硅胶柱层析分离的实验原理法与技巧

硅胶柱层析分离的实验原理、方法与技巧

一、硅胶柱层析原理

硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得

到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物 质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸 过程。

硅胶柱层析流动相

极性小的用乙酸乙酯： 石油醚系统； 极性较大的用甲醇： 氯仿系

统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨 水或冰醋酸

硅胶柱层析惯用方法

1.称量。 200-300 目硅胶，称 30-70 倍于上样量；如果极难分，也可以用 100 倍量的硅胶 H。干硅胶的视密度在 0.4 左右，所以要称 40g 硅胶，用烧杯量 100ml 也可以。

2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。

果洗脱剂是石油醚 /乙酸乙酯 /丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂 是氯仿 /醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水 量太大，尤其是乙酸乙酯 /丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话， 必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去 1% 的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。

3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约

如

1/3 体积石油

醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。

随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入

柱中。

4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚， 用双联球或气泵加压，直至流速恒定。 柱床约被压缩至 9/10 体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步， 可使分离度提高很多， 且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。 然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。

6.过柱和收集。 柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。

太低

的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子： 10mg 上样量， 1g 硅胶 H，0.5ml 收一馏分； 1-2g 上样量，50g 硅胶（200-300 目），

20-50ml 收一馏分。

7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较

多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底

1-2 个数量级。

8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少 或为液体，可过一小凝胶柱， 作为送谱前的最后纯化手段。 可除去氢

谱 1.5ppm 左右所谓的 “硅胶 ”峰。

二、柱层析分离的实验方法和技巧

常说的过柱子应该叫柱层析分离， 也叫柱色谱。我们常用的是以

硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。 由于柱分的经验成分太多， 所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。

一：柱子可以分为：加压，常压，减压

压力可以增加淋洗剂的流动速度， 减少产品收集的时间， 但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候， 常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。

减压柱能够减少硅胶的使用量， 感觉能够节省一半甚至更多， 但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发 （有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用

水泵抽气（很大的噪音，而且时间长） 。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情， 但是自从尝试了加压后， 就几乎再也没动过减压的念头了。

加压柱是一种比较好的方法， 与常压柱类似， 只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气， 双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。 个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。

二：关于柱子的尺寸

应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，

上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄） ，这样相

对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，

那么分离的难度可想而知， 恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。 而如

果样品层只有 0.5 厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。

当

然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了， 不过这些成本相对

于产品来说也许就不算什么了 （有些不环保的说， 不过溶剂回收重蒸

后也就减小了部分浪费） 。

现在见到的柱子径高比一般在 1：5～ 10，书中写硅胶量是样品量的 30～ 40 倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的

比较开（是指在所需组分 rf 在 0.2～ 0.4，杂质相差 0.1 以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如 200 毫克的样品，用 2cm× 20cm 的柱子）；如果相差不到 0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用 3cm 的，也可以减小淋洗剂的极性等等。

三：关于无水无氧柱

适用于对氧，水敏感，易分解的产品，可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次， 因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解， 毕竟要分离的是敏感的东东， 小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感， 所以接收瓶一定要用可密封的，遵循 schlenk 操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是 schlenk 操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准

备几十个 schlenk 瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在

哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个

schlenk ，现在只一个就能把所要的全收集到。

无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。 因为硅胶中有

大量的羟基裸露在外， 很容易是样品分解， 特别是金属有机化合物和

含磷化合物。 而氧化铝可以做成碱性、 中性和酸性的， 选择余地比较

大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用

HF254 做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里 了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。

四：关于湿法、干法上样

湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品， 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙

酯等，但溶剂越少越好， 不然溶剂就成了淋洗剂了。 很多样品在上柱

前是粘乎乎的， 一般没关系。 可是有的上样后在硅胶上又会析出， 这

一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，

而样品本身又是比较好的固体才会发生， 这就应该先重结晶， 得到大

部分的产品后再柱分， 如果不能重结晶， 那就不管它了， 直接过就是

了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。

有些样品溶解性差， 能溶解的溶剂又不能上柱 （比如 DMF,DMSO 等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾） ，这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是 1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后， 不能看到明显的固体颗粒 （那说明有的样品没有

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