双水相萃取技术在生物活性物质分离提纯中的研究进展

双水相萃取技术在生物活性物质分离提纯中的研究进展

摘要：双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视,它与传统的萃取方法相比有独特的优点。本文将简要综述双水相萃取技术的基本原理、在分离提纯生物物质中的应用情况以及今后的发展方向。 关键词：双水相萃取；生物活性物质；分离提纯

Separation and Purification of Bioactive Substances in

Aqueous Two-phase Extraction in Progress

Name: Chen Zhi-bin Student ID: 201011130798 Professional: Biological Chemical Class: 13 classes

Abstract: Aqueous Two-phase Extraction technology has received increasing attention as a new separation technology, which is compared with the

traditional extraction methods has unique advantages. This article will briefly summarize two-phase extraction technology through the basic principle of

separation ， purification of biological substances in the application and future development direction.

Key words: aqueous two phase extraction; biologically active substances; separation and purification

随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开各种生化新产品不断涌现，但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的，对分离条件以及环境要求极其苛刻，使得传统的液液萃取已不能适应分离要求，因此一种新型的液液分离技术双水相萃取技术—双水相萃取应运而生。双水相萃取(Aqueous Two—Phase Extraction，ATPE)技术是为适应生物工程的迅猛发展，于六十年代首先由瑞典的P．A．Albertson等提出的。近年，双水相萃取技术因设备投资少，操作简单，引起了人们极大的重视，并且被广泛用于生物化学，细胞生物学和生物化工等领域[1]，涉及到细胞、膜、病毒、蛋白质、核酸以及其他天然药物有效成分的分离及提纯[2]。由于它具有活性损失小、分离步骤少、操作条件温和，且不存在有机溶剂残留的问题等优点，所以在生物活性成分及天然产物有效成分的提取分离方面有良好的应用前景。

1. 双水相萃取相关理论的发展

早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称为聚合物的不相溶性，从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system，ATPS)。

1955年由Albertson首先利用两水相技术分离生物分子，他主要研究了聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)系统和PEG/(NH4)2SO4系统在分离提纯中的应用。在随后的几十年中，这项技术有了长足的发展。在双水相的分离模型研究中，主要提出了两类模型[3，4]，Edmond等人提出的渗透维里模型，即Edmond bgston方程；Flory和Huggins根据热力学的基本原理提出Flory—Huggins晶格模型。前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度，后者在粒子的能量概念上可以很好地拟合实验数据。自20世纪80年代中期以来，各国学者开展了进一步的研究工作，各类用于计算生物物质在双水相系统分配系数的模型也时有报道,诸如Baskir晶体吸附模型[5]、Hayne模型、Pitzer模型[6]、Grossman自由体积模型等,但结果均难以令人满意。1989年,Diamond等[7]以Flory Huggins理论为基础,用把相间电势表达为上下相浓度差的二次函数来关联分配系数的方法,提出了能对肽和蛋白质在聚合物/聚合物/水体系的分配系数很好关联的Diamond Hsu模型。此后,针对用该模型计算蛋白质在聚合物/盐两水相系统中的分配系数时精确度不高的缺点,Diamond等提出了改进的Dim ond Hsu模型，进一步提高了Diamond H su模型的精确度和普适性。Pessoa等[8]通过引入对聚合物水溶性和预分离物质(氨基酸、肽、蛋白质的水化壳进行描述的因子得到了Flory—Huggi改进模型，此模型很好地模拟了73种由PEGDex组成的双水相体系的相平衡和分配系数。

虽然双水相萃取技术在应用方面取得了很大进展，但目前这些工作几乎都只是建立在实验数据的基础上，至今还没有一套比较完善的理论来解释物质在体系中的分配机理。

2.双水相萃取技术基本原理

1.1双水相的形成

将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然地分成互不相溶的两相。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离倾向也就越大。与一般的水)有机溶剂体系相比较，双水相体系两相的性质差别(如密度和折射率等)较小。由于折射率的差别甚小，有时甚至都难于发现它们的相界面。两相间的界面张力也很小，仅为10-6~10-4N/m(一般体系为10-3~10-2N/m)。界面与试管壁形成的接触角几乎是直角。原则上，无论是天然的还是合成的亲水性聚合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时都可分成两相，构成双水相体系部分双水相系统列于表1。用于生物分离的高聚物体系有:聚乙二醇(简称PEG)/葡聚糖(简称Dexteran)和PEG/Dextran硫酸盐体系。常见的高聚物/无机盐体系为:PEG/硫酸性或磷酸盐体系。

表1各种双水相系统

聚合物1 聚合物2或盐 聚合物1 聚合物2或盐 聚丙二醇 甲基聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙烯醇

聚乙二醇 聚乙烯吡咯 聚乙烯醇 烷酮 聚乙烯吡咯烷酮 葡聚糖 羟丙基葡聚糖 聚蔗糖 葡聚糖

乙基羟乙基纤维系 葡聚糖 羟丙基葡聚糖 葡聚糖 聚丙二醇 硫酸钾 聚乙二醇 硫酸镁 聚乙二醇 硫酸铵 聚乙烯吡咯烷酮 硫酸钠 甲氧基聚乙二醇 甲酸钠

酒石酸甲钠

甲基纤维素 甲基纤维素 葡聚糖

聚乙烯醇或葡聚糖 羟丙基葡聚糖 聚乙烯吡咯烷酮 羟丙基葡聚糖

1.2萃取原理[9]

双水相萃取与水有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示：

K= C上/ C下

其中K为分配系数，C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。 分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律，即“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。

3. 双水相萃取的应用

双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域，并取得了许多成功的范例，主要是分离蛋白质 ，酶，病毒，脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸，DNA的分离，干扰素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗体等。下面就生物活性物质的应用进行阐述。

3.1在发酵工程中的应用

由于发酵液中成分比较复杂，目标产物含量低，而传统的分离纯化方法步骤繁琐，导致产品回收率低，成本居高不下。目前国内外已经有利用双水相休系从发酵液萃取分离目标产物的报道和研究，并取得了一些成绩。

Pan等[10]利用PEG 1500/NaH2PO4体系从Trichoderma koningi i发酵液中分离纯化木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。M aria等[11]利用PEG1000/NaH 2PO4体系从Fusarium solanipisi发酵液中分离纯化

角质酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率91%，纯化倍数4.1。Mirjana[12]利用PEG 4000/Dex体系从Polypor ussquamosus发酵液中分离果胶酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率80.2%，纯化倍数2.45。Martinha[13]利用PEG 8000/(NH 4)2SO4体系从K l uy v er omy cesmar x i anus发酵液中分离胞外多聚半乳糖醛酸酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率91%，纯化倍数19。冯菁等[14]采用质量分数8%的PEG4000、质量分数为13%的Na2 SO4和质量分数为6%NaCl组成的双水相直接从重组巴氏毕赤酵母发酵上清液中分离人溶菌酶，双水相萃取率达到96.63%，纯化因子为6.5。黄瑛等[15]采用质量分数10%的PEG 2000、15%的磷酸盐和1%的NaCl组成的双水相系统从洋葱假单细胞G 63发酵粗酶液中提取脂肪酶，当系统的pH为8.0时，分配系数4.36，纯化因子3.98，脂肪酶的回收率达到87.25%。

3.2在药物方面的应用

薛珺等[16]采用PEG 800与吐温80组合表面活性剂、硫酸铵、水形成双水相体系萃取芦丁，芦丁在该双水相体系的平均萃取率为95.0%。谢涛等[17]利用PEG 4000/K2HPO4组成的双水相体系从三七中萃取三七皂苷，三七总皂苷的分配系数为14.2，回收率为96%；赵爱丽等[18]利用质K2 H PO4组成的双水相体系分离纯化黄苓苷，黄苓苷的分配系数达到29.8，收率达到98.6%。石慧等[19]利用质量分数25%PEG 400、质量分数为12%(NH4)2SO4和质量分数为3%NaCl组成的双水相体系从加杨叶萃取液中萃取加杨叶总黄酮，萃取率达到95%以上。朱自强等[20]用质量分数8%的PEG 2000与质量分数为20%的(NH 4)2 SO4组成的双水相系统直接处理青霉素G发酵液，分配系数高达58.39，浓缩倍数为3.53，回收率为93.67%。

3.3在生物工程中的应用

双水相技术作为一种生化分离技术，由于其条件温和，易操作，可调节因素多，并可借助传统溶剂萃取的成功经验，而被认为是一种生物下游工程初步分离的单元操作。

Babu[21]等用质量分数18%的PEG 1500与质量分数为14%的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取菠萝蛋白酶和多酚氧化酶，菠萝蛋白的纯化倍数为4.0，酶活回收率达到22.8%，下相多酚氧化酶的纯化倍数为2.07，酶活回收率达到90%。

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