流式细胞术讲义

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流式细胞术讲义

流式细胞术的血液学应用

北京协和医院血液科汪玄

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流式细胞术的概念

流式细胞术(Flow cytometry;FCM)是集计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现代细胞分析技术，它以流式细胞仪(Flow cytometer)为工具，在单细胞水平上对大量细胞进行高速(每秒计数可达1000~10000个细胞)、准确、多参数的定量分析或分选(纯度可达99%以上),已成为现代骨髓血细胞学研究中最先进的分析技术。

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流式细胞术与PNH的诊断

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原理

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性基因突变所致的克隆性疾病，其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂-锚 (GPI-anchor)连接蛋白如CD59,CD55 等表达明显减低或缺乏，导致对补体的敏感性增强而产生溶血性贫血。

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样本要求： EDTA抗凝血或骨髓3ml 每天上午送检

收费：CD55/CD59

CD59

280元 140元

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临床诊断值 CD59阳性的红细胞大于等于95% CD59阳性的中性粒细胞大于90%

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流式细胞术与白血病免疫分型

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免疫分型原理

流式细胞术(FCM)白血病免疫分型是利用荧光染料标记的单克隆抗体(McAb)检测相应抗原，经过多参数分析，测定白血病细胞的细胞膜、细胞浆和细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型时测量细胞数量一般是在10000~50000个细胞之间，而且快速、特异、准确、重复性好，能区分细胞的系列，划分其分化、发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机制研究等有重要价值。

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样本要求：肝素抗凝骨髓3ml(或外周血) 每天上午送检收费：

70元/每个单抗(临床常规检测12个单抗)

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干/祖细胞标志：

CD34、CA133 髓系标志：

CD33、CD13、CD11b、CD15、MPO B细胞相关标志：

CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 CyIg、SmIg T细胞相关标志：

CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8

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常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

三色标记McAbMouseIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCP CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCP Anti-HLA-DA FITC / CD13 PE/ CD45 PerCP CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP CD14 FITC/CD33 PE/ CD45 PerCP CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCP CD8 FITC/CD4 PE/ CD45 PerCP CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCP CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP CD61 FITC/CD41 PE/ CD45 PerCP

染色细胞及目的阴性对照及设门 T淋巴系细胞、部分早期髓系细胞 B淋巴系细胞髓系细胞、 B淋巴系细胞、部分T淋巴系细胞反映细胞分化程度髓系细胞和单核细胞 B淋巴系细胞及其分化程度 T淋巴系细胞及其分化程度 T

淋巴系细胞、NK细胞幼红细胞巨核细胞

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B-ALL CD10 +

T-ALL -

AML -

CD19CD22c/m CD3c/m CD5 CD7

++ - - -

-- + + +

-- - - -

CD13CD33

MPO

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AML 免疫分型FAB/ CD34 CD33 HLA- CD13 DR CD14 CD15 CD11b 其它

M1M2 M3 M4 M5 M6 M7

+± - - - ± ±

++ + + + ± +

++ - + + ± +

++ + ± ± ± -

-- - + + - -

±± ± + + ± ±

-- - ± ± - -CD71 GP-A CD41 CD61 CD38 CD9

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T-ALL免疫分型CD2 CD3 CD5早期 T-ALL 前 T-ALL + + ±

CD7+

CD4-

CD8-

TdT+

T-ALL

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B-ALL免疫分型HLADR

CD19 CD10 CD20

CD22

cIgM

mIgM

TdT

早B前体 ALL普通型前 B-ALL B-ALL

+ ++

- +±

- -+

- --

- -+

- --

+ +-

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FCM-IM诊断混合型白血病

流式细胞术测定发现的双系列或多系列表达的结果较多，但双表型白血病不一定就是混合型，理由如下：混合型白血病诊断：应根据形态、免疫、遗传、分子生物学等综合判断，属双系列(双克隆)?双表型(单克隆)? 系列转换型？需考虑到抗原/单抗的多向性： CD4、CD7、CD10、CD38、CD56 正常血细胞随分化成熟，各系列血细胞的免疫标志特性逐步规律化：白血病细胞的分化发育却丧失严格的规律性(lineage infidelity)与免疫表型的阶段性(differentiation asynchrony),因而出现异常抗原表达，或过高或过低或不表达或交叉系列表达。

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设门方案

采用CD45/SSC设门法 (优于FSC/SSC设门法) CD45其表达程度在不同细胞各异。淋巴细胞 >单核细胞>成熟粒细胞 >原/幼细胞，而红细胞不表达。 SSC在成熟粒细胞>单核细胞>原/幼细胞>淋巴细胞>红细胞。

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临床原/幼细胞群定量按照新的WHO分型标准，对初发病者，

原/幼细胞占总细胞数20%以上即可判为白血病。对于临床原/幼细胞群定量应以原/幼细胞群的细胞数为分母。对于临床原/幼细胞群定性比定量更重要。

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白血病免疫分型病例分析病例1 梁丽琴女性 24岁异常表型中:

CD10+. CD34+. CD22+. CD38+. CD19+. HLA-DR+

结论：表型符合 Pre-B-ALL

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白血病免疫分型病例分析病例2 王丙午男性 68岁异常表型中: