蚕丝蛋白水解液中多肽得率的测定

蚕丝蛋白水解液中多肽得率的测定

李琳琳 曹新志* 游见明 赵迎庆

（四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000）

摘要：用茚三酮显色法测定蚕丝蛋白质水解液中游离氨基酸的含量，15%单宁酸沉淀蛋白质水解液中的大分子蛋白质，经离心过滤后，用凯氏定氮法测定上清液中总蛋白含量，继而测定蚕丝蛋白水解液中多肽的得率。本试验以期用低成本高效率的方法测得多肽的得率，进而可以应用于工业化生产。

关键词：茚三酮显色反应 凯氏定氮 单宁酸 多肽得率 中图分类号：S88 文献标识码：A 基金项目：四川省教育厅重点项目（14ZA0207）

Determination of Yield of Peptides in Silk Protein Hydrolysates Li Lin-lin Cao Xin-zhi You Jian-ming Zhao Ying-qing （College of Bioengineering, Sichuan University of Science & Engineering, Zigong,

Sichuan 643000,China）

Abstract: The content of free amino acid in silk protein hydrolysate is determined by using ninhydrin color reaction. Macromolecule protein in protein hydrolysate is deposited by using 15％tannic acid．After centrifugalization and filtration, the total content of protein in the clear solution is determined by using Kjeluhl method. Then the yield of peptide in silk protein hydrolysate is obtained. The purpose of this test is to obtain the yield of peptide by using cost-efficient method , then this approach can be applied to industrial production.

Key words: ninhydrin color reaction Kjeluhl Tannic acid yield of peptide

丝素蛋白中含有丰富的氨基酸，具有优良的生物活性。但是由于丝素蛋白本身分子量较大，又不溶于水，所以其用途受到很大的限制。最新消化理论证明，一定分子量的多肽可以直接被消化道吸收，且转运速度快，耗能较低同时还具有不易饱和的优点，大大提高了蛋白的利用率[1]。作为高分子蛋白质的沉淀剂，在沉淀剂使用量都过量的情况下，单宁酸能沉淀比磺基水杨酸和三氯乙酸更小的高分子蛋白质，有文献报道单宁酸能沉淀分子量为2300U的蛋白质，此外大分子蛋白质与单宁酸溶液混合后立即产生沉淀[2]。离心后的上清液中含有的蛋白质称为酸溶性蛋白质，只包括游离氨基酸和多肽，测定酸溶蛋白质的总氮，扣除其中的游离氨基酸，即为多肽的含量。所以通过加入单宁酸可以将大分子蛋白质与小分子多肽分离，且速度较快，节省测定时间，提高效率。本试验采用单宁酸作为大分子蛋白质的沉淀剂，结合茚三酮显色法[3-4]和凯氏定氮仪[5-7]测定蚕丝蛋白水解液中多肽的得率。 1 材料与方法

1.1 主要仪器及设备

HR-500半自动凯氏定氮仪:上海华睿仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；TGL-16LG-B冷冻离心机：湖南星科科学仪器有限公司；H01-1数显恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；PHS-2C精密pH计：上海虹益仪器仪表有限公司。 1.2 试剂及其配制

pH为5.4~5.6的乙酸-乙酸钠缓冲液：称取乙酸钠30.0g加1.0mL冰醋酸进行溶解，并加水稀释至250mL，混匀，用精密pH计测量混合缓冲液的pH值，若有偏差，微调并标定至所需pH值；3%茚三酮乙醇溶液：称取1.5g茚三酮，加入适量乙醇微热溶解后，转移至500mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，置于4℃冰箱中备用；丙氨酸标准溶液的配制：准确称取0.0100g丙氨酸标准品置于100mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，摇匀，置于4℃冰箱中

备用，此溶液浓度即为100μg/mL；0.2%抗坏血酸的配制：准确称取0.2g抗坏血酸，加入适量去离子水进行溶解，转移至100ml容量瓶中，用去离子水定容至刻度；40%NaOH溶液的配制：准确称取400gNaOH，加入适量去离子水进行溶解，待NaOH完全溶解并不断搅拌使其无色透明时，将其转移至1000mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度；4%硼酸溶液的配制：准确称取40g硼酸，加入适量去离子水并将其放在40~50℃的水浴锅中进行溶解，待其完全溶解至溶液变成无色透明时转移至1000mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度；0.01mol/L盐酸的配制：准确量取0.45mL盐酸，缓慢注入500mL水中。（此盐酸溶液需进行标定）；15%单宁酸溶液的配制：准确称取15g单宁酸，加适量水溶解，然后用容量瓶定容至100mL；混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液和0.5%溴甲酚绿乙醇溶液等体积混合。混合催化剂：0.2~0.3g的硫酸钾与0.2~0.3g的五水硫酸铜混合均匀。

1.3 样品处理

准确抽取3.0mL购买的样品液，经离心机4000r/min离心10分钟，吸取上清液1.0mL注入比色管中，再加入15%的单宁酸3mL，室温静置沉淀10min，用离心机4000r/min离心30min。

1.4 上清液中游离氨基酸的含量

准确量取1.3中的上清液1.0mL置于25mL比色管中，加入2.0mL茚三酮溶液，2.0mL抗坏血酸溶液，5.0mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，加水至25mL，摇匀。置于沸水浴中加热20min进行显色，取下冷却，定容，在568nm波长下比色，在标准曲线上查出相应的游离氨基酸含量。

1.5上清液中多肽含量的测定

准确移取1.3中的上清液2.0mL加入消化管中，之后依次加入0.5g混合催化剂、98%的浓硫酸10mL，打开消化炉，待消化炉的温度升到421℃时计时开始，让其消化1.0h后，关闭消化炉，冷却至室温。将消化管放入凯氏定氮仪，关上安全门，等待仪器蒸馏，蒸馏结束，取出消化管和收集氨气的锥形瓶，之后用0.01%的盐酸标准液滴定，锥形瓶里的液体溶液由蓝绿色变为微红色时为滴定终点。记录盐酸标准溶液消耗的体积，同时测定空白值。 1.6 上清液中多肽含量的计算

C(V2?V1)?W =

M氮1000?6.25?100

5?2100式中：W为蛋白质的质量浓度,g/100mL；C为盐酸标准液的浓度，mol/L；V1为空白滴定消耗的标准盐酸的体积，mL；V2 为样品消耗滴定消耗的标准盐酸的体积，mL；2为取蚕丝水解液样品的体积，mL；M氮为氮的摩尔质量14.01g/mol；6.25为蛋白质的系数。

T = W – A

式中，T为多肽的含量，A为游离氨基酸的含量。

同一样品测定三次，其结果的算数平均值作为最终结果，最终结果精确到小数点后两位。 2 结果与分析

2.1 氨基酸标准曲线制作的条件选择 2.1.1 反应原理

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，其他所有的α-氨基酸都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质[8]。该反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生 CO2 、NH3和醛，而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所生成的还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为5.0～7.0，同一浓度的氨基酸在不同pH条件

下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色，因此要控制好pH。该反应十分灵敏，1:1500 000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，因此是一种常用的氨基酸定量方法。 2.1.2 波长条件的选择

分别取丙氨酸标准液、样品溶液、去离子水各1mL于3支试管中，甘氨酸标准液和样品溶液重复做三次。然后在各试管中依次加入2.0mL茚三酮溶液，2.0mL抗坏血酸溶液，3.0mL乙酸-乙酸钠缓冲液，摇匀，置于沸水浴中加热20min，取出，冷却。以去离子水为空白，在分光光度计中进行波长扫描，测定丙氨酸标准对照品溶液、样品溶液的吸光度值。结果表明对照品溶液和样品溶液在569nm处均有最大的吸收，因此确定本试验的最佳测定波长为569nm。

2.1.3 茚三酮加入量的选择

在6根25mL比色管中分别加入5.0mL丙氨酸标准液，然后在6支比色管中依次加入

1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL茚三酮溶液，再分别加入2.0ml抗坏血酸溶液和5.0ml乙酸-乙酸钠缓冲液，加水定容至刻度，摇匀。置于沸水浴中加热20min进行显色，取下冷却，定容，以去离子水为空白试验。在569nm波长下测定氨基酸标准液的吸光度，结果见下图1：

图1 茚三酮用量对吸光度的影响

Fig. 1 The effect of amount of ninhydrin on Absorbance

由图1可知，当茚三酮加入量在1.0?3.5mL时，随着茚三酮加入量的不断增大，吸光度不断增大，当茚三酮用量为2.0mL时接近最大值，故茚三酮的加入量以2.0mL为宜。 2.1.4 抗坏血酸溶液加入量的选择

在6根25mL比色管中分别加入5mL丙氨酸标准液，然后在6支比色管中分别加入2.0mL茚三酮溶液和5.0mL乙酸-乙酸钠缓冲液，再依次加入1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL抗坏血酸溶液，加水定容至刻度，摇匀。置于沸水浴中加热20min进行显色，取下冷却，定容，以去离子水为空白试验。在569nm波长下测定氨基酸标准液的吸光度，结果见下图2：

图2 抗坏血酸用量对吸光度的影响

Fig. 2 The effect of amount of ascorbic acid on Absorbance

由图2可知，当抗坏血酸加入量在1.0?3.5mL时，随着抗坏血酸加入量的不断增大，吸光度不断增大，当抗坏血酸用量为2.0mL时接近最大值，故抗坏血酸的加入量以2.0mL为宜。

2.1.5 显色时间的选择

在6根25mL比色管中依次分别加入5mL丙氨酸标准液，2.0mL茚三酮溶液，2.0mL抗坏血酸溶液，5.0mL乙酸-乙酸钠缓冲液，加水定容至刻度，摇匀。置于沸水浴中分别加热10min，15min，20min，25min，30min进行显色，取下冷却，定容，以去离子水为空白试验。在569nm波长下测定氨基酸标准液的吸光度，结果见下图3：

图3 显色时间对吸光度的影响

Fig. 3 The effect of chromogenic time on Absorbance

由图3可知，显色时间在10?30min之间时，开始时随着显色时间的延长吸光度不断增大，到20min时显色时间达到最大，继续延长显色时间，吸光度基本保持在20min时的水平，因此，显色时间以20min为宜。 2.1.6 氨基酸标准曲线的制作[9-10]

在6支25mL的比色管中分别加入0.00；1.00；2.00；3.00；4.00；5.00mL的丙氨酸标准溶液，然后分别加入2.0mL茚三酮溶液，2.0mL抗坏血酸溶液，5.0mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，加水至25mL，摇匀。置于沸水浴中加热20min进行显色取下冷却，定容。用紫外分光光度计在569nm波长条件下，于3cm比色皿中以试剂空白做对照，测定标样显色溶液的吸光度。以丙氨酸标准溶液的含量为横坐标，以对应的氨基酸标准溶液的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。绘制的标准曲线如下图4：

图4 氨基酸标准曲线 Fig. 4 Stanurd curve of Amino acid

由以上标准曲线得到的回归方程为y = 0.0335x – 0.0002，相关系数R2 = 0.9996，因此在氨基酸浓度在0?25ug/mL范围内有良好的线性关系。 2.2 单宁酸沉淀蛋白质的条件的选择[11-13]

本试验采用正交试验L9（34）对15%单宁酸沉淀蛋白质的条件进行选择优化，四个因素分别是体积比，离心时间，沉淀温度和沉淀时间。正交试验因素水平见表1，正交试验结果见表2、表3和表4。

表1 正交试验的因素水平表 Table 1 factor level charts of orthogonal test 水平 1 2 3

A体积比/v/v

1:2 1:3 1:4

10 30 20

因素

B离心时间/min

C沉淀时间/min

5 10 15

D沉淀温度/℃

30 20 25

表2 正交试验L9（34）的设计及结果

Table 2 Design and the results of orthogonal test L9（34）

试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

A体积比/v/v

1 1 1 2 2 2 3 3 3

B离心时间/min

1 2 3 1 2 3 1 2 3

C沉淀时间/min

1 2 3 2 3 1 3 1 2

D沉淀温度/℃

1 2 3 3 1 2 2 3 1

多肽得率/% 65.39 67.77 52.38 73.71 86.17 64.08 53.37 63.49 48.23

表3 试验结果分析表

Table 3 Analysis of test results

指标 多肽得率（%）

K1 K2 K3 极差R 因素主次 优方案

A体积比/v/v 185.54 223.96 165.09 66.47

B离心时间/min 192.47 217.43 164.69 52.74

C沉淀时间/min 192.96 189.71 191.92 3.25

D沉淀温度/℃ 199.79 185.22 189.58 14.57

A > B > D > C A2B2D1C1

表4 正交试验结果的方差分析（Fα=19.00，α=0.05）

Table 4 orthogonal test analysis of variance

差异源 A B C

SS 595.553 464.026 1.836

df 2 2 2

MS 297.78 232.01 0.92

F比 324.375 252.737 1

显著性 ** **

D 误差

37.282 1.836

2 2

18.64

20.306

*

通过对正交试验结果的分析可知，对多肽得率影响最大的因素是样液与单宁酸的体积比，其次是离心时间，而沉淀时间和沉淀温度对多肽得率的影响都是比较小的，同时得到最优方案为A2B2D1C1，即所选的最佳因素水平为样液与单宁酸的体积比为1:3，离心时间为30min，沉淀时间为5min，沉淀温度为30℃。由于所选定的最优方案不在正交试验设计方案中，故而我们又进一步对其进行了验证实验，在此条件下得出其多肽得率为87.89%，比正交试验表中的最佳方案A2B2D1C3所得的多肽得率86.17%高，故最终所选方案为A2B2D1C1。结论

本试验探索了测定蚕丝多肽含量的方法条件，为蚕丝蛋白水解液中多肽含量的测定提供更有效的方法。同时试验结果也证明了15%单宁酸对大分子蛋白质的沉淀时间相比较于三氯乙酸以及磺基水杨酸是很快的，其反应时间几乎是在瞬间就完成的，故而用单宁酸可以节省试验时间，提高试验效率，增加效益。

作者简介：李琳琳（1988-），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术 *通信作者：曹新志，教授 邮箱：13890062236@163.com 电话：13890062236

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