源基因表达起作用. ⑸ 终止子和polyA信号

真核基因转录的确切终止信号和终止机制, 目前尚不清楚, 终止过程不是在RNA聚合酶指导下完成的, 在不明机制下发生转录终止.现在已发现模板DNA分子的3'端有转录终止信号序列, 称终止子.通常由转录产生的具有polyA尾的基因终止信号是在多聚腺苷酸化位点下游的一段长度为数百个碱基的DNA区域内的G/T簇, 例如在SV40中的AGGTTTTTT的DNA序列为终止转录调控元件.一般转录终止子为发夹结构的反向重复序列.现在基因工程表达载体上所使用的转录终止子都是病毒基因或细胞基因的3'端的一段序列, 其中也包括3'端不翻译区.如SV40小t抗原和β-球蛋白的转录终止片段常用于构建真核基因表达载体. 一般认为polyA的存在增加了mRNA分子的稳定性,使之能成功地进行翻译.准确而有效地进行多聚腺苷酸化需要两种序列:⑴位于polyA位点下游的GU丰富区或U丰富区; ⑵位于polyA位点上游的11～30个核苷酸处的一个由6个核苷酸组成的高度保守序列(5'-AAUAAA), 这些序列与转录后的RNA切割和加尾有关.最常用的polyA信号是用SV40的一段237kb的BamHI-BcLI酶切片段, 它包含早期和晚期转录单位的切割和加polyA信号, 两套信号分别位于不同的DNA链上, 作用方向相反, 它们对mRNA的加工都同样有效. 在双启动子的表达载体中,启动子的转录方向为同向时,上游启动的转录由于会穿过下游启动子,这样就使得下游的转录受到极大的影响,造成下游转录水平的下降,但是如果在两个启动子间插入一个转录终止子后,上游启动子对下游启动子的影响就被消除了,这样下游启动子的表达量会有明显提高.当两个启动转录方向相反时,基因表达可能会被转录形成的反义RNA所抑制, 这时插入转录终止子将会消除这种抑制作用. 基因工程疫苗研究开发应遵循的原则是什么

(1)不能或难于培养的的病原体如乙型肝炎病毒(HBV),丙型肝炎病毒(HCV),戊型肝炎病毒(HEV),EB病毒(Epstein-Barr病毒,EBV),巨细胞病毒(CMV),人乳头瘤病毒(HPV),麻风杆菌,疾原虫,血吸虫等.

(2)有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体,前者如1型嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV-I),人免疫缺损病毒(HIV),单纯疱疹病毒(HSV),还有EBV,CMV,HPV等.后者如呼吸道合胞病毒(RSV),登革热病毒(DGV),肾综合征出血热病毒(HFRSV);

(3)常规疫苗免疫效果差,如霍乱和痢疾菌苗;或者反应大,如百日咳和伤寒菌苗.

(4)能大大节约成本,简化免疫程序的多价疫苗,如以痘苗病毒,腺病毒,卡介苗或沙门氏菌为载体的多价活疫菌;

有哪几种反义核苷酸基因失活疗法 简述其原理.

将特异的反义基因重组到表达载体上(病态载体或质粒),导入靶细胞中转录出反义RNA,形成双链RNA(RNA/RNA双链体),阻碍基因的翻译.

人工合成寡聚脱氧核糖核酸(ODN)经过化学修饰导入细胞,与mRNA和DNA结合,形成RNA/DNA杂链或DNA核苷酸三聚体,影响基因的翻译或转录.

特异性的核酶,根据癌基因设计出特异的\锤头\或\发夹\结构,它能够催化切割,降解异常表达基因的mRNA而影响基因的翻译.

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