微生物学实验

实验一 实验室和人体表面微生物的检查

一 实验目的

1 证明实验室环境与体表存在微生物

2 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型 3 体会无菌操作的重要性 二 实验原理

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。 三、器材

1、培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂平板

2、仪器或其他用具 无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤 1、写标签

任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。

注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。 2、实验室细菌检查 （1）空气

将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉膏蛋白胨琼脂平板放在洁净工作台内或无人走动的实验室中，移去皿盖，1h后盖上两个皿盖。 （2）实验台

①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。 ②取棉签

左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞，将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞，并将空试管放在试管架上。 ③弄湿棉签

左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞，并将灭菌水试管放在试管架上。

④取样 将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。

⑤接种 在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。 ⑥划线

另取接种环在火焰上灭菌，先将环端烧热，然后将接种环提起垂直放在火焰上，以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次。

左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。

闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，从上向下来回划线至1／2处。

烧灼接种环，转动平板，划最后1／4，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。 整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。 3、人体细菌的检查

（1）手指（洗手前与洗手后）

（2）鼻腔 按照实验台检查法的步骤②，取出棉签，并将其弄湿。用湿棉签在鼻腔内滚动数次，按实验台检查法的步骤⑤和⑥接种与划线，然后盖上皿盖。 4、将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37℃培养箱，培养1-2d 5、结果记录方法

（1）菌落计数 在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数，不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。

（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。 菌落特征：大小、颜色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘。 菌落特征描写方法如下：

①大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。

②颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。 ③干湿情况 干燥、湿润、粘稠。

④形态 圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。 ⑤透明程度 透明、半透明、不透明。 ⑥边缘 整齐、不整齐。 五、实验报告

P13：结果1、思考题3、4

1 比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？

2 人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？ 3 通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？ 六、实验总结

实验二 细菌简单染色和普通光学显微油镜的使用和细菌形态观察

一、目的要求

1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。 2．熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。 3．学习并掌握油镜的原理和使用方法。 三、油镜物镜的基本原理

微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40～45×）和油镜（1.8 mm，95～100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI（oil immer-sion）字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000～2 000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。 使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。

利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：

NA＝n·sinα 式中 NA=数值孔径；n=介质折射率；α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。 因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。

所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（methylenebluechloride，缩写为MBC），它可被电离成正、负离子：MBC→methylene blue++chloride-带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。 细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。

三、器材 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，擦镜纸，生理盐水；结晶紫染色液，碱性复红染色液；金黄色葡萄球菌，大肠杆菌。 四、操作步骤 1、涂片

取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作（参照实验一），分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。 2、干燥 于室温中自然干燥。

3、固定 涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。

4、染色 放标本于水平位置，分别滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。结晶紫染色液染2—3分钟，石炭酸复红染色液约染1—2分钟。 5、水洗

染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。 6、镜检

（1）、低倍镜观察 （2）、高倍镜观察 （3）、油镜观察

①用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。 ②在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

③从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。 ④从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。 用同样的方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。

⑤观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。

⑥将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。 六、实验报告

1．结果：绘出你所观察到的经单染色的两种细菌形态图。（注明物镜放大倍数和总放大率） 2．思考题

P18 思考题1、P28 思考题2、3

（1）根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？ （2）制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？ （3）在明视野显微镜下，观察细菌形态时，你认为用染色标本好，还是用未染色的活标本好，为什么？

使用油镜按下列步骤操作：

1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。

5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可，（注意向一个方向擦拭）。

6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。

六、实验总结

实验三 细菌的革兰氏染色

一、目的要求

了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。 三、器材

大肠杆菌，金黄色葡萄球菌；草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤 1．涂片将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2．染色

（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染用番红液染1～2分钟，水洗。

（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 五、实验报告 1．结果

在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌 2．思考题

P30 思考题1、2、4

（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？

（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？ 六、实验总结

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/pacv.html