酵母菌死活细胞的鉴别及子囊孢子的观察实验报告 - 图文

山东大学实验报告2017年11月20日

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科目：微生物学实验题目：酵母菌死活细胞的鉴别及子囊孢子的观察姓名：丁志康

一、 目的要求

1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

2、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 3、学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。

二、 基本原理

1、酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。大多数酵

母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水—碘液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方法。

2、美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化形成蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化性变为无色的还原性。因此。具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

3、子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母菌要选择适合形成子囊孢子的培养基。麦氏培养基（葡萄糖—醋酸钠培养基）有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。

三、 器材

1、菌种：酿酒酵母

2、培养基:液体合成培养基，麦氏琼脂斜面培养基。 3、溶液或试剂：吕氏碱性美蓝染液。

4、仪器或其他用具：显微镜，载玻片，盖玻片等。

四、 操作步骤

（一）酵母菌死活细胞的鉴别观察

1、按无菌操作用用一洁净的吸管从培养了一周的酵母菌液体培养基中吸取少量菌液，滴半滴于洁净载玻片中央，然后在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染液，混合均匀。（染液不宜过多或过少，否则再盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。）

2、用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。（盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。）

3、将纸片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞，估测死活细胞比例。

4、染色约30min后再次进行观察，注意观察死细胞数量是否有所增加。

（二）酵母菌子囊孢子的观察

1、菌种活化：将酿酒酵母移种至新鲜的液体合成培养基上，25~28℃培养24h左右，然后再转种2~3次。

2、产孢培养：将经活化的菌种转接到麦氏琼脂斜面上，25~28℃培养约1周。

3、制片：取经产孢培养的酵母斜面培养物，在洁净载玻片上按常规涂片、干燥、固定。 4、染色：滴加孔雀绿染液染色1min。 5、脱色：用95%的乙醇脱色30s，水洗。

6、复染：用番红复染30s，水洗，用吸水纸吸干。

7、镜检：干后用油镜观察。子囊孢子呈绿色、菌体和子囊成粉红色。

五、 实验结果

1、实验照片

示酵母菌出芽分裂（100×10） 酵母菌美蓝染色（100×10）

酵母菌美蓝染色局部放大（100×10） 示酵母菌子囊孢子（100×10）

2、实验描述

①酵母菌美蓝染色：在经过美蓝染液染色之后，活细胞呈现透明，死细胞呈现蓝色，而衰老细胞则是淡蓝色或蓝色，在所有细胞中大约有一成的酵母细胞为死细胞，3min和30min观察得到的结果无明显差异。 ②子囊孢子观察：酵母菌在经过孔雀绿染色、乙醇脱色并用番红复染以后，子囊孢子呈现绿色，而四分孢子外的膜以及酵母菌菌体都呈现红色或粉红色，子囊孢子常以4个聚集在一起，呈平铺状或立体四面体状。

六、 思考题

(1) 吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。

美蓝染液尽管是活细胞染液，但是当浓度过高时也会由于产生高渗环境的缘故对酵母菌形成负担，从而导致随着染色时间的延长，死细胞越来越多，但浓度合适时短时间内对于酵母菌的存活却没有明显影响。

(2) 在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？

①体积：酵母菌的体积一般比细菌大几倍到几十倍，在高倍镜下就可看见，而细菌一般必须借助油镜才可以观察到；②形态：细菌尽管形态各异，但大多为杆状、球状、螺旋状等，而酵母菌却为椭球状；③分裂方式：细菌为二分裂，故对于个体细胞独立的细胞种类来说，看到的细胞都是分离的，就算有合在一起的也是一样大小，而酵母菌却常常可以看到带着小号的芽体的出芽生殖期酵母。

(3) 如何区别酵母菌的营养细胞和释放出的子囊外的子囊孢子？

①染色：经过孔雀绿—番红复染的子囊孢子为绿色，而营养细胞为红色，可以显著区分开；②大小：子囊孢子的大小比一般营养细胞要小一些。

七、 培养基配方

1、合成培养基（1000mL）

葡萄糖 20g 酵母浸膏 5g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000mL pH自然

113℃灭菌30 min.

2、麦氏琼脂培养基（1000mL） 葡萄糖 1g KCl 1.8g 酵母浸膏 2.5g 醋酸钠 8.2g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000mL 113℃灭菌30 min.

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