臭豆腐中的枯草芽孢杆菌的分离、筛选、鉴定与验证

微生物实验方案设计

——臭豆腐中的枯草芽孢杆菌的分离、筛选、鉴定与验证

姓名：吴安琦 专业：化学生物学 学号：20131583

摘要：本实验目的在于通过对市场上卖的臭豆腐发酵卤水中的菌种进行多样性分析,分离纯化其中的各种菌株,后对其进行生化鉴定和食用安全性验证试验，从中筛选出高效的制作食用臭豆腐发酵的枯草芽孢杆菌菌株。

关键词：臭豆腐；枯草芽孢杆菌；分离纯化；菌种鉴定。

引言

臭豆腐，其名虽俗气、却外陋内秀、平中见奇、源远流长，是一种极具特色的汉族传统小吃。

臭豆腐臭豆腐以优质黄豆为原料。制作工艺较为复杂，黄豆经过筛选、脱壳、浸泡、磨浆、过滤、煮浆、点浆、成型、划块、发酵等十道工序。呈贡臭豆腐质地软滑，散发异香。先人赞誉云：“味之有余美，玉食勿与传”。它不仅有很高的营养价值，而且有较好的药用价值。古医书记载，臭豆腐可以寒中益气，和脾胃，消胀痛，清热散血，下大肠浊气。常食者，能增强体质，健美肌肤。

“闻着臭”是因为豆腐在发酵腌制和后发酵的过程中，其中所含蛋白质在蛋白酶的作用下分解，所含的硫氨基酸也充分水解，产生一种叫硫化氢（H2S）的化合物，这种化合物具有刺鼻的臭味。 在蛋白质分解后，即产生氨基酸，而氨基酸又具有鲜美的滋味，故“吃着香”。

枯草芽胞杆菌，是芽胞杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在

液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

并且耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟；耐酸碱，但是不耐低温,在-4和-80度冰箱中会很快死亡。

实验方法

2.1实验材料

2.1.1原料：

臭豆腐发酵浸泡液( 俗称卤水)、若干白豆腐。

2.1.2试剂与培养基：

孔雀绿染色液、蕃红染色液、革兰氏试剂、牛肉膏蛋白胨培养基、无菌卤水、生理盐水

2.1.3实验仪器：

生物显微镜、生化培养箱、酒精灯、接种环、培养皿、试管、吸管、500 mL三角瓶、玻璃刮铲、玻璃珠、牛皮纸、不锈钢桶、塑料桶等器具、高压灭菌锅、超净工作台，无菌透气的坛子（坛口用纱布等封好，确保空气中的细菌进不去）

2.2试验方法：

2.2.1富集培养臭豆腐卤水中的发酵菌株

取5mL卤水加入45mL无菌水/250mL三角瓶（带玻珠）中，振

荡15-20min，取5mL菌悬液或5mL水样加入45mL促芽培养基/250mL三角瓶中，75℃-80℃水浴15-20min，降至35℃-37℃ 150-200r/min振荡24h，染色镜检，连续两至三次培养备用。

2.2.2牛肉膏蛋白胨培养基的制备

配置牛肉膏蛋白胨的液体培养基，待培养基冷却后进行分装。将分装完毕后的培养基进行高压蒸汽灭菌。将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。

2.2.3发酵菌株的分离纯化

配制 9 mL 生理盐水试管若干支，配制225 mL生理盐水于500 mL三角瓶中加入适量玻璃珠，在121 ℃下灭菌30 min ，冷却后进行倒置平板。再酒精灯火焰旁用无菌操作方法吸取 25 mL 臭豆腐的发酵浸泡液，放入装有玻璃珠和 225 mL 无菌生理盐水的三角瓶中，振摇30 min，使菌体充分分散，溶液均匀，再用生理盐水依次稀释，从10 倍递增稀释法至 10-4倍。然后用稀释平板混菌法分离纯化臭豆腐卤水中的发酵菌株，置于36 ℃ 恒温培养 24 h，选取其中的表面粗糙不透明，污白色或微黄色的单菌落进行划线培养。再次观察并对菌落形态不同的菌进行后续鉴定。

将形态不同的单菌落平皿分别编号，观察平皿上不同菌株的菌落形态特征并做及时记录与拍照。同时，以接种环从不同编号的平皿挑取形态不同的单菌落的菌体制片，作革兰氏染色和芽孢染色在 10×100 倍的显微镜(油镜)下观察，并及时记录。同时用测微尺随机测量 20 个菌体的大小，求出平均值。

2.2.4发酵菌落的筛选

将鉴定为革兰氏阳性细菌的菌落，根据编号，依次接种于已经灭菌的白豆腐上，置于无菌透气的坛中并加入无菌卤水，给坛上作相应的编号，在常温下发酵20天。

从发酵完毕的坛子内，选取风味优良，发酵良好的臭豆腐，同样用无菌操作方法吸取 25 mL 臭豆腐的发酵浸泡液，放入装有玻璃珠和 225 mL 无菌生理盐水的锥瓶中，振摇30 min，使菌体充分分散，再用生理盐水依次稀释，从10 倍递增稀释法至 10-4倍。然后用稀释平板混菌法分离纯化臭豆腐卤水中的发酵菌株，置于36 ℃恒温培养 24 h，选取得到单一菌落的培养皿若干，用接种环从不同编号的平皿挑取形态不同的单菌落的菌体制片，作革兰氏染色和芽孢染色在 10×100 倍的显微镜(油镜)下观察，并及时记录。同时用测微尺随机测量 20 个菌体的大小，求出平均值后与相应编号的原菌体作比较。

2.2.5发酵菌落的鉴定

1.形态上鉴定目的菌株

将目的菌株置于显微镜下观察细胞形态，与样品菌株进行对照比较。 2. 提取目标菌株基因组DNA鉴定

1. 取100ml过夜培养的菌液，5000 rpm 离心10分钟，弃上清液。 2. 菌体沉淀用10 ml TE 悬浮，并加0.5ml 10% SDS，50μl蛋白酶 K，混匀，37℃保温1小时。 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀。再加1.5ml CTAB/NaCl 溶液，混匀，65℃保温20 分钟。 4. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 抽提，5000rpm 离心10 分钟，移取上清液至干

净离心管。 5. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中。

6. 加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，10 000rpm离心15分钟得到DNA沉淀。

7. 加入700μl 70%乙醇，70μl 3M NaAc漂洗DNA沉淀，溶解于1ml TE，-20℃保存。 8. 去除RNA：加5μl RNase 加1/10体积3M NaAc加2倍体积无水乙醇10分钟后，将DNA沉淀溶于1ml TE，-20℃保存。

9. 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。 10．将纯化好的DNA样品送与基因公司测序。4.同源性分析 11.将菌株的16SrRNA序列与GeneBank核酸序列数据库的标准菌株进行序列比对。

2.2.6目的枯草芽孢杆菌的验证：

将筛选鉴定后的枯草芽孢杆菌在培养基上进行培养，观察长成的菌落的形态特征，如菌落颜色，大小，形状，干湿度，隆起程度，光泽以及透明度等，与标准的枯草芽孢杆菌的形态结构进行对比。若表型相同或大致一致，则实验成功。

参考文献

[1] 胡德朋，唐家毅，曹昱，王永华，杨博 枯草芽孢杆菌的分离鉴定及酶系分布的研究. 2008，2

[2] 李海鹏,赵春贵,陈涛 枯草芽孢杆菌TY7210菌株的ERIC2PCR快速鉴别. 山西大学学报(自然科学版) 2006

[3]何理，吴晖 市售臭豆腐中菌种的分离及生化鉴定.现代食品科技2012, Vol.28, No.8 [4] 石春芝，陶天申 高效液相色谱法测芽孢杆菌的DNA G+Cmol%.

净离心管。 5. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中。

6. 加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，10 000rpm离心15分钟得到DNA沉淀。

7. 加入700μl 70%乙醇，70μl 3M NaAc漂洗DNA沉淀，溶解于1ml TE，-20℃保存。 8. 去除RNA：加5μl RNase 加1/10体积3M NaAc加2倍体积无水乙醇10分钟后，将DNA沉淀溶于1ml TE，-20℃保存。

9. 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。 10．将纯化好的DNA样品送与基因公司测序。4.同源性分析 11.将菌株的16SrRNA序列与GeneBank核酸序列数据库的标准菌株进行序列比对。

2.2.6目的枯草芽孢杆菌的验证：

将筛选鉴定后的枯草芽孢杆菌在培养基上进行培养，观察长成的菌落的形态特征，如菌落颜色，大小，形状，干湿度，隆起程度，光泽以及透明度等，与标准的枯草芽孢杆菌的形态结构进行对比。若表型相同或大致一致，则实验成功。

参考文献

[1] 胡德朋，唐家毅，曹昱，王永华，杨博 枯草芽孢杆菌的分离鉴定及酶系分布的研究. 2008，2

[2] 李海鹏,赵春贵,陈涛 枯草芽孢杆菌TY7210菌株的ERIC2PCR快速鉴别. 山西大学学报(自然科学版) 2006

[3]何理，吴晖 市售臭豆腐中菌种的分离及生化鉴定.现代食品科技2012, Vol.28, No.8 [4] 石春芝，陶天申 高效液相色谱法测芽孢杆菌的DNA G+Cmol%.

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