植物有丝分裂PPT

实验一 植物有丝分裂染色体标本制备与观察

一、实验目的

通过对植物组织的取材、预处理、解离、染色、压片等制片步骤的学习，掌握植物染色体制片技术，奠定细胞遗传学的研究技术；通过对植物根尖细胞的观察，掌握有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化。 二、实验原理

有丝分裂是植物细胞分裂的主要方式，细胞分裂过程中，核内染色体准确地复制，并有规律地、均匀地分配到两个子细胞中去，使子细胞和母细胞的遗传组成一样，保证了植物细胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植物组织中，如根尖组织、茎尖组织、居间分生组织、愈伤组织等，常进行着剧烈的细胞有丝分裂。在细胞分裂的适当（分裂旺盛期）时候取材，进行预处理，固定、解离、染色和涂抹压片等方法，使细胞、染色体分散，便于在显微镜下观察染色体的形态特征和变化特点及进行染色体计数。

三、实验材料

蚕豆（Vicia faba, 2n=12）干种子 四、实验仪器及用具

多媒体显微演示系统、显微镜、培养箱、分析天平、水浴锅、酒精灯、剪刀（或刀片）、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸、铅笔、标签纸、胶水、棕色瓶等。 五、药品和试剂

秋水仙碱、8－羟基喹啉、苏木精、水合三氯乙醛、铁矾［铁钾矾KFe(SO4)2?12H2O或铁铵矾NH4Fe(SO4)2·12H2O］、无水酒精、冰醋酸、1N盐酸、50％丙酸。 六、实验步骤 1．材料准备

选取新鲜无病斑的蚕豆干种子，经日晒后，放在烧杯内，室温下清水浸泡一昼夜。种子吸水膨胀后，放在搪瓷盘上20℃左右保湿培养（双层纱布覆盖），待根长1~2cm时，于上午9:00~10:30或下午14:00~16:00进剪下根尖备用。 2. 预处理

1

为了获得较多中期分裂相的细胞，同时使染色体缩短和分散，可对根尖进行预处理，处理方法有：

（1）0.05％~0.2％的秋水仙碱水溶液处理2~4小时。 （2）0.002M的8~羟基喹啉溶液处理3~4小时。 （3）根尖浸在蒸馏水中于在1~4℃低温下处理24小时。 3. 固定

用蒸馏水洗净材料，再用卡诺氏（冰醋酸:无水酒精=1:3）固定液（用量应为材料体积的15倍以上）室温下固定30~60分钟。固定的材料如暂不制片，可经90％酒精→80％酒精→70％酒精（各半小时）浸泡进行转换，最后臵于70％酒精内放入0~4℃冰箱，约可保存半年。如保存时间太长，需重新固定后再用。 4. 解离：

根尖、茎尖等体细胞需经处理，除去细胞间的果胶层，并使细胞壁软化，才便于压片。这种处理过程称为解离，解离时间的长短依植物材料和解离液的不同而不同。时间短细胞不易压散，时间过长，细胞被压破，且影响染色效果。

方法1：固定的蚕豆根尖用蒸馏水冲洗2遍，然后放入预热的60℃的1N盐酸中，60℃恒温处理5分钟左右，倒去盐酸，用蒸馏水冲洗3遍后，将材料浸泡在蒸馏水中2小时。

方法2：固定的蚕豆根尖用蒸馏水冲洗干净后，臵1N的盐酸中（室温约28~30℃）处理30分钟左右。然后倒去盐酸，蒸馏水洗3遍后，臵于蒸馏水中浸泡2个小时以上。将材料中的酸洗净。

方法3：取材料的根尖，在生长点处切取1毫米左右（一般一个根尖可取4~5段），放入1N HCl酸解10分钟左右，取出，用水漂洗三遍。

注：1N HCl由36%~38%浓盐酸取83ml定容至1升配臵而成。 5. 染色液和制片 （1）染色液： ① 丙酸－铁矾苏木精

贮存组：A液：苏木精2克，溶于100ml 50％丙酸， B液：铁钾矾0.5克溶于100ml 50％丙酸。

染色液：A液和B液等量混合，每5ml的A液和B液的混合液中加入2克水合三氯乙醛，充分溶解摇匀，存放一天后使用。贮存液可较长久保存，染色液只能保存一个月，在两周内使用效果最好。

② 改良卡宝品红

2

甲液：3克碱性品红，溶于70％酒精100ml（可长期保存），

乙液：甲液10ml，加入5％苯酚（石炭酸）水溶液90ml（限2周内使用）， 染色液母液：B液45ml，

37％甲醛6ml，

冰醋酸6ml。

改良卡宝品红染色液：染色液母液10ml， 45％醋酸90ml，

山梨醇1克

配制后立即使用着色能力差，两周后着色能力增强。 （2） 制片：

选（挑）取已处理过的根（茎）尖一枚，放在干净载玻片中央，除去非分生组织的部分，并吸去多余水分。另取一张干净载玻片，呈十字形交叉盖在有根尖的载玻片上，用大拇指按压在载玻片的中央，使根（茎）尖压成一簿层，然后将两载玻片分开，各滴一小滴上述染色液进行染色，稍等片刻，取一盖玻片，盖玻片一边靠在离材料不远的载玻片上，左手握镊子顶着盖玻片，右手握解剖针托住盖玻片徐徐放下，若染色液不能布满盖玻片时，可在盖玻片边缘稍加染色液，然后用一张大小合适的滤纸覆盖在盖玻片上，一手固定盖玻片，另一手持铅笔橡皮头，对准材料轻敲，使根尖细胞分散均匀。制好的片子若不能及时进行显微镜观察，可用矾士林临时封住盖玻片四周。 6. 显微观察

制备好的细胞学片子，臵于显微镜的载物台上，先用低倍镜（10×10）调焦观察，寻找具有分裂相的细胞后，再转换到高倍镜（10×40）下观察。 七 作业

1. 制作细胞有丝分裂各时期图象片子1－2张

2. 描绘所观察到的细胞有丝分裂过程中各时期的图象，并简要说明染色体的行为特征。

3

（实验一 染色体组型分析）

一、实验目的

分析植物细胞有丝分裂中期染色体数目、大小、着丝粒位臵和随体等形态特征，学习染色体组型分析的方法。为物种起源和进化提供依据，为遗传育种研究提供细胞学证据。 二、实验原理

各种生物染色体的形态，结构和数目都是相对稳定的。每一生物细胞内特定的染色体组成叫染色体组型。染色体组型分析也称核型分析。通过一定的方法制得染色体有丝分裂的玻片标本，经显微照相，冲洗放大等步骤获得染色体照片。从染色体玻片标本和染色体照片的对比分析，进行染色体分组，并对组内各染色体的长度，着丝点位臵，臂比和随体有无等形态特征进行观测和描述，从而阐明生物的染色体组成，确定其染色体组型，这种过程称为染色体组型分析。 三、实验材料

蚕豆（Vicia faba, 2n=12），洋葱（Alliums cepa, 2n=16），大麦（Hordeum vulgare, 2n=14），黄麻（Tiliaceae Corchorus, 2n=14）。 四、实验仪器及用具

显微镜，显微照相系统，相片冲洗放大整套设备，目镜测微尺，镜台测微尺，4＃

放大纸，135黑白胶卷，计算器，透明尺，剪刀，坐标纸，胶水以及制作有丝分裂玻片所需的用具。 五、药品和试剂

制作有丝分裂玻片所需的药品和试剂（见实验一）以及显微摄影冲洗放大所需的药品和试剂：米吐尔，无水亚硫酸钠，对苯二酚，无水碳酸钠，溴化钾，硫代硫酸钠，硼酸，钾矾（硫酸铝钾），28％醋酸 六、实验方法与步骤

（一）染色体标本玻片的制作

染色体组型分析一般用有丝分裂中期的分裂细胞，通常采用植物根尖细胞。有丝

4

分裂中期的染色体具有典型的形态特征，便于进行分析，具体制作方法见实验一。 （二）镜检和测量

当染色体玻片制好后，放在显微镜下观察，选出符合染色体组型分析要求的细胞，这些细胞是处于有丝分裂中期，染色体分散良好，没有重叠，数目完整，随体和着丝点明显，没有断裂，着色鲜明，形态清晰，且各条染色体处于同一平面上。

选择染色体较平直的一条或几条，用目微尺（目镜测微尺）测量其长度。 （三）显微照相、冲洗和放大

将在显微镜下选定的符合要求的细胞进行显微照相（可用10×100倍的油镜），然后冲洗，选取图像清晰的底片，放大、洗印出染色体形态清晰的照片。在显微照相的同时，对镜台测微尺进行同样倍数（油镜10×100倍）拍摄，放大，然后根据照片上的实际长度，计算放大倍数。 （四）测量和计算

1. 测量：

在放大的照片上用透明尺准确地量出各条染色体的总长度和每条染色体两臂的长度（分别量到着丝点的中部）。随体的长度可计入或不计入染色体长度之内，应注明。染色体弯曲不能用直尺测量时，可先用细线量取染色体相等的长度，再用尺量出细线的相应长度。

2. 计算

（1）放大倍 ＝

放大照片上某染色体的照相长度（μ） 目镜测微尺测定的实际长度（μ）

或＝

（2）绝对长＝

放大相片的台测微尺长度（mm）

台测微尺实际长度（μ）

某染色体（臂）照片长度（μ） 放大倍数

某染色体（臂）照片长度（mm）

或＝ ×100％

放大倍数

（3）相对长度：（取小数点后两位数）

＝

某染色体（臂）绝对长度

×100％

1/2全部染色体的总长度

5

某染色体（臂）长度 ×100％ 或＝

染色体体组总长

（4）臂比（取小数点后两位数）

长臂的长度

＝

短臂的长度

（五）染色体形态测量数据表 染色 体序 号

放大相片长度（mm） 绝对长度（μm） 长臂

短臂

全长

长臂

短臂

全长

相对 长度

臂比

染色体类型

备注

（六）剪贴和配对

将放大照片上的各条染色体剪下，根据目测和染色体的相对长度、臂比、着丝粒位臵、次缢痕的有无和位臵、随体的有无和形态大小等特征，进行同源染色体配对。 （七）排列和粘贴

将配对好的染色体按照由大到小的顺序依次排列起来。排列时把各对染色体的着丝粒排在一条直线上，并且使短臂在上，长臂在下。等长的染色体，把短臂较长的染色体排在前面。随体染色体排在最后，性染色体和额外染色体单独排列。

已排好的同源染色体按染色体编号先后顺序粘贴在绘图纸上，粘贴时着丝粒要处在同一直线上。 （八）分类

6

根据着丝点的位臵，确定染色体的形态类型，臂比是反映着丝点在染色体上的位臵。

臂比 1.0 1.0~1.7 1.7~3.0 3.0~7.0 7.0以上

染色体类型 正中着丝粒染色体 中着丝粒染色体 近中着丝粒染色体 近端着丝粒染色体 端着丝粒染色体

符号 M m sm st t

具随体染色体（sat）用*标出。 （九）翻拍和绘图

将剪贴排列的染色体组型图进行翻拍，并用座标纸绘制成染色体模式图。 七、实验作业

1. 提交植物染色体组型剪贴图 2. 植物染色体组型的模式图 3. 染色体形态测量数据

4. 简述本实验的染色体组型结果，核型公式。

7

实验二 小鼠减数分裂标本的制备与观察

一、目的

1．学习和掌握细胞减数分裂染色体标本的制片技术和方法。

2．通过观察进一步熟悉减数分裂的全过程及各个时期染色体的动态变化和形态特征。 二、原理

减数分裂是发生在配子形成过程中一种特殊形式的有丝分裂，分裂过程中染色体结构也呈周期性变化，并在特定时期呈现稳定的形态特征，因而也是进行染色体形态、结构与数目鉴定的有利时期。减数分裂包含两次连续的有丝分裂——减数第一分裂和减数第二分裂；每次分裂都可分为紧密衔接的前、中、后、末四个时期，以前期Ⅰ变化最为复杂，又可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。通过减数分裂所形成的四分体细胞（或雌、雄配子），其染色体数目只有体细胞的一半。减数分裂过程中染色体出现同源配对、非姊妹染色单体间片段交换、同源染色体相互分离等一系列独特行为，为远缘杂种的分析及三大遗传定律的论证等遗传研究提供了直接或间接的证据。

减数分裂细胞染色体制片取材以高等动、植物雄性生殖分裂较为方便。在适当的时机采集动物精巢或植物花蕾(花序)，经适当技术处理，压片就可在显微镜下观察到细胞的减数分裂过程。

本实验以小白鼠精巢为材料进行减数分裂的制片观察。 三、实验内容

1. 实验材料

性成熟的雄性小白鼠（Mus musculus，2n=2x=40）。 2. 器具和试剂

显微镜，计时器；染缸，染色板，酒精灯，白绸，镜头纸，培养皿，材料瓶，载玻片，盖玻片，镊子，解剖刀，解剖针，镊子，刀片，木夹，吸水纸，标签，铅笔等常用工具。

卡诺氏Ⅰ，甲醇冰乙酸（甲醇∶冰乙酸=3∶1）固定液，FAA固定液；甘油蛋白，１mol/L HCI， 45％乙酸；0.5％醋酸洋红或醋酸地衣红，改良苯酚品红，醋酸-铁矾-

8

苏木精，丙酸-水合氯醛-铁矾-苏木精，丙酸-水合氯醛-铁矾-洋红等染液；无水乙醇，95％乙醇，80％乙醇，70％乙醇；石蜡。

3. 实验步骤

（1）秋水仙素处理 取睾丸前3～4h给小鼠经腹腔注射秋水仙素（100ug/ml）0.2～0.4ml。

（2）取精巢固定 用脊髓损伤法处死小鼠，放在解剖板上固定四肢，剖开腹腔取出睾丸，用2％的柠檬酸钠溶液洗净，投入甲醇冰醋酸液固定12h（或取精细管固定30～60min），若暂时不用，可用95％乙醇清洗2次， 70％乙醇于4℃冰箱中保存（在70％乙醇与等量甘油的混合液中可长期保存）备用。

（3）酸解 用剪刀剪开睾丸最外层的被膜和白膜，用尖头镊子从睾丸中挑出细线状的精细管，洗净，放入一白瓷板窝内，用１mol/L HCl酸解3～5min。

（4）染色 将改良苯酚品红（或其它染液）滴加在一染色板窝内，把酸解好的材料放入其中，染色20～30min；

（5）压片 挑取2～3条已染色的精细管放于载玻片上，滴一滴染液，盖上盖片，在盖片上覆一张吸水纸，吸去多余的染液，换一张干净的吸水纸，一手固定盖片和载片，另一手用铅笔的橡皮头垂直敲打，使细胞分散、压平。

（6）镜检 观察减一分裂各期的时相，可见20对同源染色体相互配对的现象，其中有19对染色体呈环状连接，只有XY染色体表现出特殊的一个末端和两个末端相接，而且Y染色体又出现一定程度的深染现象。

9

实验五 人类ABO血型鉴定与人类常见遗传性状调查

一、实验目的

1. 学习ABO血型的鉴定方法。

2. 了解推测（计算）群体中等位基因频率方法。 二、实验原理 （一）ABO血型检测

A型：红细胞上具有A抗原，能与特异性抗体A发生凝集反应，而不与B抗体发生凝集反应。

B型：红细胞上具有B抗原，与特异性抗体B发生凝集反应，而不与A抗体发生凝集反应。

AB型：红细胞上具有A抗原和B抗原，既与抗体A发生凝集反应，也与抗体B发生凝集反应。

O型：红细胞上缺乏A抗原，也缺乏B抗原，均不与抗体A或抗体B发生凝集反应。

（二） 人类常见遗传性状的调查分析

在自然界，无论动植物一种性别的任何一个个体有同样的机会与其相反性别的任何一个个体交配。假设某一位点有一对等位基因A和a，A基因在群体出现的频率为p，a基因在群体出现的频率为q；基因型AA在群体出现的频率为D，基因型Aa在群体出现的频率为H，基因型aa在群体出现的频率为R。群体（D，H，R）交配是完全随机的，那么这一群体基因频率和基因型频率的关系是：

D=p2 H=2pq R=q2

这说明任何一物种的所有个体，只要能随机交配，基因频率很难发生变化，物种能保持相对稳定性。

人类是随机交配的群体，其性状的表现反映出群体的遗传组成，从群体性状的遗传分析，可以了解不同种族（民族）的基因频率和基因型频率。根椐遗传平衡定律，可以对人类群体进行基因频率的分析。

表5-1 人类常见遗传性状—单对基因控制 性状 耳垂 卷舌状

显性 与脸颊分离 能 10

隐性 紧贴脸颊 不能

美人尖 拇指竖起时变曲情形 食指长短 双手手指嵌合 上眼脸有无皱褶 酒窝 有 挺直 较无名指长 左手拇指在上 有(双眼皮) 有 无 拇指第一节向指背弯曲 较无名指短 右手拇指在上 无(单眼皮) 无 单对基因控制性状的显隐性表型图示：

左：显性 右：隐性

11

12

三、实验材料

（一）ABO血型检测：参试人员的手指毛细管血液两滴

13

（二）人类常见遗传性状的调查分析：以班级的每一位同学的8种性状作为研究小群体。 四、实验用具

（一） ABO血型检测：显微镜、载玻片、抗A、抗B、消毒药棉、70％乙醇、一次性采血针

（二）人类常见遗传性状的调查分析：笔和纸 五、实验步骤

（一）ABO血型检测

1. 在载玻片上划分两格，分别标明A与B。

2. 在A处滴加抗A标准血清一滴，在B处加抗B标准血清一滴； 3. 采血

4. 一滴血液滴在加抗A血清处，另一滴血液滴在加抗B血清处； 6. 分别用采血针调匀，调匀一处血液后揩擦采血针，再调另一处；

7. 两分钟内肉眼观察反应结果，或用最低倍显微镜观察其凝聚的情况，反之可能产生假凝集现象。

（二）人类常见遗传性状的调查分析

1. 以10个人为一组，由小组长观察上述的前8个单对基因控制性状的表现，并作记录。

2. 统计全班（年段）的资料，进行基因频率和基因型频率的计算。 计算公式：D+H=p2+2pq R=q2 六、作业

1. 统计全班ABO血型频率。

2. 统计8种性状的基因频率和基因型频率。

14

实验四 微核检测技术

一、目的

1. 了解微核测试原理和毒理遗传学意义。 2. 学习小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖的微核测试技术。 二、原理

微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。

70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。人和动物的微核测试多用骨髓和外周血细胞，这需要一定的培养条件与时间，细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。而植物系统则更直接、更简便。如采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性作微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自1983年开始，建立了一套蚕豆根尖微核测试，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家《生物监测技术规范（水环境部分）》。

15

本实验介绍了小鼠骨髓细胞微核测试和蚕豆根类微核测试技术。 三、实验内容

（一）小鼠骨髓细胞的微核测试

骨髓细胞微核测定的阳性药物可用环磷酰胺，为加强阳性效果，剂量可适当加大。给药途径视实验要求而定。

1. 实验材料

成年小鼠，雌雄均可。 2. 器具和试剂

显微镜、刻度离心管、吸管、载玻片、离心机、注射器、烧杯、解剖器具。环磷酰胺（1mg/ml）溶液、生理盐水、小牛血清（或1%柠檬酸钠溶液）、甲醇、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 6.8）、Giemsa原液。

3. 实验步骤

（1）按40?g/g体重的剂量对小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液诱发微核（若进行其它因子测定或自然环境测定按下线步骤直接操作）。

（2）处理24～36小时后，小鼠采用脱颈椎处死，迅速剥取两根股骨，剔净肌肉等软组织，并擦净股骨上的血污。

（3）剪去肌骨两端关节头，用注射吸收2～3ml预温到37℃的生理盐水，然后将针头插入股骨腔，尽量将骨髓细胞冲洗出来，臵于10ml试管中把细胞团用吸管吹打散，然后将细胞悬液转入离心管内，弃去残渣。

（4）1000rpm离心5分钟，收集细胞，弃去上清液，尽量不留残液。滴加2～3滴灭活小牛血清，将细胞轻轻吸打均匀。

（5）1000rpm离心5分钟，收集细胞，弃去上清液，再加1滴灭活小牛血清，用吸管轻轻混匀。

以上两步的小牛血清亦可用1%檬檬酸钠代替，但注意两步须在15分钟内完成。 （6）滴一小滴细胞悬液在清洁的载玻片上，涂成均匀涂片，在空气中干燥。 （7）放入甲醇中固定10分钟，干燥后，用9Giemsa染液（1份原液，9份pH 6.8磷酸缓冲液）染色10分钟，迅速用缓冲液洗片，让其干燥，即可用于观察。

4. 实验结果

选择细胞密度适中，铺展均匀，染色良好的地方，随机观察计数。骨髓细胞中有核的细胞均可见到微核，但是在只有少量胞浆的有核细胞微核细胞常很难与正常核叶及核的突出物相鉴别，而在无核的嗜多染色细胞的胞浆中，微核却易于辨认。因为嗜

16

多染色细胞为骨髓细胞中一类主核刚被排出的年幼红细胞，在它完成最后一次有丝分裂后几小时将其主核排出，而由染色体断片形成的微核则保留在细胞中。因此一般观察计数嗜多染色红细胞中的微核。

嗜多染红细胞经Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞呈枯红色。微核大多数呈圆形或椭圆形，边缘光将整齐。嗜染性与核质一样，呈紫红色或蓝紫色。每只动物计数1000～2000的嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示，一个嗜多染红细胞出现一个以上微核，仍按一个细胞计数。

正常小鼠嗜多染红细胞微核率为千分之2.58%+0.41%，即正常小鼠嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常。统计你所测定的材料的微核率。

（二）蚕豆根尖微核测定试技术 1. 实验材料

松滋青皮豆。蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高，因而是对诱变因子反应敏感的品种。本品种引入后的栽培繁殖时要注意不要同其它蚕豆品种种在一起，不喷洒农药，以保持该品种较低的本底微核值。也可用其它蚕品种，但是必须设臵对照组。种子成熟后，晒于藏干燥器内或4℃冰箱内备用。

2. 器具和药品

显微镜、手动计数器、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯、瓷盘。6mol/L盐酸、甲醇、冰醋酸、醋酸洋红、CrO3、NaN3（叠氮化钠）、DMS（甲基磺酸乙醚）。

3. 实验步骤

（1）浸种催芽：将实验用蚕豆按需要量放入盛有自来水（或蒸馏水）的烧杯中，在25℃下浸泡24小时，此间至少换水两次，所换水应25℃预温。种子吸胀后，用纱布松散包裹臵瓷盘中，保持温度，在25℃温箱中催芽12～24小时，待初生根长出2～3mm时，再取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中，25℃继续催芽，经约36-48小时，大部分初生根长至1～2cm左右，根毛发育良好，这时即可用来进行检测了。

（2）用被检测液处理根尖，每处理选6～8粒初生根生长良好，根长一致的种子，放入盛有被测液的培养皿中，被测液浸没根尖即可。阳性因子可采用CrO2、NaN3、EMS，为加强阳性效果可适当加大浓度，1.0～2.5mol/L CrO3、0.5～1.5mol/L NaN3和150-220mol/L EMS溶液。另外可取一处污水作被检液之一。用自来水（或蒸馏水）处理作对照。处理根尖12～24小时时，此时间亦可视实验要求和被测液浓度而定。

（3）根尖细胞恢复培养：处理后的种子用自来水（或蒸馏水）浸洗三次，每次2～3分钟。洗净后再臵入铺有湿润滤纸的瓷盘中，25℃下再恢复培养22～24。

17

（4）根尖细胞固定：将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根，用甲醇：冰醋酸（3：1）液固定24小时。固定后的根如不及时制片，可换入70%的乙醇溶液中臵4℃冰箱中保存备用。

（5）酸解：用蒸馏水浸洗固定好的幼根两次，每次5分钟，吸净蒸馏水，加入6mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10分钟，幼根软化即可。

（6）染色：吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根三次，每次1～2分钟。最后浸于水中。制片前了出臵载玻片上，截下1～2mm左右长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染色5～8分钟，加车盖玻片，压片观察。

4. 实验结果

首先在显微镜低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。微核大小在主核1/3以下，并与主核分离，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。每一处理观察3个根尖，每个根尖数1000个细胞，统计其中含微核的细胞数，然后平均，即为该处理的MCN%，即微核千分率，以此可作一个检测指标。

根据你的实验安排列表填出你的实验结果。 若进行污水检测，根据

污染指数（PI）=样品实测MCN%平均值/对照组（标准水）MCN%平均值 鉴定出你所测水样的污染程度，也可以计算被检化学药剂的污染指数。

污染指数在0～1.5区间基本没有污染

1.5～2区间为轻度污染 2～3.5区间为中度污染 3.5以上为重度污染。

四、思考题

1. 试比较动物和植物系统的微核测试方法。

2. 在蚕豆根尖细胞的微核测试中，为什么要进行恢复培养？

3. 产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期可能出现什么样的中期分裂图象？

4. 实验观察中请同时仔细观察每个分裂相细胞。

18

实验五 鱼类染色体的快速制备－体内注射PHA法 （自制豆类PHA制备鱼类染色体标本）

—— 选做实验

一、实验目的

1.了解鱼类染色体的形态与数量特征。

2.学习用直接方法制作鱼类染色体标片的方法与技术。 二、实验原理

PHA作为致有丝分裂原在细胞体外短期培养中的广泛应用,使专供鱼类染色体制片的血培养,鳞培养以及肾培养等短期培养方法在二十世纪七十年代建立。但体外培养的实验设备和无菌操作，程序繁琐，耗用时间长，在应用上受限制。 三、实验材料

鲫鱼(200—300g/尾)。 四、实验仪器及用具

显微镜，计时器；染缸，染色板，酒精灯，白绸，镜头纸，培养皿，材料瓶，载玻片，盖玻片，镊子，解剖刀，解剖针，镊子，木夹，吸水纸，标签，铅笔等常用工具。

五、药品和试剂

（1）含PHA的豆类浸提液；（2）0.1%秋水仙素溶液；（3）其余同实验一。 六、实验步骤

1. 含PHA的豆类浸提液制备

称取8g颗粒饱满的豆子，有蒸馏水洗净，纱布吸干，晾干；用粉碎机将豆子粉碎成粉末；把上述豆粉称取10g放入烧杯中，同时加入50ml0.9%氯化钠溶液浸泡过夜，中间摇动几次；再将上述浸液经纱布过滤，去除粗渣后，放在4支离心管里，使离心机以8500转/分离心20分钟，弃去沉淀，上清液就是PHA提取液；可分装入小瓶，贴好标签，在4℃下至少可保存3个月。

19

2、注射PHA

自实验鲫鱼（200－300g/尾）胸鳍基部一次注射自制PHA溶液0.5ml～1ml／尾，处理时间为4小时。

3、注射秋水仙素

将实验鱼胸鳍基部一次注射0.02％秋水仙素1ml，处理2小时。 4、断尾失血

将实验鱼断尾失血20min，取肾中前部用生理盐水反复洗涤。 5、制备细胞悬浮液

将肾组织块臵于少量生理盐水（25ml）培养皿中，两手各持一把镊子反复撕拉肾组织，加入5ml（生理盐水，用260目筛绢过滤到15ml离心管。

6、离心洗涤细胞

将滤液800转／min离心5－6min弃上清液，加入生理盐水再离心2次，每次弃上清液。

7、低渗处理

向离心管加入0.6NKCl.1ml制备细胞悬液,静臵数分钟后用吸管吸取悬液滴1－2滴，在培养皿中的载玻片上，然后加1－2ml KCl低渗液进行稀释并用吸管吹打，使细胞均匀铺满整个玻面，盖上培养皿，防止水分蒸发低渗处理30min。

8、固定

凉干玻片后，用吸管滴固定液1－2滴在玻片上，使之分布均匀，让其然干燥后，再滴1－2滴固定液，自然干燥。

9、染色

将固定处理的玻片放在染色液中染色30分钟，自来水冲洗，干燥后显微镜观察。 七 作业

1、PHA和秋水仙素在本实验中的作用分别怎样？ 2、鱼类染色体的有什么样的形态特征？ 3、选择较好的分裂相进行拍照并保存。

20

1

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/pt1.html