修改稿-滴水湖沉积物中可培养优势微生物种群初探

滴水湖沉积物中可培养优势微生物种群初探

江敏1，2*，胡文婷1，凌云1，2，吴昊1，2，邢斌1，卢柳1，任治安1

（1．上海海洋大学. 上海 201306；2．水域环境生态上海高校工程研究中心. 上海 201306）

1

摘要 于滴水湖湖心采集底泥样品，对底泥中可培养优势菌种进行分离、纯化，并利用Biolog微生物自动分析系统进行鉴定。结果显示，滴水湖沉积物中菌落总数为2.43×104CFU/g，分离纯化后的8株优势菌种中，革兰氏阴性菌占87.5%，其中7株为GN-NENT（革兰氏阴性非肠道菌）、1株为GP-ROD SB（革兰氏阳性芽孢杆菌）。鉴定结果显示，8株菌种分别为：鳗鱼气单孢菌（Aeromonas encheleia）、乙酸钙不动杆菌/基因型1（Acinetobacter calcoaceticus/genospecies 1）、舒氏气单胞菌（Aeromonas schubertiiDNA group 12）、腐败希瓦氏菌B（Shewanella putrefaciens B）、维罗纳/温和气单胞菌（Aeromonas veronii/sobria DNA group 8）、坎氏弧菌（Vibrio campbelli）、蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）和梅氏弧菌（Vibrio metschnikovii）。 关键词 滴水湖；沉积物；菌落计数；Biolog微生物自动分析系统；优势微生物

Preliminary study of dominant micro-organisms

in sediment of Dishui Lake

Jiang Min1,2, Hu Wenting1, Ling Yun1,2, Wu Hao1,2, Xing Bin1, Lu Liu1, Ren Zhian1

(1.College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, P.R.China； 2.Research and Engineering Center on Aquatic Environment Ecosystem, Shanghai 201306, P.R.China)

Abstract After collecting sediment sample from the center of Dishui Lake, the culture-dependent dominant micro-organisms were separated, purificated and identificated with Biolog automatic microbiology analysis system. Results showed that the total number of bacterial colonies in Dishui Lake was 2.43×104 CFU/g. Gram-negative bacterium made up 87.5% of eight dominant bacterium and among which seven types of GN-NENT and one type of GP-ROD were identified. The eight strains of bacterium were Aeromonas encheleia, Acinetobacter calcoaceticus/genospecies , Aeromonas schubertiiDNA group 12, Shewanella putrefaciens B, Aeromonas veronii/sobria DNA group 8, Vibrio campbelli, Bacillus mycoides and Vibrio metschnikovii respectively.

Key words Dishui Lake; Sediment; Colony counting; Biolog automatic microbiology analysis system; dominant micro-organisms

基金项目：上海市教委科研创新项目（10ZZ103），上海市教委重点学科建设项目（J50701）. *作者简介：江敏(1972～ )，女，江苏省海门人，博士，主要从事水域环境保护方面的研究，E-mail： mjiang@shou.edu.cn

滴水湖位于东海之滨的上海市临港新城，是中国目前最大的人工湖，湖泊呈圆形，总面积5.56km2，平均水深3.7m。2002年，滴水湖于新围垦成陆的盐碱滩涂上开挖，2003年10月开始蓄水，由滴水湖周边河网水系引水入湖。目前已有学者对于滴水湖的营养状况、浮游生物等进行了相关研究，朱梦杰等的研究发现：滴水湖浮游植物主要以硅藻、绿藻和蓝藻为主；王延洋等研究了滴水湖中的浮游动物群落结构及其季节变化，通过调查共鉴定出浮游动物的39种，其中轮虫27种，桡足类10种，枝角类2种。但有关滴水湖中微生物种群结构的调查分析尚未见报道。

微生物作为湖泊生态系统中物质循环和能量流动的主要参与者，与区域环境有着密切的关系，在水体氮磷循环中起着至关重要的作用[3]，因此针对微生物，尤其是湖泊沉积物中的微生物开展研究有着重要意义，而微生物多样性分析则是其中的基础环节之一。国内外关于沉积物中微生物多样性的研究方法很多，大致包括以下几种[4][5]:(1)传统的微生物平板纯培养方法；(2) Biolog微生物微平板鉴定分析方法；(3)微生物脂肪酸分析方法；(4)分子生物学方法。传统的微生物培养方法只能反映极少数微生物的信息，所测结果误差较大，目前通常作为一种研究的辅助手段；脂肪酸分析方法只能鉴定到属，不能鉴定到种，且强烈依赖于标记脂肪酸，而后者的变化可导致错误的群落变化估计；分子生物学方法实验条件要求高，耗时长，成本高且在微生物的种类鉴别与定量分析方面也存在一定的局限性，因而在实际研究工作中也常受到一定的限制。Biolog微平板分析方法由Biolog公司于1989年开发成功[8]，

[7][6]

[2]

[1]

至今已能鉴定包括细菌、酵母菌和霉菌在内的2000多种病原微生物和环境微生物，Biolog菌种鉴定有以下特点：(1)Biolog系统数据库容量大，种类齐全，操作者可建立适合自己的数据库，生态环境领域应用非常广泛；(2)鉴定周期短，可在16-24h内鉴定出结果，鉴定结果准确率高；(3)与传统方法相比，Biolog系统操作标准化，简便、快捷、省却了传统方法的繁杂。

本研究即采用Biolog微平板分析方法，对滴水湖沉积物中的微生物多样性进行分析，研究结果将为人们更深入地掌握滴水湖微生物的分布特征、功能与作用，更好地开展滴水湖生态环境研究和保护提供科学参考。

[9]

1材料与方法

1.1 样品采集与保存

在滴水湖湖心（图1），以洁净采泥器于湖心底部采集底泥，将所采样品装入准备好的无菌塑料袋中，带回实验室进行后续分析。

图1 滴水湖湖心采样点示意图

Fig.1 Sample station in the center of Dishui lake

1.2 菌落计数

将采集的沉积物样用无菌水稀释成10-1、10-2、10-3的稀释液，每个稀释倍数分别取0.1mL稀释液接种到已配置好的BUG+B（Biolog通用培养基加羊血）培养皿中

[10]

，每个稀释倍数

做三个平行，分别编号为A1、B1、C1；A2、B2、C2；A3、B3、C3，在30℃恒温培养箱中培养24h。

观察24h后的菌落生长情况。本试验中，10-2稀释倍数的菌落生长最为分明，因此取该稀释倍数的三个平行，即A2、B2、C2培养皿,采用迅数HR1-菌落自动计数仪（Shineso HR1-Auto colony counter）进行偏差可调统计菌落计数。 1.3 优势种的确定及菌种特性分析

比较各培养皿上菌落的色泽、表面形状、透明感、隆起状况及边缘形状，以判断菌落类型。将全部培养皿中均出现的菌落进行标记，并对其进行后续的纯化培养。

对分离纯化后的1-8号菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌落的颜色和形态，确定该菌是阴性菌还是阳性菌、是球菌还是杆菌。革兰氏染色为紫色的阳性球菌为GP-COCCUS，革兰氏染色为紫色的阳性杆菌则需要进一步观察其是否产芽孢，若产生芽孢则为GP-ROD SB，不产生芽孢为GP-ROD。革兰氏染色为红色的阴性菌，将进行氧化酶试验，氧化酶阳性为GN-NENT；氧化酶阴性则要做三糖铁实验。如果三糖铁实验为K/K（即“碱性/碱性”，显示颜色为“红/红”）或K/AW（即“碱性/微酸性”，显示颜色为“红/微黄”），则为GN-NENT；A/A（“酸性/酸性”，显示颜色为“黄/黄”）或K/A（“碱性/酸性”，显示颜色为“红/黄”）则为GN-ENT。以此确定扩大培养基的类型、培养温度和制备菌悬液的接种液的类型[11]。 1.4 优势菌种的鉴定

在完成纯种菌落的十字扩大培养后，采用干管分离技术挑取培养皿内每条边外半部分的菌落（图2），用相应接种液将菌落制备成相应浊度的菌悬液，使用八道电动移液器，将其接种于相应鉴定板的96孔中，每孔150uL。将鉴定板放置在一个大小相宜的托盘中，并保

持一定的湿度于培养箱中培养上读取数据。

[12]

。将培养20h的鉴定板放置到Biolog微生物自动分析系统

图2 培养皿内菌落挑取区域示意图

Fig.2 The selective area of bacterial colony in Petri dish

2结果与分析

2.1 细菌总数及优势种的确定

本次采样中，滴水湖沉积物（湿样，含水率为27.5%）中细菌总数为2.43×10CFU/g。表1为10、10、10三个稀释倍数的BUG+B培养基上出现的菌落情况。其中1-8号在全部稀释倍数的培养皿中均出现，因此将其作为滴水湖沉积物中的微生物优势种，并对其进行后续的纯化培养。9-20号菌落仅在个别培养皿中出现，因此未列入优势种，但菌落仍加以保存。

表1 滴水湖不同稀释倍数下菌落生长分布表

Table 1 Bacterial colonies’ growth distribution under different dilution of Dishui lake 菌落 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

A1 + + + + + + + + +

-1

-2

-3

4

10-1

B1 + + + + + + + + -

C1 + + + + + + + + -

A2 + + + + + + + + -

10-2

B2 + + + + + + + + +

C2 + + + + + + + + -

A3 + + + + + + + + -

10-3

B3 + + + + + + + + -

C3 + + + + + + + + -

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

- - - - - - - - - - +

- - + - + - + - - - -

+ - - + - + - - - - +

- + - - + - - + - - -

- - + + - - - - - + -

- - + - + - - - + - -

- - - - - + + - - - -

- - - + - - - - - + +

- - - - - - - - - - -

注：“+”表示在培养皿中有生长；”-”表示在培养皿中未见生长。

2.2 优势菌种特性分析

平皿培养显示：1、3、5号菌落呈黄色圆形、表面光滑较湿润且半透明、边缘规整，其中1号菌落面积最大，平均直径为5-6mm，5号菌落平均直径为2-3mm，3号菌落最小，平均直径为1-2mm；6、8号菌落呈浅黄色且中心颜色较深、湿润、形态略凸起，其中6号菌落面积较大，平均直径为4-5mm，8号菌落平均直径为1-2mm；2号菌落呈灰白色、圆形突起、边缘规整、表面光滑，菌落直径为2-3mm；4号菌落呈现黄色、菌落面积较小、略凸起、光滑、边缘规整，菌落直径为1-2mm；7号菌落呈灰白色、不透明、表面较粗糙、多皱褶，菌落直径为3-4mm。优势菌种的特性分析结果见表2。由表2可知，纯化后的菌落经革兰氏染色，7株菌落为革兰氏阴性，主要为红色短杆状和孢子状细菌；1株菌落为革兰氏阳性，为芽孢杆菌类。滴水湖沉积物优势菌落中革兰氏阴性菌占87.5%。

滴水湖沉积物中优势菌落特性分析表

Identification of dominate Bacterial colonies’ characteristics in sediment of Dishui lake 菌落 革兰氏

氧化酶 三糖铁

编号 染 色 1 2 3 4 5 6 7 8

阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性

阳性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 -- 阳性

-- K/AW -- -- -- -- -- --

类 型 GN-NENT GN-NENT GN-NENT GN-NENT GN-NENT GN-NENT

养基类型 BUG+B BUG+B BUG+B BUG+B BUG+B BUG+B

养温度 30℃ 30℃ 30℃ 30℃ 30℃ 30℃ 30℃ 30℃

类 型

浊度

GN/GP-IF 52%T GN/GP-IF 52%T GN/GP-IF 52%T GN/GP-IF 52%T GN/GP-IF 52%T GN/GP-IF 52%T GN/GP-IF 28%T GN/GP-IF 52%T

微生物

扩 大 培

扩大培

接种液

接种

GP-ROD SB BUG+M+T GN-NENT

BUG+B

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/pkig.html