分析化学课程论文作业2012好精彩哟 第五辑

《分析化学》课程作业

2012 第五辑

南京财经大学食品科学与工程学院

《分析化学》课程组

2012.08

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目 录

一个快速从大肠杆菌中萃取外膜蛋白质的选择性过程 ........................ 3 食品真菌毒素测定研究进展 .................................................................. 14 蛋白质的测定方法及其研究进度 .......................................................... 18 钙的测定方法及其研究进展 .................................................................. 21 食品真菌毒素的分析测定研究进展 ...................................................... 24 纤维素的测定方法及其研究进展 .......................................................... 27 木糖醇的制备、测定方法与技术 .......................................................... 31 蛋白质的测定方法及其研究进展 .......................................................... 34

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一个快速从大肠杆菌中萃取外膜蛋白质的

选择性过程

堪萨斯街纳蒂克士兵中心美国陆军士兵生物化学司令部 Steven Arcidiacono,* Michelle M. Butler,+ 和Charlene M. Mello*,1 马萨诸塞州纳蒂克 01760;和一个创新驱动公司Microbiotix，马萨诸塞州伍斯特01605

蔡丹林 译自：蛋白表达与纯化25,134-137(2002)

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于2001年7月12日收到，在2001年12月26日修改后收录 孔蛋白是在外膜中几个革兰氏阴性细菌里发现的必不可少的成孔蛋白。调查分子结构之间的关系和功能需要一个极其费时又费力净化过程。我们报告一个可以在样品制备中减少时间和精力的用颉草酸从冻干大肠杆菌细胞中快速提取外膜蛋白OmpF的方法。提取导致了一个高纯度分数包含76％的总蛋白含量的OmpF。取决于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳流动性的表面分子质量是38900，类似于OmpF 单体形式的。N端测序产生了23种与公布的OmpF序列100％相符的氨基酸。OmpF的三聚物的形式被观察到在没有暖气的样本中在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳上运行并且对这些样本定期的酸或银染色的分析显示了游离脂多糖的存在。此外，这种方法应该被证明有助于隔离其他外膜蛋白。

关键词：外膜蛋白，孔蛋白，OmpF，膜通道，有机酸提取

孔蛋白在革兰氏阴性细菌的生理中发挥了重要的作用。（例如：大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌）。一般来说，孔蛋白作为紧密连接三聚物的复合物而存在，这种复合物创建了装满水的能促进在超滤膜中的低分子量的溶质的扩散的通道。大量的研究已经开展来获取详细的结构信息（1.2），阐明脂多糖(LPS)2在蛋白质折叠和通道的形成中的角色（3.4），并且定义溶质运移

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（5.6）。不幸的是，孔蛋白纯化蛋白质需要执行这些结构和功能的研究。尽管文学中的多个报告中，孔蛋白的纯化蛋白质通常是冗长和劳动密集型，需要经过长期孵化项目和多个提取步骤来简单的获得一个孔蛋白富含量分数（2，7-12）。例如，大肠杆菌OmpF的溶解的实现是通过微分抽取，包括几个用洗涤剂溶解不相关的蛋白质的预提取步骤，为了一个丰富的孔蛋白实例（8）紧接着五个连续的用3％辛基（多分散的）的氧化乙烯的提取。最后的净化OmpF是通过凝胶过滤和离子交换色谱法或连续流电泳（2.10.11）。我们报告一个可以在一到二小时内完成的从大肠杆菌细胞中检测OmpF丰富度的单步的方法。颉草酸中OmpF的选择性溶解是可能的，由于它的异常稳定的三聚物复合体。许多研究人员报道孔蛋白三聚物耐蛋白酶，洗涤剂，有机溶剂，广泛变化的pH值从2到13，温度高达70℃（8）。强劲的氢键，静电和稳固OmpF三聚物的疏水作用互相作用在颉草酸中从不中断。用这种方法准备的浓缩的OmpF分数大约含有76％的和脂多糖有关的OmpF。

材料和方法

提取一个浓缩OmpF的准备。 大肠杆菌SG13009 pREP4（德

国快而精公司，查特斯沃斯庄园，CA）发展到midlog（？）在4×介质（30克每升胰蛋白胨，20克酵母提取物，5克氯化钠）含有25毫克/毫升硫酸。细胞被离心分离，在-80℃冷冻冻干后而获得。冻干的细胞被用杵和臼磨成粉末并且每克冻干粉和2毫升的颉草酸一起培养。密理博水被用来稀释混合物的四倍到最后2.3N.（？）的颉草酸浓度。示例在室温条件下被搅拌了一小时，并且为了清除细胞碎片2000克示例被在室温下用离心机分离了十分钟。

SDS-PAGE

澄清上层液在10-20％三甲基甘氨酸的十二烷基磺酸钠-聚丙

烯酰凝胶中运行（英杰公司，卡尔斯巴德，CA）。这些样品是在没有暖气或加热（在95℃下五分钟）的状态下在Laemelli（？）试样载荷缓冲液（25mM Tris-Cl,2％十二烷基硫酸钠,0.1％溴酚蓝，10％甘油）中运行的。蛋白质用7.5%的乙酸30分钟着上了

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考马斯蓝R-250或宝石红（分子探针，尤金，俄勒冈州）的颜色并且用7.5%的乙酸10分钟使其褪色。宝石红染色的凝胶以800V用红色荧光//chemifluorescence（？）模式被显示在风暴860光学扫描仪（分子器件商，森尼维尔市，CA）。蛋白质纯度用测光密度术以图像定量研究软件（分子设备）来被测定。基线通过在图上画两个最低的山谷之间的直线而被建立。LPS的检测是通过定期的酸/硝酸银（对氨基水杨酸）染色（13）。简单的说，凝胶是用0.7%周期性的酸被固定和处理的，紧接着被用一个Sigma AG25银染色工具包染色。 浓缩OmpF分数的表征。

在一个十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳中的单体带被蛋白质转渍到一个PVDF膜上，N端测序在一个聚乙烯/应用生物系统492上被执行。一个基本的局部对比搜索工具（BLAST2.0）搜索的蛋白质识别资源数据库（蛋白序列数据库）（国家生物技术信息中心，美国医学图书馆/NIH）是用来识别蛋白质的。蛋白质的定量分析是用伯乐蛋白质化验（大力神，CA），使用牛血清白蛋白作为标准来确定的。 结果和讨论

用颉草酸直接裂解的大肠杆菌细胞生成了一个高纯度的孔蛋白示例。OmpF单体是主要的在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中可视的蛋白质带，在一个明显的分子质量为38900中迁移。这个带代表了76%的由测光密度术决定的蛋白质（图.1B）。总蛋白质的浓缩OmpF分数的含量是由伯乐蛋白质化验2.7毫克/g蛋白质干电池颗粒或2.1毫克OmpF/g干电池由光密度计计算出的纯净的重量所确定的。到目前为止，这是最快速OmpF浓缩过程和收益率最高的OmpF纯度（2，11）。这种方法被证明可能是一个在对孔蛋白提纯的详细的结构和功能研究中很有用的工具。N端测序分析被执行来识别38900-Da蛋白质带并且得出了AEIYNKDGNKVDLYGKAVGLHYF（？）序列。一个蛋白序列数据库的BLAST搜索识别了大量的与孔蛋白校准后有80%以上相似度的蛋白质序列。大肠杆菌OmpF蛋白（加入MMECF？的蛋白序列数据库）序列（14）产生了在氨基酸水平上和N端序列100%相似的数据。这份被发表序列的校准和N端序列数据如图二所示。OmpF的数量和纯度在原油提取中依赖于使用的颉草

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酸的体积。并不是所有的OmpF是以最初的细胞裂解来提取的。额外的OmpF和其他污染蛋白质用颉草酸重复洗涤来重新获得。因此，高分数下的OmpF纯度是由全部可获得的OmpF蛋白的一些损失来实现的。没有任何证据表明在初始裂解时的三聚物形式或是任何洗涤物是建立在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶体电泳的基础上（见图一A）；然而，样品在十二烷基硫酸钠出现在电泳之前被加热了。单体在加热后出现与先前发表的外膜蛋白的结果是一致的。蛋白三聚物在十二烷基硫酸钠中是稳定的，但是当加热到100℃时将断开并且迁移为单体。当样品装载没有暖气时，一个与三聚体混合物有关的键出现了带有明显的63100的分子质量（图三A）。这远低于三聚物预期将迁移的相对质量。然而，基于他们在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳中的迁移的外膜蛋白的识别由于异常流动经常弄错。也许酸的存在阻止了满三聚物形成或是导致了电泳迁移的改变。

通过用考马斯蓝进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳对富含OmpF的分数的分析和周期性的酸/银染色揭示了未成键的脂多糖的存在。通过糖元染色而可见，在相对分子质量在6000于36000之间迁移的化学键并不符合于在考马斯蓝染色的凝胶中所见到的任何蛋白质键。他们似乎是与OmpF蛋白不直接相关的自由形式的脂多糖。在样品加热时和可能扰乱强劲的氢键和三聚物中相互的疏水作用，一个有着估计分子质量在100000到200000之间的异构的脂多糖的群体被释放出来了。与单体一致的区域和三聚物键相互染色。用银染色方法反应的脂多糖中的一部分被认为是核心多糖。如果脂多糖与单体或是三聚物键成键，它不会与特定的糖类银染色反应。这可能是由于不够浓缩的脂多糖或是对这些反应性的将导致银染色抑制的集团的屏蔽。因此，很难识别出任何紧密成键的脂多糖的存在（见图三B）。许多富含OmpF的分数有成键且自由形式的脂多糖。自由形式常被凝胶过滤色谱去除,绑定形式很大一部分被用离子交换色谱法和超滤去除了。两种形式的脂多糖都是通过银染色来实现可见的。然而，这仍然是一件需要讨论蛋白质的结构和功能怎样批判性的决定于凝胶的存在的问题。传统的孔蛋白的净化需要原油蛋白/外膜提取的隔离和为了去除脂多糖和污染蛋白质的后续措施。我们展示了一个一步到位的在室温下用颉草酸和基本的实验室设备和

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内能从大肠杆菌中提取丰富OmpF的方法。进一步纯化步骤没有尝试。然而,为发展几个外膜蛋白（2，7，8，12，13）的色谱（凝胶过滤和离子交换）和电泳分离可能和被标记的颉草酸提取程序被利用来生成一个高纯度的蛋白质样本。最后，OmpF与其他外膜蛋白有着很大的相似性，这表明了这种方法对把不同的孔蛋白从其他革兰氏阴性细菌中隔离出来可能是有效的。 图1.

（A）10-20%三甲基甘氨酸十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳的OmpF被从颉草酸溶解产物中染成了宝石红色。渠道1：马克12分子量标准（Novex）；渠道2：颉草酸大肠杆菌原油的一部分，在十二烷基硫酸钠的存在系在95℃下煮五分钟。（B）颉草酸从大肠杆菌细菌中用宝石红染色10-20%三甲基甘氨酸胺凝胶电泳来进行微酸提取。高峰与在一个明显的分子质量为38900上迁移的OmpF单体相一致。这个峰代表了峰值总面积的76

Fig2.

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校准大肠杆菌外膜蛋白前体和N端序列结果。和发布的大肠杆菌OmpF蛋白（加入MMECF的蛋白序列数据库）序列有100%相似度。N端序列筛留物1与发布的OmpF前体的筛留物23序列相匹配。发布的序列前体的筛留物1-22代表了一个在功能OmpF蛋白中未被发现的信号序列（14）。

Fig3.

（A）大肠杆菌中的富含OmpF分数被用10-20%三甲基甘氨酸胺凝胶电泳染成了考马斯蓝。渠道1：马克12分子量标准（Novex）；渠道2：不加热；渠道3：在95℃下五分钟。（B）周期性的从大肠杆菌里对富含OmpF分数用10-20三甲基甘氨酸胺凝胶电泳进行酸/银染色。渠道1：不加热；渠道2：在95℃下五分钟。键在分子质量为36000和更小的中迁移没有在考马斯蓝染色的凝胶中出现，表明了他们是自由形式的脂多糖。

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收获时间及压榨方法对直馏橄榄油中抗氧化剂（酚类化合物，α-生育酶和β-胡萝卜

素）含量的影响

E. Gimeno, A.I. Castellote, R.M. Lamuela-Ravento′ s, M.C. De la Torre, M.C. Lo′ pez-Sabater*

Departmento Nutricio′ i Bromatologia, CeRTA, Facultat de Farma`cia, Universitat de Barcelona, Avda. Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona, Spain

Received 7 March 2001; received in revised form 20 November 2001; accepted 6 December 2001

生工 程倩倩 03论文翻译

梗概

我们学习了收获时间及两种加工方法(两相离心机和三相离心机)对橄榄油品质的影响.从品质较好的橄榄中榨出来的有不能从游离酸度、过氧化值和紫外光吸收作用这几方面区分出来。同样从脂肪酸组分上也不能区分我弄出来。然而，未成熟的橄榄中的抗氧化剂的含量比成熟的橄榄中含量高。另一方面，我们也测试出压榨方式的不同对α-生育酶和β-胡萝卜素的存在也无关，然而，由于加入了温水来稀释橄榄浆体因此二相分离法所分离出来的产物中酚类化合物的含量较高。

1、简介

在人群中，伊橄榄油为油脂的主要来源的人动脉硬化的发病率比其他人低(Assmannet al., 1997; Caruso, Berra, Giovanini, Cortesi, Fedeli,& Galli, 1999; Mancini, Parfitt, & Rubba, 1995)。三酰基甘油包含大约98%的油脂，其中油酸为其主要的脂肪酸。从第一次冷榨中获得的直流橄榄油，包含了一系列的抗氧化剂以及香气成分(Montedoro, Servili,Baldioli, & Miniati, 1992; Visioli & Galli, 1998)。橄榄油对我们的益处不只局限于它很高的不饱和与饱和脂肪酸的比值，也在于它富含的众多抗氧化剂，像维他命E、类胡萝卜素和酚类化合物。有些研究表明，直馏橄榄油中的抗氧化剂可以通过改变LDL的氧化所用和其在动脉壁上的粘附性来减小癌症以及动脉硬化的发生率(Caruso et al., 1999; Visioli &Galli, 1998)，这些抗氧化剂对油的稳定性也有较大的影响(Caruso et al.,1999; Di Giovachino, Solinas,& Miccoli, 1994; Montedoroet al., 1992; Papadopoulos & Boskou, 1991;Ranalli & Martinelli, 1995)。

由于橄榄油是大自然的产物，它的化学性质多变，橄榄抗氧化剂的活性由诸多因素影响，比如橄榄的种类、栽种环境以及橄榄的压榨方式(Bruni, Cortesi, & Fiorino, 1994; Salas,

Pastor,Castro, & Vega, 1997)。直馏橄榄油是未经提炼消耗的，因此它包含了一些不可皂化的结构，特别是容易在精炼过程中被损耗的酚类化合物(Caruso et al., 1999;Ragazzi & Veronese, 1973).。

传统的橄榄油的压榨，是基于碾盘式破碎机与液压机的共同作用，但其并非一个连续的系统，并且这个转化过程的成本较高(Ranalli & Martinelli, 1995)。在1965年，橄榄油的压榨方式

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变为了三相离心机（带水平轴）压榨，这种方法可将油、水、橄榄外壳从橄榄浆体中分离出来(Ranalli & Martinelli, 1995)。由于这种离心机系统大大的减少了生产时间，也随之减短了橄榄的过多的储藏时间，所以往往这种方式得到的橄榄油的品质更高(Alba, 1997; Angerosa & di Giovaccino, 1996;Ranalli & Martinelli, 1995)。然而这种压榨方法要求在压榨的过程中加入温水来稀释橄榄浆体，由于酚类化合物在水中的溶解度很高导致了加入温水后这些酚类化合物的浓度降低了(Angerosa & di Giovaccino, 1996; Di Giovacchino et al., 1994)。这种压榨方式存在的另一个问题是有价值的水的生成是否值得考虑让其增加。因为废水的处理所需的花费也相当的大。在1992年，一些橄榄油产商采用了一种能使油相从橄榄浆体混合液中不加入温水就可以将其分离出来的心得倾析模式，而且这种新的倾析洗涤器的使用产生的植物水可忽略不计(Angerosa & di Giovaccino,1996)。由双相倾析洗涤器压榨的橄榄油有着更高浓度的生育酶以及酚类的含量并且其抗氧化稳定性比那些由三相倾注洗涤器更强(Angerosa, & diGiovaccino, 1996; Di Giovacchino et al., 1994; Ranalli& Martinelli, 1995)，尽管两相倾注洗涤器已经分布很广泛了，但是有些机械设备厂商仍然遵循传统的方式进行生产，三相倾注洗涤器通过简单的调节碾压机就可以变成两相倾注器。

先前的研究已经对压榨系统对橄榄油中的抗氧化剂的浓度的影响进行了评价(DiGiovacchino et al., 1994; Nergiz & U¨ nal, 1991;Ranalli & Angerosa, 1996).。然而，橄榄的成熟问题对其影响在这些研究中并未提到。这份调查的目的是研究压榨系统以及某些橄榄油中的组分的完善等级的影响：质量参数、脂肪酸、酚类化合物、维他命E和β-胡萝卜素的含量。这个实验用了两种不同成熟度的橄榄以及两种不同的压榨体系----两相沉淀式离心机以及常见的三相离心机进行实验。

2、材料及压榨方式 2.1 直馏橄榄油

由Arbequina种类所组成的60组样本中有两种种类----Catalonia, Les Garrigues 和Siurana，有the Olive Oil Cooperative Association of Catalonia提供的两种农作物（1997-1998,1998-1999）构成。

这些样本根据压榨方式的不同以及收获时间的不同被分为四组。每一个生产者都要提供橄榄成熟的信息以及所使用的技术。通过100组的随机抽样并通过视觉上的视察与计算后得到的成熟指数（MI）。根据下面公式(Hermoso, Uceda, Garc?′a-Ortiz, Morales,Fr?′as, & Ferna′ ndez, 1991):MI=(a - 0)+(b -1)+(c- 2)+(d - 3)+(e -4)+(f - 5)+(g - 6)+(h -7)/100.a,b,c…代表橄榄的颜色等级，从深绿到深黑。两个成熟的阶段分别为（1）从11月到12月（2）从1月到2月。A组包括从未成熟的橄榄（MI=1.48-2.46）由两项法所得到的油，B组包括从成熟的橄榄

（MI=3.10-4.65）用相同的方法所获得的油。C组是由未成熟的橄榄（MI=1.59-2.55）用三相法所得到的油，D组是由成熟橄榄（MI=3.00-4.65）用相同方法所得到的油。 所有获得的橄榄油样本被储藏在茶色玻璃瓶，4℃环境中知道被分析。 酸性、过氧化值和紫外吸收度（K270）由The Regulation EEC/2568/91 of the European Union Commission中所描述的方法进行分析测定。

脂肪酸呗转化为甲酯并用带火焰离子化检验仪（FID）的Hewlett Packard 6890气体色谱分析法进行分析。分理出来的甲酯在融融的石英柱(30 m_0.20 i.d.)覆盖了SP-2330固定相[poly (80% biscianopropyl–20% cyanopropylphenylsiloxane),0.20 mm film thickness] (Bellefonte, PA, USA)。从色谱科方面，split-splitless注射器在分流比1：30中使用。我们采用HP7673自动液体采样喷油器，注射器中样品的量为1μl。注射器与检测器分别被置于250℃与270℃的环境中。烘箱的温度被设定为180℃的恒温。氦气被用为搬运气体，以22.5cm/s的直系速率移动，氮气被用作补充气。色谱科的记录则用HP-Chemstation for GC systems所记录（Software

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G2079AA,verdion A0402）定量测定按国际标准进行。

α-生育酶和β-胡萝卜素由反相高性能色谱分析法（RP-HPLC）测定，由Gimeno, Calero, Castellote, Lamuela-Ravento′ s, dela Torre, and Lo′ pez-Sabater (2000)的方法进行。简略的描述一下这方法，它涉及一个急速皂化反应以及随后与己烷-乙烷醋酸盐的压榨。这个色谱系统有一个甲醇-水-丁醇为流动相的ODS-2色谱柱以及二极管阵列检验测定器（DAD）组成。 酚类化合物从水-甲醇（60:4 v/v）的三倍压榨系统的己烷-橄榄油溶液中被隔离出来。所有的苯酚与咖啡酸所表现的性质几乎相同（ppm）。由UV-visible(UV-160A)分光光度计(Shimadzu,Kyoto, Japan)在765nm，用Folin-Ciocalteu试剂中测得(Swain & Hillis, 1961)

2.2：统计分析

这个实验呗反复进行。这些结果显示一系列平均值与标准偏差。这个讨论建立在方差（ANOVA;P＜0.05 )的单程分析之上。所有的统计学分析都用了 SPSS of windows statistical package(Release 8.0)

3、结果与讨论

3.1：酸度、过氧化值和光谱光度测量的指数（K270） 所有的橄榄油都是由高质量的橄榄压榨而来，并且都符合由欧洲委员会所制定的特定的纯度，所有的样品参数分析都在其名称所能接受的等级之内。没有任何参数显示出两种压榨方式甚至是两种收获时间的橄榄压榨出来的油有什么区别。表1详述了每组的结果。 3.2：脂肪酸组分（表1）

脂肪酸的组分不受压榨方式或成熟度的影响，因为所有的橄榄油都是由同一种类的橄榄压榨而来的，脂肪酸的主要成分是亚油酸（69-75﹪）、棕榈酸（13-15%）、亚麻油酸（9-11%）、硬脂酸（1.5-2%）以及棕榈油酸（1-1.5%）这些结果获得了Hidalgo等专家的认可（1993）。并且Gutierrez,Jimenez, Ru?′z, and Albi (1999)描述了在成熟的过程中亚麻油酸稀释酶的增加，油酸稀释酶可将亚油酸转化为亚麻油酸。他们也注意到在成熟的过程中棕榈酸与亚麻油酸之间的转化。然而，由于他们研究的成熟范围比我们的大，所以这些结果没有比较性。 3.3：α-生育酶（表2）

我们没有发现使用任何一个方式对两种成熟状态的橄榄进行压榨油什么不同（P=0.099）。尽管抗氧化剂的含量在成熟的过程中自始至终在减少(Agramont, Lo′ pez,Boatella, & de la Torre, 1986; Gutie′rrez et al., 1999)，α-生育酶在这过程中所受的影响最小(Gutie′rrez etal., 1999)，就如Ranalli和Angerosa（1996）所提，似乎没有一种技术能够影响其α-生育酶的含量（P=0.283） 3.4：β-胡萝卜素（表2）

β-胡萝卜素子啊不同的成熟度时含量不同这一现象很显著。未成熟的橄榄中β-胡萝卜素的含量远超成熟的橄榄中β-胡萝卜素的含量（P=0.001）。而两种压榨方式却无重大影响（P=0.748）。这些结果获得了Gutierrez等专家的认可（1999）。 3.5：多酚化合物

表2显示了酚类在橄榄成熟过程中的减少，此结果被Gutierrez所认同（1999）。然而，最显著的区别是在两种不同的压榨方式间发现的（P=0.016）。在压榨过程中，两项倾注洗涤器比三相倾注洗涤器保存了更多的酚醛树脂。Ranalli和Angerosa（1996）用其他种类的橄榄做实验时也发现了相同的结果。根据酚类的分配系数与浸出温度，酚类可溶于油浆中的水或者油中。在三相分离法中，水的加入改变了其在液相中的分配系数，并且通过稀释水相减少了酚类在油性阶段的浓度。因此，将水加入橄榄油中使酚类的水溶性发生了移动。然而，由于α-生育酶和β-胡萝卜素的高脂溶性，所以他们不受影响。

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4、结论

1、未成熟的橄榄中与成熟的橄榄压榨所得的橄榄油相比，有更多的β-胡萝卜素和酚类化合物的含量，并且含较少的α-生育酶。

2、关于压榨方式：两相法似乎保留下来的酚醛树脂的含量比三相法的高。由于酚类的水溶性强于α-生育酶和β-胡萝卜素，所以当三相法加入温水时的酚类的含量减少了。 3、这结果证明二相法可提炼出具有更高营养价值的橄榄油。

References 略

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食品真菌毒素测定研究进展

牛晨启 生物工程1101 4104110130

摘要 真菌分布广，产生毒素污染粮食及食品，造成了严重的损失。

关键词 真菌 毒素 污染 损失 测定

前言

真菌广泛分布于自然界，种类繁多、数量庞大。真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，由于真菌的生物学特性，它污染的对象主要是潮湿的或半干燥的贮藏食品，因此粮食、大豆、坚果、调味品污染尤为严重。据联合国粮食与农业组织（FAO）报告，全球约有25%的农作物遭受真菌及其毒素污染，约有2%的农作物因污染严重而失去营养和经济价值，由此而造成的直接及间接损失可能达到数百亿美元。

1、产毒真菌种类 真菌种类繁多，不同真菌可以产生相同的毒素，如黄曲霉和寄生曲霉都产生黄曲霉毒素，曲霉菌和青霉菌都能产生赭曲霉毒素。 2、真菌毒素的危害及致病机理

真菌毒素普遍存在于农副产品或动物饲料中，农作物在生长收割加工储藏及运输过程中都会暴露或接触到产毒真菌，从而受到侵染 据统计，全世界每年由于霉变污染真菌毒素引起的农产品和工业原料的损失达数百亿美元。 真菌毒素污染范围广，具有致畸 致癌和致突变性等特性，对人类危害较大 食品中几种常见真菌毒素的致病机理大致如下：（1）黄曲霉毒素：有致癌性，可抑制 DNARNA 的合成，破坏凝血机制及某些酶类；（2）赭曲霉毒素：可抑制 ATP 酶琥珀酸脱氢酶以及细胞色素 C 氧化酶，从而对羟化过程产生影响；（3） 单端孢霉烯族毒素：主要是抑制蛋白质RNA DNA 等大分子物质的合成，破坏细胞膜和酶类的功能，对造血系统和免疫系统有较强的毒作用；（4）玉米赤霉烯酮：具有显著的雌性激素作用，对动物和人的生长发育及生殖系统有很强的影响和破坏作用；（5）伏马菌素：不仅被证明是强促癌物而且是完全致癌物；（6）串珠镰刀菌素 ：主要作用增殖活跃的细胞，抑制细胞蛋白 质 DNA 合成，干扰细胞分裂增殖，对生物膜通透性和丙酮酸脱氢酶谷胱甘肽过氧化物酶活性有明显影响，同时引起机体过氧化损伤；（7）橘霉素：在线粒体内聚集且干扰电子传递系统，导致 DNA 合成受到抑制，并进一步使 RNA 和蛋白质合成受到抑制，肝糖原下降，胆固醇和甘油三酸脂合成受阻

3、真菌毒素的检测方法

真菌毒素的检测方法很多，概括起来有生物鉴定法化学分析法仪器分析法和免疫分析法等。从最初以薄层色谱法为主，发展到气相色谱法高效液相色谱法免疫学检测技术（主要包括放射免疫检测技术免疫酶技术免疫荧光技术和免疫电镜技术等）等多种方法的普遍应用。其中现代真菌毒素的快速分析方法主要以酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫亲和层析法为主。

3.1 生物鉴定法

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生物鉴定法是一种传统普遍使用检测结果最直观的方法 。利用真菌毒素能影响微生物水生动物家禽等生物体的细胞代谢来鉴定真菌毒素的存在 其方法专一性差，灵敏度低，一般只作为化学分析法的佐证 其特点是待检样品不需很纯，主要用于定性，包括皮肤毒性试验 致呕吐试验种子发芽试验等。

3.2 化学分析法

最常用的为薄层层析法（TLC），适用于粮食及其制品调味品等真菌毒素的检测 。该法的优点是经济对设备和检验人员要求不高特别是随着高效薄层色谱法（high performanceTLC，HPTLC）以及薄层扫描仪的发展和应用，提高了 TLC 的分离效率和检测精确度，由此拓宽了 TLC 技术在检测真菌毒素领域中的应用，特别是可以用来检测某些本身能够发荧光的毒素如 AFs 和 OTA AOAC 官方方法中 TLC 也是分析花生及其制品中的总黄曲霉毒素，谷物中的玉米赤霉烯酮和杂色曲霉素，苹果汁中的展青霉素等的法定方法 但由于 TLC 法的精确度低操作过程复杂分析结果的可重复性和再现性差，近年来国际上用 TLC 方法检测新发现真菌毒素的研究在逐渐减少。

3.3仪器分析法

高效液相色谱法（HPLC）是定量分析真菌毒素常用的方法，其分离检测效能高，分析快速，为同时测定多种真菌毒素提供了条件应用 HPLC 法检测谷物中黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素时，检测限分别为黄曲霉毒素 0.24 g/kg，玉米赤霉烯酮 4.0mg/kg 和赭曲霉毒素 0.5mg/kg。此外，与质谱联用还可以大大提高分析的灵敏度和可靠性AOAC 官方方法中 HPLC 法被用于检测食品中的黄曲霉毒素和伏马菌素，许多国家用该法检 测谷物中的 OTAZEN DON 展青霉素等真菌毒素。

气相色谱法（GC）常用于分析分子中不含发色基团和荧光基团，或具有弱荧光或弱吸收 的真菌毒素。由于 A 类单端孢霉烯族化合物分子中游离的羟基基团较少，并且在 C-8 位置上缺少酮 基，HPLC配紫外检测器不能用于 A 类单端孢霉烯族化合物的检测，因此 GC 法是分析该类毒素的最佳选择此外，GC 也是分析展青霉素ZEN 和链格孢毒素的常用方法，其 GC 分析结果已被常用质谱法验证进行确证。

近来发展起来的一些方法如近红外光谱分析高效液相联合电喷质谱法 气相色谱联合质谱法（GC/MS）和表面等离子体共振等开始广泛应用于真菌毒素的检测。 特别是，超临界流体色谱法（su-percritical fluid chromatography） 和毛细管电动色谱(capillary electrokinetic chromatography，CEKC） 配激发光子束荧光检测（multiphoton excited fluorescence，MPE）是分离检测真菌毒素的另外两种新技术，前者主要用于 DONT-2 毒素和 ZEN 等镰刀菌毒素的检测，而后者广泛用于同时检测多种真菌毒素，其优点是样品用量少节省提取溶剂使用价格低廉的毛细管柱等.

3.4 免疫学检测方法

应用免疫学手段检测真菌毒素起于 80 年代Morris 等首次把ELISA 应用于杂色曲霉 ST 的 检测近年来，在真菌毒素的检测技术方面，免疫检测技术因其灵敏度高，特异性强，快速 经济简便等特点，格外受到研究者青睐.

3.4.1 酶联免疫吸附测 定（ELISA）

ELISA 法（Enzyme-linked immunosorbent assay）是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机结合起来的一种检测技术其中高质量免疫抗体的制备是建立 ELISA 检测方法的关键和技术难点，需要运用免疫学 酶工程化学合成生化提取等综合知识和技术。

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3.4.1.1 多克隆抗体技术

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由多种抗原决定簇刺激机体，机体内产生的抗体 就是多克隆抗体 目前多克隆抗体技术已经成功应用于玉米牛奶中 ZEN 的 ELISA 检测法，检测下限达到了0.5ng/mL；DON 直接竞争和间接 竞争 ELISA 检测法；OTA 的 ELISA 检 测 法， 检 测 下 限 为1ng/mL；FB 1 FB2 间接竞争 ELISA 检测法

3.4.1.2 单克隆抗体技术

单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）是由单个 B 淋巴细胞克隆针对单一的抗原决定簇产生的均一的免疫球蛋白以单克隆抗体建立的酶联免疫吸附测定方法（ELISA），具有感 特异稳定简便的优点，非常适合真菌毒素的检测，各国竞相开展这方面的研究 自 1977 年抗黄曲霉毒素 Bl 的单克隆抗体问世至今，单克隆抗体成功应用于：赭曲霉毒 A（ochratoxin A,OTA）的单克隆抗体间接竞争。ELISA 检测法；乳粉样品中的黄曲霉毒 M1（AFM1）单克隆抗体直接竞争 ELISA 检测法；玉米 小麦饲料中的玉米赤霉烯酮单克隆抗体间接竞争；粮食中杂色曲霉素单克隆抗体 ELISA 检测法，其最小检出量由原来的 4ng 提高到 0.01ng ；制备出稳定分泌抗黄曲霉毒素 Bl （FBl）单克隆抗体的杂交瘤细胞株，建立了 FBl 接竞争 ELISA 检测法，其最低检出浓度为 5μg/mL

3.4.1.3 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是以大量随机编码的多肽序列插入噬菌体展示载体，形成噬菌体展示 文库 每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链，不同噬菌体粒子展示不同序列的外源肽链可采用亲和选择方法，高效挑选出能与靶分子相结合的噬菌体，并利用这些噬菌体再感染大肠杆菌进行扩增。该技术避免了直接加入毒素标品,减少了实验成本 ,同时也保护了实验人员的身体健康, 从而为建立无毒检测食品谷物和粮食中的真菌毒素体系提供了一条崭新的途径目前该项技术在真菌毒素检测领域的应用有：利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单抗筛选表达在 M13 噬菌体表面的七肽库，筛选到脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的模拟表位，并以之替代 DON建立了 ELISA 分析方法，其检测下限和线性范围与常规 ELISA 分析方法相近；利用抗黄曲霉毒素 B 1的单抗亲和筛选表达在 fd 丝状噬菌体表面的Cys-4 和 Cys-6 肽库，成功筛选到黄曲霉毒素 B1 的模拟表位，建立了无毒免疫化学检测方法；在制备 OTA 人工抗原和抗 OTA 单克隆抗体的基础上，从噬菌体肽库中筛选 OTA 的模拟表位，并以之作为OTA 的替代品建立了无毒 ELISA 分析方法。

3.4.1.4 ELISA 商品化试剂盒

20 世纪 90 年代 AOAC 开始将免疫学方法用于检测 AF 的法定方法，一些商品化试剂盒随之问世，如 1990 年通过的用于检测玉 米和花生中 AFB1 的ELISA 试剂盒；1994 年通过的用于检测玉米 棉籽花生和花生酱中 AFBl AFB 2 的 ELISA 试剂盒（im-munodot screen cup）：1996 年通过的用于测定花生酱中总 AF 的 ELISA 试剂盒（Biokits）等

3.4.2 免疫层析法（ immunochromatography , IC）

免疫层析法测定真菌毒素的原理类似于 ELISA方法,只是以胶体金颗粒乳胶颗粒和磁性颗粒等示踪粒子替代标记酶该技术采用大剂量的单克隆抗体选择性吸附提取液中的抗原物质，从而大大提高了样品的净化效果和检测灵敏度，结合荧光检测即可达到既定量准确又快速简便的要求 另外，免疫还可显著减少有毒有害试剂的使用，十分有利于操作人员的健康和环境保护亲和层析法对真菌毒素的快速检测起了很大的推动作用，OTA T-2 毒素DON

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ZEN FM 等重要真菌毒素的免疫亲和层析 -荧光检测方法已见报道，在国外该技术也已被广泛引入官方分析方法之中。

3.4.3 化学发光免疫测 定 （Chemiluminesent Im-munoassay，CLIA）

化学发光免疫测定 （Chemiluminesent Im-munoassay，CLIA） 是基于化学发光剂 直接标记抗原或抗体为原理，从而对抗原或抗体进行检 测的一类免疫测定方法该技术既具有免疫学的抗原与抗体反应特异性，更兼有化学发光反应的高敏感性，它可用于细菌病毒毒素等测定，在真菌毒素检测方面已展露头脚。

检测方法

1.胡娜, 徐玲. 真菌毒素检测方法研究进展 [J]. 食品科学,2007,2 8（8）:563-565. 2.张淑珍. 植物病原菌毒素研究进展 [J]. 黑龙江农业科学,2001,（2）:42-43.

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8.王玉平. 玉米赤霉烯酮 ELISA 定量检测试剂盒研制高效液相色谱法的建立及标准比对研究[D]. 河北:河北医科大学,2005.

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蛋白质的测定方法及其研究进度

郁星 生物工程1101

摘要 蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。

本文综述了近年来蛋白质测定的方法的研究进展,包括分光光度法、双缩脲法、凯氏定氮法、电泳分析法、质谱分析法在蛋白质测定中的应用。总结各种方法的特点及适用条件。

关键词 分光光度法 凯氏定氮法 蛋白质 测定

前言 蛋白质是生命物质的基础，是生命科学研究的其中主要内容之一，不同的蛋白质种类具有不同的生物功能，它是由二十种 -氨基酸通过酰胺键 （肽键）特定联成的长链分子 （即所谓的肽链）。部分蛋白质还以上包含非肽链结构的其它组成成分，这种成分称为配基或辅基。蛋白质的元素组成除含碳、氢、氧、氮和少量硫外，还含有微量的磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素。其中氮的含量较恒定，平均为 16%。因此，一般可由测定生物样品中的氮，粗略地计算出其中蛋白质的含量 （每 1g 氮相当于6.25 克的蛋白质）。蛋白质的分离与定性、定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临床检验、疾病诊断、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。

目前测定蛋白质含量的方法有很多种,本文就常见的分光光度法、凯氏定氮法以及电泳和质谱分析法进行讨论。 1 凯氏定氮法

将蛋白质样品在硫酸铜的催化下,用氧化性试剂消化分解转化为铵离子,然后将含有铵试液置于蒸馏瓶中,加高浓度碱使铵离子转化为氨,再加热蒸馏,用过量的标准硼酸溶液吸收氨气,再用盐酸标准溶液滴定H2BO3 ,以甲基红作为指示剂。通过计算铵离子的量计算蛋白质含量。

凯氏定氮法测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大。 2 分光光度法

分光光度法以分子吸收光谱为基础,设备简单,结果准确直观，双缩脲法是传统的分光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外- 可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。

此方法对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便,但灵敏度不高,约为1mg ,故现在已很少使用。

1976 年,Bradford 提出了一个灵敏、快速定量测定微克量蛋白质的方法,即现在广泛使用的考马斯亮蓝法(CBB G - 250) 。当染料考马斯亮蓝与蛋白质结合后,其最大吸收波长从

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465nm 变为595nm ,且在595nm处吸光度的增加与蛋白质的量呈线性关系,可用于蛋

白质的测定。此方法重现性好,染料与蛋白质的结合反应在两分钟左右即可完成且一个小时内基本稳定。

钠离子、钾离子、镁离子、铵离子、乙醇和碳水化合物如蔗糖对体系无干扰或有微弱干扰。在强碱性缓冲溶液颜色较弱,但是通过选择合适缓冲溶液可得到满意结果。

我国分析工作者在蛋白质得分光光度法的研究中取得了显著的成就。北京大学的童沈阳研究组对一些染料与蛋白质的作用机理进行了探讨,并提出了测定蛋白质的新方法。他们用分光光度法研究了溴甲酚绿(BCG) 与牛血清白蛋白(BSA) 在酸性溶液中的结合反应,认为BCG与BSA 主要由于静电引力而结合,疏水作用力对结合反应也有影响。发现溶液酸度,离子强度对颜色反应有显著影响。 3 电泳法

蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳，淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

近年来蛋白质凝胶电泳技术在国际上迅猛发展,已成为高分辨(等电聚焦,0. 001pH) ,高灵敏度(银染色,荧光染色,ng 级) 和获得大量信息(双向电泳,近万个点) 的现代技术。如以固相pH 梯度等电聚焦( IPGIEF) 为第一向的双向电泳是当前研究重要生命现象和主要疾病病因的蛋白质组分析所必须的开门技术。该电泳已经不仅局限于作为基础理论研究的工具,而且与国民经济的发展越来越密切。如农、林、牧、渔优良品种的定向培育,食品的鉴定、保鲜和加工;医学中的临床诊断;基因工程药物的开发和质量控制等。

蛋白质的样品制备是Western Blotting 的第一步,样品制备是关键步骤,要求尽可能的获得所有蛋白质,应注意以下问题:在合适的盐浓度下,应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性;选择合适的表面活性剂和还原剂,破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键,使其形成一个各自多肽的溶液;尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子。 4 质谱法

蛋白质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子,复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构] 及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级,三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋白质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。以往质谱(MS) 仅用于小分子挥发物质的分析,由于新的离子化技术的出现,如介质辅助的激光解析/ 离子化、电喷雾离子化,各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。 其原理是:通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将 具有特定质量与电荷比值(M/ Z 值) 的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/ Z值,分析鉴定未知蛋白质。近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种:电喷雾电离质谱;基质辅助激光解吸电离质谱;快原子轰击质谱;离子喷雾电离质谱;大气压电离质谱。在这些软电离技术中,以前面三种近年来研究得最多,应用得也最广泛。

质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点:很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息,能最有效地与色谱联用,适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定,同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。在蛋白质的质谱分析中,质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响,因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点,这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信,随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进,蛋白双向电泳的应用[16 ]以及质谱技术的不断完善,质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。

1981 年首先采用FAB 双聚焦质谱测定肽分子量,分析十一肽(Mr = 1318) ,质谱中出现准

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分子离子[M +1 ] + = 1319 强峰。分子量小于6kDa 肽或小蛋白质合适用FAB 质谱分析,更大分子量的多肽和蛋白质可用MALDI 质谱或ESI 质谱分析。用MALDI - TOF 质谱分析 蛋白质最早一例是Hillen Kramp 等于1988 年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF 谱仪上测出质量数高达60kDa 蛋白质,精确度开始只有0. 5 % ,后改进到0. 1- 0. 2 %。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量,也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[1,2] ,三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来,串联质谱分析仪发展迅猛,其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高,大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST) 的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前,利用2D 电泳及MS 技术对整个酵母细胞裂 解产物进行分析,已经鉴定出1484 种蛋白质,包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[3 ] ;分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[4] ,并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[5]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP) 的分子结构[6]等。 荧光光谱法灵敏度高，复杂组分辨识度好，作为一种常规的检测手段在生物传感方面发挥着其优势，是定量测定蛋白质的常用方法。常用的几种方法是内源荧光法、荧光探针法、荧光偏振、时间分辨荧光法及激光诱导时间分辨免疫分析法。

目前，蛋白质的分析研究非常活跃。各种方法测定蛋白质，都有其各自特色与不足。随着研究的深入，蛋白质测定将会向灵敏度高、选择性好及自动化方向发展，未来研究的前景，广阔而光明。

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钙的测定方法及其研究进展

班级：生物工程1101班；姓名：李晓慧；学号4104110107；

中文摘要：钙是一种金属元素，符号Ca，银白色晶体。在自然界分布广，也存在于血浆和骨骼中，并参与凝血和肌肉的收缩过程。金属钙可由电解熔融的氯化钙而制得；也可用金属在真空中还原石灰，再经蒸馏而获得。 关键词：钙，性质，研究进展，测定方法，生理功能。

性质 ：钙是银白色的轻金属，质软，密度1.54克/厘米3。熔点839±2℃，沸点1484℃，化合价+2，电离能6.113电子伏特。化学性质活泼，能与水、酸反应，有氢气产生。空气在其表面会形成一层氧化物和氮化物薄膜，以防止继续受到腐蚀。加热时，几乎能还原所有的金属氧化物。钙平常以二价金属化合物存在，焰色反应呈橙色。

研究进展 ：经过研究发现，含钙的化合物有大理石方解石或以石灰石为主要成分的碳酸钙，从古罗马时代就广为人知。燃烧碳酸钙生成石灰，所以直到近代一直被认为是单质。1808年5月，英国化学家戴维电解石灰与氧化汞的混合物，得到钙汞合金，将合金中的汞蒸馏后，就获得了银白色的金属钙。瑞典的贝采利乌斯、法国的蓬丁，使用汞阴极电解石灰，在阴极的汞齐中提出金属钙。钙是由戴维命名的，由拉丁语中表示沙石的Calx转化为泛指石灰石石灰的Calcis,以及结合金属元素共通的ium,最后被定为Calcium。在日本江户时代末期，从荷兰引入了石灰，最初叫做漂白粉，后来不知什么时候用作漂白清洗游泳池用的石灰也叫做漂白粉了。天然钙主要存在于大理石石灰石等碳酸盐中，还有硫酸盐、氟化物、磷酸盐，地壳表层的浓度是3.39%，居第五位。海水中的贝壳、珊瑚虫含有碳酸氢钙，分解后的主要成分之一是碳酸钙，它们的尸骸堆积于海底成为白土。钙的氧化物石灰和苦土分别是从含碳酸钙的石灰石焙烧获得的，长期时期里化学家认为它们是不能再分割的物质，在1789年拉瓦锡发表的元素表中就有它们。戴尔不顾这些，还是对它们进行了电解。他最初是将它湿润后又用从石油分镏出的最初馏分石脑油盖住潮湿的氧化钙，但是却没有金属出现。后来他又用石灰与氧化汞混合进行电解，获得小量钙汞齐，但是仍不足以把金属分离出来。到1808年5月，戴尔接到贝齐里乌斯的信，叙述他和瑞典皇家医生彭丁共同电解生石灰取得钙的经过，是将生石灰和水银混合后电解的。得到启示后，戴维很容易的获得了金属钙。

测定方法： 钙的测定方法有两种：第一种是原子吸收光谱分光光度法。 它的原理是每种元素的原子能够吸收特定波长的光能，而吸收的能量值与该光路中该元素的原子数目成正比。用特定波长的光照射这些原子，测量该波长的光被吸收的量，与标准溶液制成的校正曲线对比，求出被测元素的含量。步骤包括样品消化：实验操作需在无元素污染的环境中进行。准确称取样品干样0.3～0.7g，湿样1.0g左右，饮料等其他液体样品1.0～2.0g，然后将其放入50mL消化管中，加混酸15Ml[注意：油样或含糖量高的食品可多加些酸]，过夜。次日，将消化管放入消化炉中，消化开始时可将温度调低（约130℃左右），然后逐步将温度调高（最终调至240℃左右）进行消化，一直消化到样品冒白烟，液体变成无色或黄绿色为止。若样品未消化完全可再加几毫升混酸，直到消化完全。消化完后，待凉，再加5mL去离子水，继续加热，直到消化管中的液体约剩2mL左右，取下，

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放凉，然后转移到10mL试管中，再用去离子水冲洗消化管2～3次，并最终定容至10mL。

样品进行消化时，应同时做样品空白消化。

（2）测定：将标准中间液配置成不同浓度系列的标准工作液，以备上机使用。 实验条件及方法：测定钙的波长为422.7nm，仪器狭缝为0.5nm，灯位置及灯电流等均按仪器使用说明调至最佳状态，然后点火准备测定，首选，以各标准系列溶液绘制标准曲线，然后逐一测定空白及样品，样品及空白均应选用8－羟基喹啉或1％镧溶液稀释定容后上机测定。 6. 公式

根据仪器测定出的数据，代入公式进行计算。 适用范围

根据中华人民共和国国家标准：GB12398－90，此方法适用于所有食品及保健品中元素含量的测定，其元素含量在1mg/kg浓度以上。 第二种是滴定法（EDTA法）

应用范围：该方法采用络合滴定法测定碳酸钙颗粒中钙的含量。 该方法适用于碳酸钙颗粒中钙的含量测定。 1. 原理

钙与氨羧络合剂能定量地形成金属络合物，其稳定性较钙与指示剂所形成的络合物为强。在适当的pH范围内，以氨羧络合剂EDTA（乙二胺四乙酸）滴定，在达到定量点时，EDTA就自指示剂络合物中夺取钙离子，使溶液呈现游离指示剂的颜色（终点）。根据EDTA络合剂用量，可计算钙的含量操作步骤

（1）标定EDTA浓度：取0.5mL钙标准贮备液，用EDTA溶液滴定，标定其EDTA的浓度，根据滴定结果计算出每毫升EDTA相当于钙的毫克数，即滴定度T。（2）样品及空白滴定：吸取0.1mL样品消化液及空白液于试管中，加1滴氰化钠溶液和0.1mL柠檬酸钠溶液，用滴定管1.5mL氢氧化钾溶液，再加3滴钙红指示剂，立即以稀释10倍的EDTA溶液滴定，直到指示剂由紫变蓝为止。5. 计算。

至于采用哪种方法要根据具体情况而定。

生理功能 ： 钙最重要的一方面就是与人体的关系。 钙是人体内含量最多的一种无机盐。正常人体内钙的含量为1200～1400克，约占人体重量的1.5%～2.0%，其中99%存在于骨骼和牙齿之中。另外，1%的钙大多数呈离子状态存在于软组织、细胞外液和血液中，与骨钙保持着动态平衡。机体内的钙，一方面构成骨骼和牙齿，另一方面则可参与各种生理功能和代谢过程，影响各个器官组织的活动。

骨骼和牙齿中大量的钙，是构成机体组织的主要成分，并使骨骼有一定的硬度，起着支撑身体的作用。血液中的钙，具有维持脑及心脏功能正常，负担所有正常细胞生理状况的调节及分泌激素、凝固血液等作用，细胞没有钙便不能生存。钙在人体中的作用如下： （1）维持细胞的生存和功能。

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（细胞分裂繁殖，数目渐增，与单细胞渐渐改变功能，都需要钙的参加。钙自细胞外进入，唤醒细胞开始工作，否则细胞一直保持睡眠状态。钙进入细胞，发出电波，和布满全身的神经纤维，形成人体情报网络，信息的输入经过钙的活动才传到身体各部位。内分泌腺细胞分泌激素时也必需由钙经过血液，到器官中传递信息。细胞的单个功能和互相联络的网络都不能缺少钙，甚至老化、疾病、死亡都可以用钙的平衡说明。充分摄入钙质，细胞才能保持健康活跃，人也才能蓬勃和有朝气。

（2）参与神经肌肉的应激过程。

（在细胞水平上，作为神经和肌肉兴奋-收缩之间的藕联因子，促进神经介质释放和内外分泌腺分泌激素的调节剂，传导神经冲动，维持心跳节律。钙有镇静作用，当体液中钙浓度降低时，神经和肌肉的兴奋性增高，肌肉出现自发性收缩，严重时出现抽搐，当体液中钙浓度增加时，则抑制神经和肌肉的兴奋性。） （3）钙对维持体内酸碱平衡，维持和调节体内许多生化过程是必需的，它能促进体内多种酶的活动，是多种酶激活剂,如脂肪酶、淀粉酶等等均受钙离子调节。 （当体内钙缺乏时蛋白质、脂肪、碳水化合物不能充分利用，导致营养不良、厌食、便秘、发育迟缓、免疫功能下降。）

（4）钙为一种凝血因子，在凝血酶原转变为凝血酶时起到催化作用，然后凝血酶使纤维蛋白原聚合为纤维蛋白使血液凝固。

（钙与磷脂结合，维持细胞膜的完整性和通透性。钙离子能使体液正常通过细胞膜，通常用来缓解由于过敏等症所引起的细胞膜渗透压的改变。） 参考文献：1、（化学元素的发现 ）第二版 凌永乐 编著 2、(无机化学丛书) 第二卷 顾学民 编著 3、（元素新发现） 修文复 译 4、（钙的生理功能) 程志安 著

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食品真菌毒素的分析测定研究进展

刘彦缨 食工院生物工程4104110110

摘要 主要介绍了真菌毒素，简述了真菌及其毒素对食品安全的影响综述了真菌毒素常用的监测分析方法及最新监测技术研究进展

关键词 食品；真菌毒素；检测技术；研究进展

真菌（fungi）是微生物中的高等生物，真菌毒素（Mycotoxins）是真菌产生的次级代谢产物，有些真菌被广泛应用于食品工业、医药及化工工业，造福于人类。真菌除个别种类如念珠菌属、组织胞浆菌属、给人直接造成感染性疾病外，其他许多真菌则是由于其所产生的外源性毒素如黄曲霉毒素或本身含有的内源性毒素如毒蘑菇含有的毒伞肽、毒绳碱等并通过食品给人体带来危害，成为食品安全的严重隐患。目前比较常用的真菌毒素检测技术主要是薄层色谱法（TLC）、酶联免疫法（ELISA）、液相色谱法（LC）、气相色谱法（GC）及色谱—质谱联用法、亲和色谱法等。 1.薄层色谱法

薄层色谱法是较早用于真菌毒素检测技术的一种方法，有操作简单，成本较低，应用广泛的特点。因此，在黄曲霉素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的国家检验标准中，薄层色谱法是标准的检测方法， 在这几种粮食真菌毒素的定性鉴定，半定

量以及定量分析中发挥着重要作用，但是常规的TLC 法存在检出限高，随机误差大，展开时间长等缺点，近年来，随着薄层色谱技术的研究发展，高效薄层色谱法成为迅速发展的一种新技术，具有高效 快速 准确 灵敏度高和重现性好的特点，目前已广泛应用于多个领域。

在常规薄层色谱分析中， 固定相平均颗粒度大，点样量大，展开时间长，检测限低，以正相色谱占主导地位 而高效薄层色谱( HPTLC) 采用更细更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性，在展开技术上，采用程序多级展开或园形展开技术，从而提高薄层色谱的分辨效率，缩短分析时间，增加检出灵敏度。

目前， 高效薄层色谱的新技术主要是: 棒状薄层色谱( TLC－FID)、加压薄层色谱(OPLC)、离心薄层色谱( CTLC)、胶束薄层色谱( Miceller thin layer chromatography， M－TLC)、包合薄层色谱( ICC)、二维薄层( 2D TLC) 等，这些高效薄层色谱新技术较常规 TLC，可明显改善分离度，提高灵敏度和重现性，适用于定量测定。

除此之外， 薄层色谱还可与其他分离检测分析技术联用， 更有利于化合物的定性鉴别和定量检测。 2.酶联免疫法

酶联免疫吸附技术(ELISA)是建立在免疫酶基础上的一种新型免疫测定技术有快速，敏感，简便和易标准化等优点，但是重复性差、试剂寿命短且需要低温保存。

测定的基本原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面; 测定时，将受检样品( 含待测抗体或抗原) 和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物; 反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物) 即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例; 经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物，颜色反应的深浅与样品中相应抗体或抗原的量呈一定的比例关系，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。

酶联免疫吸附技术有广阔的发展前景 国内外有多家公司制作了大量的 ELISA 商业试

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剂盒， 可供作相应项目的检测 据了解， ELISA 方法在真菌毒素国家标准中已多次出现，但ELISA法还存在一定的缺点，主要是由于该法需要的抗体抗原制备过程复杂，技术难度高，此外，方法的特异性强，只能针对单一毒素的检测，因此在改进样品的纯化步骤，提高回收率和灵敏度，减少基底干扰，提高重现性和稳定性，简化分析程序降低分析成本等方面都有待于进一步发展。 3. 液相色谱法

高效液相色谱法( HPLC) 是定量分析真菌毒素最常用的方法，可实现对毒素定性，定量同时进行，某些自身产生荧光的真菌毒素如OTA直接用配有荧光检测器的HPLC分析，而其他一些分子中不含发色基团或本身可产生荧光但强度较弱（如AFB1)的毒素进行HPLC分析时需经柱前或柱后衍生，改变流动相条件(如使用离子对试剂，改变流动相pH等) 以增强荧光信号方能定量检测，通常用溴碘或环糊精等衍生剂将其衍生化。常用的提取试剂一般为氯仿－水，甲醇－水或乙腈－水，而可供选择的净化柱有填充硅镁吸附剂或硅胶的固相萃取柱免疫亲和柱、多功能净化柱。 4.气相色谱法

气相色谱法(GC) 常用于分析分子中不含发色基团和荧光基团，或具有弱荧光或弱吸收的真菌毒素，由于A类单端孢霉烯族化合物分子中游离的羟基基团较少，并且在C－8位置上缺少酮基，HPLC配紫外检测器不能用于A类单端孢霉烯族化合物的检测，因此GC法是分析该类毒素的最佳选择一般采用有机溶剂和水溶液的混合物提取，根据不同样品基质和检测要求，选用不同的净化柱，通过电子捕获检测器检测，鉴于此类毒素的结构特点，在气相色谱分析前都要进行衍生化，以提高挥发性和灵敏度，衍生试剂多用硅烷化试剂或氟化试剂。 5. 色谱—质谱联用法

质谱作为检测器，其灵敏度高，定性的专一性强，定量再现性好 能够给出被测物质的质量数和许多结构信息，因而与其他色谱技术相结合，已广泛的应用于各个研究领域，色谱 质谱联用技术结合了色谱，质谱两者的优点，利用色谱优良的分离手段，加上质谱卓越的检测能力，因此成为食品安全检测分析技术的热点，近年来，随着色谱、质谱联用技术的进一步成熟，越来越多的研究者采用这种方法作为真菌毒素的检测方法。

冼燕萍等建立了同时检测确证玉米粉中6种真菌毒素(黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，伏马菌素1和B2)含量的液相色谱—串联质谱法，样品经乙腈－0.3%乙酸水溶液超声提取样品中的待测物，提取液经HLB固相萃取小柱净化，浓缩吹干后用流动相溶解残渣定容，LC－MS /Ms检测,结果表明该方法检出限低，平均回收率在66.7% ~ 90.2% 之间，相对标准偏差在7.1% ~ 11.7%之间， 符合痕量分析的要求。 6.亲和色谱法

亲和色谱法是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的色谱技术。首先将载体在碱性条件下用溴化氰活化，再用化学方法将能与生物分子进行可逆性结合的物质（称为配基）接和到某种活化固相载体上，此过程称为偶联反应。将偶联反应得到亲和吸附剂装入色谱柱形成亲和柱，溶液样品通过亲和柱时，生物大分子和亲和柱中的配基结合而被吸附在亲和吸附剂表面，而其它没有特异结合的杂蛋白则可通过清洗而流出。再用适当方法使这些生物大分子与配基分离而被洗脱下来，从而达到分离、纯化的目的。

用于亲和色谱法的理想载体应非特异性吸附要尽可能小，对其他大分子物质的作用很微落；必须具有多孔的网状结构，能使大分子自由通过而增加配基的有效浓度；必须具有相当量的化学集团可供活化，并在温和条件下能与大量的配基连接；具有良好的机械性能；在较宽的PH值、离子强度和变形剂浓度范围内具有化学和机械稳定性等。 小结

由于真菌毒素对人、家畜健康的影响，提高真菌毒素的检测水平是保障粮食质量和卫生

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安全的迫切要求，以上各种真菌毒素的检测分析方法各有优点和不足，但是随着社会发展和技术进步，一些新的真菌毒素检测方法和手段将不断涌现，以适应当今社会。

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菌毒素[J].色谱,

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纤维素的测定方法及其研究进展

欧家欣 生物工程1101 31号

摘要 本文叙述可溶性食用纤维素有增加产 品纤维质含量的作用,并在食品工 业中,有做 为强化剂和增稠剂的功能。 关键词 生物制粉末 纤维素 前言

纤维素的分子式(C6H10O5)n，由D-葡萄糖以β-1，4糖苷键组成的大分子多糖，分子量50000～2500000，相当于300～15000个葡萄糖基。不溶于水及一般有机溶剂。是植物细胞壁的主要成分。纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是取之不尽用之不竭的，人类最宝贵的天然可再生资源。 原理

生物制粉末在加热的情况下用醋酸和硝酸的混合液处理，在这种情况下，细胞间的物质被溶解，纤维素也分解成单个的纤维，木质素、半纤维素和其它的物质也被除 去。淀粉、多缩戊糖和其它物质受到了水解。用水洗涤除去杂质以后，纤维素在硫酸存在下被重铬酸钾氧化成二氧化碳和水。

C6H10O5 + 4K2Cr2O7 + 16H2SO4 = 6CO2 + 4Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 21H2O

过剩的重铬酸钾用硫酸亚铁铵溶液滴定，再用硫酸亚铁铵滴定同量的但是未与纤维素 反应的重铬酸钾，根据差值可以求得纤维素的含量。 实验所需试剂和仪器 1. 实验试剂

硫酸亚铁铵 分析纯， 重铬酸钾 分析纯， 硫代硫酸钠 分析纯， 硝酸钙 分析纯， 硫酸铜 分析纯， 可溶性淀粉 分析纯， 碘酸钾 分析纯， 草酸 分析纯， 酒石酸 分析纯， 氯化钡 分析纯， 邻菲啰啉 分析纯， 浓硫酸 分析纯， 盐酸 分析纯， 冰醋酸 分析纯， 硝酸 分析纯。 2. 实验仪器

50mL酸式滴定管，50mL碱式滴定管，10mL离心试管若干，不同型号烧杯若干， 真空塞，250mL锥形瓶若干，电炉，离心沉淀器。

五 实验步骤

（一） 纤维素含量的测定 1. 所需溶液

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硝酸和醋酸的混合液，0.5N重铬酸钾溶液，试亚铁灵指示剂 0.1N硫酸亚铁铵溶液，浓硫酸，0.1N重铬酸钾溶液。 2. 实验步骤

（1） 配制所需的各种溶液，硫酸亚铁铵溶液在使用的一周内准备，并在使用当天测定其滴定度K。用该硫酸亚铁铵溶液滴定25mL 0.1N的重铬酸钾溶液，用去m mL。 K= 25×0.1/m

（2） 称取自然风干的生物质粉末0.05-0.06g，数值为n （3） 装入离心管内，加入硝酸和醋酸的混合液5mL （4） 塞住离心管，在沸水中煮沸25min，并定期搅拌 （5） 离心，倒去清液，加入蒸馏水离心洗涤沉淀，共洗三次

（6） 加入10mL 0.5N的重铬酸钾溶液和8mL浓硫酸，搅匀，放入开水中10min，并定期搅拌

（7） 冷却，倒入锥形瓶中，用少许蒸馏水冲洗沉淀，滴入3滴试亚铁灵试剂，用0.1N的硫酸亚铁铵溶液滴定，用去b mL，由黄色经黄绿色至红褐色为终点

（8） 用0.1N的硫酸亚铁铵溶液单独滴定加入8mL浓硫酸和10mL 0.5N重铬酸钾溶液，用去a mL

（9） 生物质中纤维素的含量计算公式 x% = 0.675×K（a－b）/n 0.05mol/L硫代硫酸钠溶液

配制：用台秤称取Na2S2O3?5H2O 12.5g和Na2CO3 0.5g，溶于1000mL经煮沸后冷却了的蒸馏水中，转移到试剂瓶中，摇匀，静置一周后，过滤备用。 标定：利用上述（2）中配制的K2Cr2O7标准溶液来进行标定，用移液管移取25.00mL该K2Cr2O7标液三份，分别置于250mL锥形瓶中，加入5mL 3mol/L HCl，1g KI，摇匀，置于暗处5分钟。待反应完全后，用蒸馏水稀释至50mL。用Na2S2O3溶液滴定至黄绿色，加入2mL淀粉溶液，继续滴定至溶液蓝色消失呈现浅绿色即为终点，记下所消耗的Na2S2O3溶液体积，计算Na2S2O3溶液的浓度。 (mol/L)

0.2942为K2Cr2O7的毫摩尔质量(g /mmol) m为准确称取K2Cr2O7的质量(g) 可溶性食用纤维素的应用

强化剂的作用作为一种直接强 化剂,它必 需与非可 溶性纤维进行竞争。可 溶性纤维不 仅可在固体食品、焙烤食 品和糖果等方面竞争,它 们的优势在对溶解度有一定要求的食品如饮料和汤 类及低粘度液体食品中尤为明显。它们在液体食品中应用时,可 与食品本身很好的溶合。在对比实验中,比如某 种饮料,非可溶

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性食用纤维将沉降在容器底部或悬浮其中,使饮料具有一种不稳定的颗粒状物质。实际上使用非可溶性纤维的高纤维质饮料不可 能表现 出好的口感。而可溶性食用纤维可完全与饮料同化,如果使粘度显著增加也仅是改变饮料的流变学性质 和 口 感 而已。用 于液体食 品的理想可溶性纤维必须是低粘度无臭无异味,并且可形成透明溶液。能够最佳体现这些特点的两种可溶性纤维是阿拉伯胶和一种特别低粘度的纤维素胶一一狡甲基纤维素。对于 液体食品一来说,阿拉伯胶是所有可溶性纤维中最佳的一种直 接添加剂。它具有很高的纤维含量,粘度低无异味,天然形成并且符合安全要求一,在 的添加量上用超过 个 写的光检查也未发现 浑浊现象。对于汤 类食 品或高营养的奶来说如果能够允许粘度稍有增加的话,那么每 盎司中 可 加入姆克。我们把阿 拉伯胶 按不同的添加量添加到食品中,随后进行感官评定,以测定达到改变原始食品 口感及流变学性质的最 低必需添加量。如表 所示,在口感发生变化前我们加 克左右纤维质到饮料中,这并不意 味 着我们的评味者们反对使用高纤维添加量改变食品 的口感,事实上,评 味者们在使用具有高与低阿拉伯胶 添加量的食 品时比较喜欢前者。

低枯 度狡甲基纤维素也是一种主要的可溶性纤维,其粘度与阿拉伯胶 的 低 粘 度 接近。图 对这种较甲基纤维素与阿 拉伯胶进行比较表明,在很低浓度下 直到 淡甲基纤维素在粘度上与阿拉伯胶是颇为接近的。唯其不利条件是食品药品管 理 局 认 为梭 甲基纤维素不是一种天然配 料 成 份。另外,它可 以单独使用或与阿 拉 伯 胶 联合 使‘用。由于具 有很好的可 溶解性,这两种物质在具有良好 口感、无不 溶颗粒及纤维含量丰富的食品中打开了广泛 应用的大门。作为一种直接强化 剂,可溶性纤维不仅限于在液体食 品中应 用,但在液体食品中其单值性是一最 大的利用优势。增稠剂的替代品可溶性纤维的第二个利用领域是作为一种增稠剂以替代那些不能提供纤维质的增稠剂。例如 淀粉、面粉、糖、脂肪和 油类,其中最常用的是淀粉。利用可溶性纤维取代奋维质。采用同样的方法,减少焙烤食品中面粉用量而对产品全面特性没有影响 是 有 可 能的。如表 所示,象蛋糕 粉、面包和饼干都可 以通过面 粉与古 柯豆胶按 的 比例取代部分面 粉而显 著增加纤维含量。表 古柯豆胶富纤维食品纤 维含量食 品古柯豆胶使用浓 度 乡‘纤维增加量克 百克苹果酱面 包蛋糕粉饼 千巧克力布丁。。 。。,。。。淀粉下仅可以增加成品中的纤维含量,而且也可以‘降低食品的热含。取代淀粉时,用 份树胶和 份淀 粉 配合起来以取代 的淀粉用量。在 一种配方中,取代 淀粉即把淀粉含量降低至或,使树胶 一般是古柯豆胶或槐豆胶 的含量增加。 ‘,这种低水平的增加不可能 显 著改善食品中纤维质的全面水平。但如果使用低枯度的古柯豆胶,可 以使其含 量 增 加 到则可以增加产品中纤维质 的含量。此外,仅改变稠度的话,混合使用低粘度古柯豆胶和低粘度淡 甲基纤维 素 取 代 淀粉,进一步减少 淀粉用量 可能达到是可能的。例如,某种物含 淀粉而 无 纤维质,把淀粉含量减少到 并各加入 的低枯度古柯豆胶和低粘度叛甲

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基纤维素,纤素质含量增加到 盎司,而其流变学特性仍与原来柑向户知么若对整体配方做较小的修改,我们就能够在食品中提供较多的纤维质。采用同样的方法,减少焙烤食品中面粉用量而对产品全面特性没有影响 是 有 可 能的。如表 所示,象蛋糕 粉、面包和饼干都可 以通过面 粉与古 柯豆胶按 的 比例取代部分面 粉而显 著增加纤维含量。现今所有的糖汁类食品也完全可 以使用可溶性纤维,以解决配方中糖份减少而引起稠度降低的问题。取代糖份的可溶性纤维的量,要考虑所需的粘度及成本与利润 的比例关系。脂肪和油类可以为沙司、色拉调味汁和冰淇淋等食品增加稠 度。尽管完全 去除脂肪和油类而不大幅度地改变食品原始特性是不可 能的。但用可溶性纤维来部分替代它们从而 降低它 们的用量是可 能的。食品中所加纤维质的增多可 以减少食品的热含。至于 食品中所加纤维的量则要考虑粘度及依据成本比例关系来决定。可 溶性纤维对增稠剂的替代使用,大大增加了食品工 艺学家们在富含纤维食品中对它们的利用。成本问肠在 年 月,每克可 溶性纤维 为 古柯豆胶 美元,狡 甲基纤 维 素 。 美元,阿拉伯胶。 美元,槐 豆 胶。美元。只 有古柯豆胶和竣甲基纤维素能够在直接添加剂方面与非可 溶性纤维进行竞争。从经济角度出发,用增加这二者来替代淀粉、等是合适的。阿拉伯胶在低粘度饮料方面的利用优势是其它来源的纤维素所不能比的。可溶性纤维在合理适度的成本下,可以在广阔的食品领域中,以各种粘度和稠度,按产品所允许的较高使用量加入。在具体的应用领域,根据产品的特性及成本,来侧定纤维素的用量。[1]

参考文献

[1]《Food Technology》

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木糖醇的制备、测定方法与技术

潘莹 生物工程1101 4104110111

摘要：木糖醇是自然界中广泛存在的天然物质，不仅存在于植物界，而且存在于人体的血液

中，木糖醇是人体糖类代谢的正常中间体。木糖醇是五个碳的糖和醇，相比六碳糖和醇而言有独特的生理活性，作为一种营养性的甜味剂，能代替食糖，广泛应用于食品加工。本文木糖醇的制取、测定两方面具体介绍木糖醇。 关键字：木糖醇、制备、测定 前言：

木糖醇是经过加工的天然甜味剂，是21世纪流行的新糖源。木糖醇有五个碳原子，

为五元醇。由于自然界存在的木糖含量低，因此国外商品木糖醇的生产方法，均是采用含木聚糖的植物原料，如玉米芯、甘蔗渣等，经水解氢化获得的结晶木糖醇，其化学结构和自然界完全相同。

在工业上，木糖醇由玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳、桦树皮等富含缩戊糖的原料，经

水解、净化、加氢、浓缩、结晶、分离、烘干、包装等一系列加工工序得到木糖醇。 木糖醇是人体糖类代谢的正常中间体，每个人的肝脏，每天能合成木糖醇5——15

克。由于木糖醇代谢不同于一般糖类，不需要胰岛素促进，所以木糖醇成为糖尿病人理想的食糖代替品。 1、 木糖醇的制备

木糖醇是用农业植物纤维废料中含有的多缩戊糖经水解氢化而得。要选择较理想的

制取木糖醇的原料要考虑一下几点：

（1） 多缩戊糖的含量高，其他非糖有机杂质少。如油茶壳，虽然含有一定量的多缩

戊糖，但同时含有不少单宁、色素、植物碱、胶体等有机杂质，将给净化带来较大困难，增加成本，故不宜作为木糖醇的原料。

（2） 产量大，和其他工业原料矛盾小。农产废料一般产量较大，但有些不易集中，

有些和造纸工业原料有矛盾，如麦草和稻草。跟造纸工业有矛盾，产量较大的有玉米芯、棉籽壳、稻壳等。此外，甘蔗渣虽然是造纸工业的好原料，但蔗渣造纸要脱除30%左右的蔗糖，这些蔗糖仍含多戊糖，所以可以考虑作为木糖醇的原料。［1］

木糖醇的制取原料主要为玉米芯、甘蔗渣。在各种原料中，玉米芯的多缩戊糖含量最高，蔗渣和蔗髓的多缩戊糖含量虽比玉米芯低，但由于较集中，价格低廉，所以是比较理想的木糖醇原料之一。

木糖醇的生产基本分为两步，一是木糖的生产，二是木糖醇的生产。

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1、木糖的生产

将玉米芯，甘蔗渣或其他适当的原料，加水浸泡后，加入1%左右的硫酸，

在110℃蒸煮30分钟，主要讲原料中的淀粉、蜡质或其他易水解杂质水解掉，然后将水解液放掉。加入浓度为1.5%的硫酸，在125——135℃下，蒸煮2-3小时，促使玉米芯中的多缩戊糖水解，生产木糖溶解到水解液中。 2、化学加氢生产木糖醇

加氢工艺可以采用高压加氢釜间歇式加氢，也可以采用管道式加氢装置连续

加氢。

采用间歇式加氢时，可以使用粉末状催化剂，在相同活力下，粉末状催化剂

的催化能力要比颗粒状催化剂或固定式催化剂高得多。

加氢也可以采用连续加氢工艺，连续加氢生产线采用的是管道加氢，用3-5m

的高压管加氢。物料和催化剂混合后，用高压泵打入加氢管，氢气也同时进入。加氢压力保持在15.0MPa，温度保持在150℃.在管式加氢反应器中，糖液、催化剂于氢气呈剧烈湍动状态流动，三相混合，完成加氢过程。［2］ 3、微生物还原法生产木糖醇

木糖醇出来用木糖加氢生产外，近年来还开发了发酵法生产。利用微生物来

发酵戊聚糖水解液，生产木糖醇。 4、淀粉原料发酵法生产木糖醇

第一步将己糖通过一种高渗酵母，将葡萄糖发酵生产一种阿拉伯糖醇。第二

步是将阿拉伯糖醇在氢化/脱氢化剂及催化剂促进剂磷酸存在的情况下，生成相应的含有木糖醇的糖醇混合物，并进一步将木糖醇从其他糖醇中分离出来，分离后 得到的残留阿拉伯糖醇混合物，可以重新循环。［3］

2、木糖醇的测定

1、木糖醇的物理性质

木糖醇英文名称XYLITOL,化学名称1，2,3,4,5-戊五醇。 分子式：C2H12O5

性状：白色晶体或结晶性粉末，甜味，甜度相当于蔗糖，极易溶于水，微溶于乙

醇和甲醇，熔点92-96℃，沸点216℃，热值约为16.72kj/g（与蔗糖相同）

2、木糖醇的化学性质

(1)木糖醇由木糖氢化获得，不再含有羰基，常温下在食品中不会和其他成分反

应，即使在加热过程中，木糖醇作为食糖代替品，不会和甜食品中的蛋白质氨基酸产生美拉德反应。

（2）木糖醇和单糖能反应生成糖苷

（3）木糖醇和脂肪酸反应能生成类似司潘，吐温的糖醇酯乳化剂。 （4）木糖醇能和硝酸反应生成爆炸性硝基木糖醇

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（5）木糖醇和硼砂反应能生成络合物，具有螯合结构，影响溶液的旋光度和电导

率。［4］

参考文献

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蛋白质的测定方法及其研究进展

伏莉 生工1101班 4104110104

摘要 蛋白质的常规测定方法和原理以及优缺点比较，鉴别蛋白质。蛋白质检测的前景 序言 近年来食品安全出现严重危机，例如三聚氰胺等在根本上归咎于蛋白质问题，民

以食为天，在食品安全上绝对不能懈怠，这对于蛋白质的检测有了一定的要求。

关键词 蛋白质检测 含量 方法 发展前景 蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常

用的方法有四种，即定氮法，双缩尿法、酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 但是四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 蛋白质的免疫印记法

免疫印迹法亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked blot，EITB），因与早先建立的检测核酸的印迹方法t相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

新的蛋白质的测定方法为：DNA重组技术和Mass质谱法

对于Mass质谱法原理:待测化合物分子吸收能量（在离子源的电离室中）后产生电离，生成分子离子，分子离子由于具有较高的能量，会进一步按化合物自身特有的碎裂规律分裂，生成一系列确定组成的碎片离子，将所有不同质量的离子和各离子的多少按质荷比记录下来，就得到一张质谱图。由于在相同实验条件下每种化合物都有其确定的质谱图，因此将所得谱图与已知谱图对照，就可确定待测化合物。

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简要方法：用单聚焦质谱计、双聚焦质谱计或四极矩质谱计。目前后两种用得较多，而且多与气相色谱仪和电子计算机联用

另外一种快速灵敏的蛋白质的检测方法：以凝血酶适体为例,利用适体和核酸外切酶特性,通过定量PCR扩增建立一种高灵敏的蛋白质检测方法.首先合成3段寡核苷酸序列即凝血酶适体探针,上游连接子和下游连接子.将适体探针与凝血酶温育结合后,再加入核酸外切酶I降解未能结合的探针.接着将保护下来的探针与连接子杂交、连接和对连接产物进行定量PCR .分别建立连接产物标准品浓度与Ct 值的标准曲线和凝血酶浓度与连接产物浓度的标准曲线,通过定量PCR对凝血酶进行定量.结果显示,基于适体的外切酶保护凝血酶检测方法灵敏度较高,连接产物标准品浓度的对数值和Ct 值之间的方程为y =- 2 95x + 33 6 5 (R2 =0. 990 ,P 0 .0 1) ;凝血酶浓度和连接产物浓度对数值之间的方程为y =0 94x - 0 . 2 9(R2 =0 . 998,P 0 . 0 1) ,还对可能影响检测的有关参数举行了探讨.

蛋白质发展前景

蛋白质工程已在医用蛋白（如胰岛素），抗体等生产中发挥巨大作用。将来还要拓展的是提高生化反应的催化效率；增加蛋白质的热稳定性和对极端pH的耐受性，扩大其使用范围；通过修饰酶的有机相反应活性，使生化反应能在非生理条件下进行；通过改变酶的催化特性，使其不再需要昂贵的辅酶；通过提高酶与底物的亲和性，减少生物转化过程中副产物的形成；通过增强功能蛋白对蛋白酶的抗降解性能，简化其分离纯化工序并提高收率；通过删除酶的变构效应，解除产物对酶的反馈抑制等。

随着结构分析技术的发展，现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体

结构得到了阐明。70年代末以来，采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法，不仅提高了分析效率，而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。

细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。

不冻蛋白质(Ice Structuring Proteins,简称ISP)也称冻结构蛋白,它以非依数性的形式降低水溶液的冰点、抑制冰晶生长、抑制重结晶[1],是一种新型的抗冻剂,可以应用于冷冻食品、农业种植、医学等领域。现就这种新型抗冻剂(ISP)的起源、应用、工艺、国内外的发展情况及现存的问题作一简述。1不冻蛋白的起源及研发历程有些鱼类在极冷的环境中依然能够生存,有些植物(冬小麦、裸麦、萝卜叶等等)能够抗霜冻而生存等自然现象引起了科学家们的注意[2],这些动植物在其生物体内是否存在一种物质,这种物质可以阻止动植物体内体液成分形成结晶而固化,并且把结晶的成长控制在最低范围内。带着这一疑问,科学家们开始了对这些耐寒生物体的探索。在1969年,斯坦福大学的Devries[3]在南极的一种鱼的血液中首次发现并提纯了这一物质ISP,解开这一疑团。在随后的三十多年,人们又先后从其它资源(动植物、昆虫等)发现不冻蛋白质,如:1992年,加拿大的等首先从黑麦中提取出植物等在欧白黄的冬季枝条中分离得到

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在生物体内许多蛋白质是发生了修饰的,蛋白质的修饰对其生物功能有重要的调节作用,蛋白质修饰研究是蛋白质组学研究有别于基因组学研究的重要特 ，但由于蛋白质修饰的复杂性和动态性,同时也成为难点之一。修饰基团约有20余种类型,研究较多的修饰有磷酸化、糖基化、泛素化等。一般来说,最直接和有效的方法是2DE比较,因为发生了修饰的蛋白质其分子量和等电点会发生有规律的变化,2DE会将这种变化的种类和强度表现出来。2DE后还可进行Western blotting使用特异抗体寻找修饰蛋白从而对其鉴定。修饰位点分析可借助于质谱技术,通过

蛋白质是所有生命体的重要组成部分，是一切生命的物质基础，生命体的一切代谢活动都与蛋白质的活动和代谢密切相关，蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴交叉学科。通过对蛋白质结构与功能关系的了解，借助于生物信息学的知识和手段，利用基因定点诱变和基因重组等技术特异性地改造蛋白质的结构基因，产生具有新的特性的蛋白质。

参考文献

吴瑾瑾,石森林;Folin-lowry法测定康克胶囊可溶性蛋白质含量[J];浙江中医学院学报;2001年05期

王先良,王小利,苏艳华,张迟,张莉君,李芳,李柏生,李晓波,徐淑雷,李媛媛,徐顺清;一种新的基于适体和酶切保护分析的超灵敏蛋白质检测方法[J];中国生物化学与分子生物学报;2005年03期

《食品科技》2010年第08期 作者：李宏梁;丁慧;郭文;赵晶晶

马增春,高月,吕俊萍,王升启;双向凝胶电泳中三种蛋白质检测方法的比较[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年04期

李一林;基于适配体探针技术的高灵敏度检测蛋白质方法研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年

中国书店正版|精编蛋白质科学实验指南 （美)科林根（Coligan J.E

首届中国兽药大会动物药品学暨中国畜牧兽医学会动物药品学分会2008学术年会论文集 2008-11-01

《中国食品添加剂》2007年第04期 作者：赵丽冰;钟细娥;詹耀才;

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在生物体内许多蛋白质是发生了修饰的,蛋白质的修饰对其生物功能有重要的调节作用,蛋白质修饰研究是蛋白质组学研究有别于基因组学研究的重要特 ，但由于蛋白质修饰的复杂性和动态性,同时也成为难点之一。修饰基团约有20余种类型,研究较多的修饰有磷酸化、糖基化、泛素化等。一般来说,最直接和有效的方法是2DE比较,因为发生了修饰的蛋白质其分子量和等电点会发生有规律的变化,2DE会将这种变化的种类和强度表现出来。2DE后还可进行Western blotting使用特异抗体寻找修饰蛋白从而对其鉴定。修饰位点分析可借助于质谱技术,通过

蛋白质是所有生命体的重要组成部分，是一切生命的物质基础，生命体的一切代谢活动都与蛋白质的活动和代谢密切相关，蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴交叉学科。通过对蛋白质结构与功能关系的了解，借助于生物信息学的知识和手段，利用基因定点诱变和基因重组等技术特异性地改造蛋白质的结构基因，产生具有新的特性的蛋白质。

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王先良,王小利,苏艳华,张迟,张莉君,李芳,李柏生,李晓波,徐淑雷,李媛媛,徐顺清;一种新的基于适体和酶切保护分析的超灵敏蛋白质检测方法[J];中国生物化学与分子生物学报;2005年03期

《食品科技》2010年第08期 作者：李宏梁;丁慧;郭文;赵晶晶

马增春,高月,吕俊萍,王升启;双向凝胶电泳中三种蛋白质检测方法的比较[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年04期

李一林;基于适配体探针技术的高灵敏度检测蛋白质方法研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年

中国书店正版|精编蛋白质科学实验指南 （美)科林根（Coligan J.E

首届中国兽药大会动物药品学暨中国畜牧兽医学会动物药品学分会2008学术年会论文集 2008-11-01

《中国食品添加剂》2007年第04期 作者：赵丽冰;钟细娥;詹耀才;

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