实验二

DNA的酶切、回收、连接以及重组DNA的转化、鉴定

一、实验目的

学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。通过

琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段，并将回收的目的片段与载体质粒片段进行定向连接，并将体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中筛选出转化子。学习快速鉴定重组转化子的方法。以及掌握PCR的基本操作技术。

二、实验原理

目前已发现三类不同的限制性内切酶即I型、II型和III型。其中II型能

专一识别碱基顺序，并在该处切断双链DNA，因而在基因工程中得到广泛应用。DNA经限制性内切酶作用产生两种断裂状态：粘性末端或平末端。

酶切反应需Mg2+及其它一些辅助离子和一定的盐离子浓度，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高(>5%)，会使酶的识别位点发生改变，产生星活性(star activity)。绝大多数酶的反应温度37℃，也有个别要求在50 ~ 65℃。

回收目的片段的方法有多种，常用的有冻融法、低熔点琼脂糖法、透析袋法、电泳回收法、玻璃孔回收法等。本实验通过使用试剂盒来回收DNA 。

DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶主要有：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌连接酶两种。T4 DNA连接酶的底物可为：(1) 一条链带有缺口的双链DNA分子；(2) 两个存在互补粘性末端的双链DNA片段；(3) 两个存在平末端的DNA片段；(4) RNA－DNA杂合体中，具缺口的RNA和DNA分子。大肠杆菌DNA连接酶适当的底物只是带缺口的双链DNA分子和具有同源互补粘性末端的不同DNA片段，它不能催化平末端DNA分子之间的连接。用于克隆的质粒载体在酶切成线状后，一般需用碱性磷酸酯酶(CIP或BAP)进行去磷酸化处理，以防止载体自身环化，减少不含重组子的菌落产生。

把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2处理，被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。本实验所用重组DNA的载体带有E.coli中的?-半乳糖苷酶基因 (LacZ)的调控序列和部分编码序列，编码区内插入了一个多克隆位点，进入宿主菌后可与宿主细胞之间实现?-互补而产生Lac+，在生色底物X-gal存在下形成兰色菌落。如有外源DNA插入到质粒的该位点，则破坏了互补能力，菌落呈白色。

虽然大部分质粒载体都可通过蓝白色选择重组转化子，但在实际应用中往往有相当部分的白色克隆是不含插入子的。本鉴定方法是用碱性裂解液把转化子菌体裂解，然后直接用琼脂糖凝胶分离，通过比较白色和兰色转化子质粒的迁移

率，鉴定出重组转化子。

三、实验材料

质粒pBluescript II（PSK） 目的基因MP3

四、仪器设备

分光光度检测仪 电泳仪 微型电泳槽

紫外透射检测仪 恒温培养箱

五、实验用具

微量取液器 微量离心管(0.5 ml?1) 吸管头若干

点样板

六、试剂

限制性内切酶HindIII及对应的缓冲液(试剂商提供) 无菌双蒸水

10?TBE电泳缓冲液 0.8%琼脂糖 载样缓冲液

七、实验步骤

1. 酶切：按下表配制酶解混合液

缓冲液(1/10 V) DNA 加双蒸水至总体积(V) 酶(HindIII) DNA 10 ?l 4~5 ?g 100 ?l 40 U 混匀，37℃保温1.5 ~ 3小时，电泳前在4℃保存。

2. 电泳检测：取酶解液3~10 ?l电泳。

3. 切去含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶条带→称重为63mg→100mg琼脂糖对

应100 ?g溶液的BD，向离心管中加入BD63?g→60℃水浴8min,直至凝胶完全融化，期间要震荡摇匀3次→将上一步的溶液至于DNA纯化柱中，静置2min→12000rpm离心1min→加入500?gPE，12000rpm离心1min，弃滤液→加入500?gPE，12000rpm离心1min，弃滤液→12000rpm离心3min，以彻底出去纯化柱中的液体→将离心柱至于新的1.5ml的离心管中，向纯化柱的中央悬空滴加30-100?gEluent（60℃预热），静置2min，12000rpm离心1min，管底即为目的DNA片段，贮存于-20℃处保存。

4. 载体的酶切和去磷酸化处理

(1) 在离心管中加入5 ?g psk质粒 DNA，10 ?l 10? HindIII缓冲液，加双蒸水

至98 ?l，最后加入20 U HindIII酶。充分混匀，离心30秒，在37℃恒温

水浴锅保温30分钟。

(2) 加入5 ?l 1M Tris-HCl (pH9.0)，2 U CIP，充分混匀，离心30秒，在37℃

恒温水浴锅保温，60分钟。(加pH9.0的Tris-HCl缓冲液，目的是将pH7.5 ~ 8.0的酶切缓冲液的pH值调到适合CIP的pH8.5左右)。

(3) 温育结束时，加EDTA (pH 8.0)至终浓度为5 mM，混匀，于65℃加热60

分钟(或于75℃10分钟)。然后用酚/氯仿抽提两次；上清液加0.1体积3 M醋酸钠，充分混匀，再加2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后于-20℃放置15分钟。12000 rpm离心15分钟，沉淀用冷70％酒精洗一次，风干后用40 ?l TE溶解(DNA浓度约为80~100 ng/?l)。

5. 连接

在微量离心管中加入

载体DNA 1?l (80~100ng) 目的片段DNA 50-100 ng 加至8?l ddH2O 混匀，45 ~ 50℃，5分钟(使粘性末端分开）

加入10?T4 DNA连接酶缓冲液1 ?l

用1?连接酶缓冲液将连接酶稀释成0.2 Weiss单位或12 NEB单位/?l

再加入已稀释的T4 DNA连接酶1 ?l

混匀，稍离心，在PCR仪上进行连接反应

65℃，5min，置于4oC保存备用

6 . 感受态细胞的制备

挑取E.coli DH5?受体菌单菌落(2~3 mm)于有50 ml LB培养基的500-ml锥形瓶中。

37℃振荡(250rpm)培养约2.5小时(活细胞数不超过108个/ml)。

超净工作台上，倒入经消毒的50 ml离心管中，盖严。

在1L烧杯冰浴中放置10分钟，使菌液冷却至0℃。

4℃，4000 rpm离心10分钟收集菌体。

弃上清液，倒置在纸巾上1分钟。

加10 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2 ，悬浮菌体。

冰浴25分钟。

离心（4℃，4000 rpm，10分钟）。

加入1.5 ml 预冷的0.1 mol/L CaCl2，小心悬浮

4℃冰箱保存过夜(12~24小时)。

7 . 转化

在1.5 ml离心管中加入

空白对照 CK－(阴性对照) CK＋(阳性对照) 自我环化对照 处 理 感受态细ddH2O 胞 200 ?l 2 ?l 200 ?l 200 ?l 200 ?l 200 ?l 0 0 0 0 连接物 0 0 0 2 ?l(不含插入子) 2 ?l 载体质粒 0 1?l (10 ng) 0 0 重组质粒 0 0 1 ?l(10 ng) 0 0 用吸管头温和混匀

冰浴30分钟

42℃，静置90秒

冰浴2~3分钟

加入800 ?l 37℃预热的SOC液体培养基

用1000-?l取液器移至培养管，37℃摇动（200rpm）45分钟。

各取100~200 ?l涂板，将培养皿置于室温至液体被吸收。

倒置培养皿，37℃培养过夜.

观察转化结果(白色为阳性，蓝色为阴性)

8. 重组转化子的快速鉴定

用牙签从转化选择平板选取几十个白色和几个蓝色菌落，殖在LB平板上，37℃过夜。在96孔平板每孔加入20ul 10mM EDTA。用牙签挑取少量菌体(不能太多)，悬浮于各孔中(其中1~2孔是蓝色菌落作为对照)，将平板接触旋涡器几秒钟。加入20ul裂解液，将平板接触旋涡器几秒钟，静置5分钟。将等量的1M KCl和载样缓冲液混合，各孔中加入6ul，将平板接触旋涡器几秒钟。按蓝色菌落，白色菌落......最后蓝色菌落的顺序，各取20~30ul点样。电泳，观察。与蓝色菌落质粒迁移率比较，可判别白色菌落的重组质粒是否含有插入子。

9.PCR反应

(1) 模板DNA的抽提：按碱裂解法抽提得到质粒DNA。 (2) PCR操作：

PCR反应混合液的配制 （n为反应数）：

n x 2.0 ?l反应缓冲液(含15 mM MgCl2) n x 1.0 ?l dNTPs (2 mM)

n x 1.0 ?l上游引物(5 ?M) （引物在反应液中的浓度通常为0.2~0.5?M）

n x 1.0 ?l下游引物(5 ?M) n x 0.5~0.8单位Taq酶

加无菌水至总体积 n x 19 ?l

每个PCR管中加入19 ?l反应混合液，1 ?l稀释质粒DNA（约2 ng），再加2滴矿物油，防止水分蒸发。稍离心。

含有重组质粒的菌体也可直接用于PCR扩增：用牙签点取少量菌体在空的PCR管底部插几下，加入反应混合液和滴矿物油即可。注意：菌体不可太多，太多的菌体(即杂质)会抑制Taq酶的活性。

(3) PCR反应过程：94℃，1 min(预变性，可用STOP键或Pause键进行)

94℃，30 S

55℃，1 min 35个循环

72℃，2 min

72℃，5 min

(4) PCR产物的检测：取5 ?l PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，然后放在紫外检测仪下观察，记录结果。

八、实验结果与分析

1.目的片段酶切电泳检测结果

从琼脂糖凝胶电泳中可以看出酶切出的目的片段很弱，可能为以下几方面的因素：（1）抽提的目的基因的质量较差；（2）样本存在多个酶切位点，因此切出几条弱带甚至弥散；（3）目的DNA携带酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，可能干扰了限制性内切酶的活性；（4）DNA的甲基化程度对酶切的影响；（5）没有正确使用和保存酶而导致酶的活性丧失。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处；（6）注意模板用量和反应体积的关系。模板浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。

2.目的片段回收结果、体外连接、转化结果

DNA目的片段回收后体外连接，转化后结果失败，造成失败的原因是在操作的过程中杂菌的污染，与转化后的菌落竞争，导致转化后的菌落无法正常生长。

3.重组子快速鉴定结果

图1 重组子PCR电泳图

从图1可以看到电泳与中几乎看不到条带，出现这种现象的原因：（1）挑取的菌落受到杂菌的污染，其中含有DNA酶将重组DNA分解；（2）在挑取菌落时挑取的菌落太少，以及在实验过程中的操作不规范。

4.PCR反应电泳结果

图2 PCR电泳结果

从图2可以看到PCR反应的出现亮的条带（左3）

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