羟基肉桂酸衍生物清除超氧阴离子自由基研究

第16卷 第3期

1998年8月辐射研究与辐射工艺学报J.Radiat.Res.Radiat.Proces.Vol.16,No.3August1998

羟基肉桂酸衍生物清除超氧阴离子

自由基研究

钱素平 张加山 姚思德 王文锋 林念芸

(中国科学院上海原子核研究所辐射化学开放实验室 上海201800)

摘要 采用脉冲辐解技术,利用竞争动力学方法测定了中性条件下3种羟基肉桂酸衍生物(咖啡酸、阿魏酸和芥子酸)与超氧阴离子自由基的反应速率常数,结合稳态分析,探讨了相应的反应机理。

关键词 羟基肉桂酸衍生物,脉冲辐解,竞争动力学,产物分析,超氧阴离子自由基

自由基生物学和自由基医学研究表明,人体内产生的过剩氧自由基是造成心脑血管疾病、生物组织癌变及衰老的主要原因之一。羟基肉桂酸衍生物(HCAD)是一类从中草药中提取的天然抗氧化剂。研究发现,它是一种辐射保护剂,可有效清除羟基自由基,并可通过电荷转移反应快速修复DNA氧化性羟基加成自由基[1,2]。本文分别用苯醌和四硝基甲烷与羟基肉桂酸衍生物竞争超氧阴离子自由基的竞争动力学方法,获得了超氧阴离子自由基和羟基肉桂酸衍生物(芥子酸、咖啡酸和阿魏酸)的反应速率常数。结合反应产物的紫外分光光度分析和高效液相色谱分离分析,提出了超氧阴离子自由基与羟基肉桂酸衍生物的反应,可能是发生在芳环侧链双键上的加成反应。

1实验方法

1.1实验装置

辐射源为上海原子核研究所辐射化学开放实验室的10MeV电子直线加速器,电子脉冲宽度为8~10ns,单脉冲剂量为10~40Gy可调,脉冲束流为2~3A。使用光程为20mm的高纯石英样品池,束流与分析光垂直相置,分析光经光电倍增管检测后送入HP54510B数字示波器并经计算机储存处理。详见文献[3]。

1.2试剂以及溶液的配制

咖啡酸、阿魏酸、芥子酸均用3次蒸馏水重结晶纯化;1,4 对苯醌用丙酮3次重结晶,3次蒸馏水洗涤纯化,通氮隔氧待用;四硝基甲烷为Sigma公司产品,未经纯化直接使用;特丁醇经蒸馏纯化。所有溶液都用3次蒸馏水配置,以纯氧饱和或用纯氮(>99.99%)鼓泡20min。实验在室温下进行。

2结果与讨论

2.1超氧阴离子自由基与苯醌之间的电荷转移反应

图1为氧气饱和的含有0.01~0.1mmol/L苯醌稀水溶液经脉冲辐解后在430nm处记录的瞬态吸收谱。该体系吸收电子辐射能量后,首先产生水的辐解产物:羟基自由基、水合电子和氢原子。羟基自由基经反应(1)被叔丁醇(t BUOH)清除。水合电子与氧和苯醌的反应速率常数分别

10-13-1[4]10-13-1为4 10moldms和1.9 10moldms。氧气饱和水溶液中氧的浓度为1.25mmol/L远高于苯醌的浓度,所以水合电子优先与氧反应,由(2)式生成超氧阴离子自由基。氢原子经反应

[4](3)生成超氧阴离子自由基。超氧阴离子与苯醌经反应(4)产生苯醌阴离子。故此溶液经辐射

国家自然科学基金资助项目

第3期钱素平等:羟基肉桂酸衍生物清除超氧阴离子自由基研究147所产生的瞬态吸收谱即为苯醌阴离子的瞬态吸收。

HO +(CH3)3COH(CH3)2C(OH)CH2

-eaq+(1)(2)

(3)

(4)H+O2Q+O2HO2K-- O2+H+O2+QO2- - O2-

由苯醌阴离子自由基的生长曲线,可求得对应于不同苯醌浓度的电荷转移反应表观速率常数kobs。该表观速率常数表示为:kobs/[O2]=k+[Q]/[O2]+k-

图2为以kobs/[O2]对[Q]/[O2]所作的直线图,从该直线的斜率和截距可分别求得:

k+=1.03 109mol-1dm3s-1,k-=8 106mol-1dm3s-1,该值与文献[4]报道相一致。

Fig.1Thetransientabsorptionat430nmarisingfrompulseradi

olysisofoxygensaturatedsolutionscontaining0.1mol/Lt

BUOH

(1)0.1(2)0.06(3)0.03(4)0.02(5)0.01mmol/LQ Fig.2Thedependenceofkobs/[O2]on[Q]/[O2]

2.2羟基肉桂酸衍生物与超氧阴离子自由基反应速率常数

图3对比了氧饱和和氮鼓泡除氧的0.1mmol/L咖啡酸水溶液脉冲辐解后获得的瞬态吸收谱,氧气饱和条件下咖啡酸阴离子自由基的OD值远小于除氧条件下的OD值,这表明含氧体系中水

Fig.3Thetransientabsorptionat2 safterpulse

radiolysisofthesolutionscontaining0.1mol/L

t BUOHand0.1mmol/Lcaffeicacidsaturatedwith

(A)oxygen(B)nitrogengasFig.4ThedependenceofOD0/ODon [HCAD]/[Q](1)sinapicacid(2)caffeicacid(3)ferulicacid

合电子主要与氧反应生成超氧阴离子自由基。此外,氧饱和条件下在300~650nm波长范围内未观察到其他特征吸收。说明在仪器检测范围内很难直接观察到咖啡酸和超氧阴离子自由基反应的,在

148辐射研究与辐射工艺学报第16卷430nm处检测瞬态吸收曲线。结果430nm处的吸收曲线随咖啡酸浓度而明显改变,这表明咖啡酸与苯醌存在竞争超氧阴离子自由基的反应,见反应(6)。由于对苯醌与超氧阴离子自由基电荷转移速率常数k+远大于k-,故在处理咖啡酸与对苯醌竞争超氧阴离子自由基的反应中,可以忽略苯醌阴离子自由基向超氧阴离子自由基的电子转移反应造成的影响:

Q+O2- k5

- Q- +O2k6- (5)HCAD+O2Q+O2(6)

保持单脉冲剂量不变,则超氧阴离子自由基的初始产额为一定值。假设由超氧阴离子自由基的电子转移生成的对苯醌阴离子自由基在430nm处的吸光度为OD0,加入不同浓度咖啡酸后其吸光度变为OD,则有:

OD0/OD=k6[A]/k5[Q]+1(7)

选择不同浓度的咖啡酸,测定一系列OD值,以OD0/OD对[HCAD]/k5[Q]作图,可得到截距为1的直线,从直线的斜率可以求得咖啡酸与超氧阴离子自由基反应的速率常数K0(见图4)。使用与咖啡酸相同的方法分析了阿魏酸和芥子酸与超氧阴离子自由基的反应及其反应速率常数结果列于表1。

2.3用四硝基甲烷作为参比,测定羟基肉桂酸衍生物与超氧阴离子自由基反应的速率常数

为确证用苯醌作参比物的竞争动力学方法所测出的羟基肉桂酸衍生物和超氧阴离子自由基反应速率常数的可靠性,选用四硝基甲烷作为参比物。四硝基甲烷经反应(8)和超氧阴离子自由基反应[5],产生硝仿自由基[C(NO2)3-],其反应速率常数为2 109mol-1dm3s-1,产物在350nm处有很强的特征吸收。

C(NO2)3-+O2+NO2(8)

Tab.1TherateconstantsoftheHCAD O2- 当加入羟基肉桂酸衍生物后,它们便经由reaction反应(6)和四硝基甲烷竞争超氧阴离子自

HCAD由基。采用上述相同的方法测出反应速率QsystemC(NO2)4systemaveragevalue常数(见表1)。由表1可见,两种参比物所sinapicacid34.228.431!3测得的数据均在误差范围之内,故取两个caffeicacid9.256.377.8!1.5体系的平均值作为羟基肉桂酸衍生物与超氧阴离子自由基反应的速率常数。

2.4羟基肉桂酸衍生物与超氧阴离子自由基反应机理

表1显示HCAD与O2- 反应速率常数大小顺序为:芥子酸>咖啡酸 阿魏酸。从结构看羟基肉桂酸衍生物与超氧阴离子自由基有几种可能的反应途径:电子或质子转移;加成反应(包括芳香环上加成和环外加成)。如体系发生电子或质子转移,则应在360nm左右检测到羟基肉桂酸衍生物阴离子自由基特征吸收峰,或在350~380nm范围内检测到其阳离子或酚氧自由基特征吸收峰

[3]的形成过程,但在实验中并未检测到类似的特征吸收,所以认为未发生类似反应。

至于加成反应,根据羟基肉桂酸衍生物的结构,有环加成和环外烯基双键上的加成两种可能。环加成又有环上亲核加成和亲电加成两种可能性。就亲核反应而言,由于芥子酸比阿魏酸多一个甲氧基,其供电子能力增加,使芳环上电子云密度相对增加,应该是不利于亲核加成反应,与实验结果相反,故可能性很小。此外,无论是环上亲核加成还是亲电加成,在脉冲辐解后,都应观测到氢过氧环己二烯基型自由基的瞬态吸收[4](大约在320nm附近),或在400~500nm之间出现醌型化合物的强吸收[3]。这与实验结果也不符。

另一种反应可能性就是在芳环外的烯基双键上的加成反应。通过分析氧饱和的咖啡酸pH7的水溶液体系,发现经过总剂量为30Gy的电子照射后,与咖啡酸比较,反应产物的芳环并没有被破坏,但光吸收发生25nm蓝移。这与环外双键被破坏,芳环共轭体系缩小相一致;此外,在84%的水和16%的甲醇流动相条件下,对氧饱和的咖啡酸中性水溶液在辐解前和辐解后的高效液相分析,C(NO2)4+O2- k8

第3期钱素平等:羟基肉桂酸衍生物清除超氧阴离子自由基研究149破坏的结果相一致。因而,可以认为超氧阴离子自由基与羟基肉桂酸衍生物的反应,主要是发生在芳环外的烯基双键上,而不是在芳环上。羟基肉桂酸衍生物与超氧阴离子自由基的反应的可能途径如下

:

Caffeicacid:R1=H,R2=OH

Ferulicacid:R1=H,R2=OCH4

Sinapicacid:R1=R2=OCH3

3 结论

在脉冲辐解装置上,使用竞争反应动力学方法,以对苯醌和四硝基甲烷为参比物,测定了羟基肉桂酸衍生物清除超氧阴离子自由基的反应速率常数。可以认为,羟基肉桂酸衍生物是一类有效的超氧阴离子自由基的清除剂。经研究推断,超氧阴离子自由基由于加成到羟基肉桂酸衍生物苯环外丙烯基的双键上而被清除。这一加成产物的结构和毒理分析有待于进一步确认。

参考文献

1 WangW,LuoJ,YaoSetal.RadiatPhysChem,1995,46(1):41

2 JiangY,LinW,YaoSetal.RadiatPhysChem,1998

3WangW,LuoJ,YaoSetal.RadiatPhysChem,1993,42:985

4 PatelKB,WillsonRL.JChemSocFaradayTrans,1973,69:814

5 HillerKO,AsmusKD.JPhysChem,1983,87:3682

6 JonrsonM,LindJ,ReitbergerTRetal.JPhysChem,1993,97:8229

SCAVENGINGOFSUPEROXIDERADICALANIONWITH

HYDROXY CINNAMICACIDDERIVATIVES:

APULSERADIOLYSISSTUDY

QianSuping ZhangJiashan YaoSide WangWenfeng LinNianyun

(LaboratoryofRadiationofChemistry,TheChineseAcademyofSciences,ShanghaiInstituteofNuclear

Research,Shanghai201800)ABSTRACT Usingpulseradiolysistechniquesthereactionrateconstantsofhydroxy cinnamicacidderivatives(HCAD)withsuperoxideradicalanion(O2- )wereobtainedbycompetitionreactionkineticanalysis.ThereactingmechanismwasproposedbasedontheHPLCanalysisoffinalproductsandUVspectrophotometry.

KEYWORDS Hydroxycinnamicacidderivative(HCAD),Pulseradiolysis,Competitionreaction

kineticanalysis,Finalproductsanalysis,Superoxideradicalanion

TheprojectwassupportedbyTheNationalNautralScienceFoundationofChina

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/pbg4.html