紫穗槐果实里天然成分的提取（本科毕业论文）

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紫穗槐Amorfrutin的提取与分析

摘要：Amorfrutin是一种具有抗癌活性的苯基类化合物，且具有一定的抗糖尿病效应。这种天然活性物质不仅具有降血糖、抗炎症的功效，还具有很好的耐受性。 Amorfrutin及其类似物还可以预防脂肪肝-一种因过量高脂营养引起的常见病，而且可被用作功能性的营养补剂或作为为患者量身定制的温和性治疗药物成分。Amorfrutin最早发现于原产于北美的甘草及紫穗槐果实里，而对于国内紫穗槐是否也含有这种天然产物，则需要进一步研究。本实验对国内引进栽培的紫穗槐的果实里是否含有Amorfrutin这种物质进行了探究。根据文献调研，采取溶剂萃取法，用无水乙醇对紫穗槐果实中的化学物质进行提取后，通过液相质谱联用法对萃取液成分进行分析鉴定，得到提取物的质谱图，证实了提取物中确实含有Amorfrutin。然后改变实验条件及提取工艺，先将紫穗槐果实用5%的盐酸和氯仿进行萃取，再经石油醚和甲醇萃取，经液相质谱联用分析，在甲醇相中得到了Amorfrutin的谱图。最后再将两次不同结果图谱的质荷比和相对丰度进行对比，证实对比实验中经萃取处理后的紫穗槐果实中提取到更多的Amorfrutin，初步找到提取紫穗槐果实里Amorfrutin最优工艺。

关键词：天然产物；紫穗槐；萃取；Amorfrutin；糖尿病

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The extraction and analyses of Amofrutin from Amorpha

fruticosa

Abstract: Amorfrutin as an anti-cancer activity of phenyl compound, has a certain anti-diabetic effects. According the world latest discovery, this natural active substance with hypoglycemic, anti-inflammatory effect, also has good resistance effect at the same time. Amorfrutin and its analogues can also prevent fatty liver, a common disease caused by the excessive of fat nutrition. And it can also be used as functional nutritional supplements or a mild treatment to the patients. The natural substance Amorfrutin was first discovered in the plant of licorice, and then in the seed of Amopha fruticosa with its effect of ant-diabetic. But it still need further study to make sure whether the domestic Amorpha has the Amorfrutin or not. In this paper, we studied this issue. We use the solvent extraction in the anhydrous ethanol to extract Amorfrutin from the seed of Amorpha, and then washed with hydrochloric (5%) acid and methanol. By using liquid phase chromatography to appraise the Amorpha, we find it contains Amorfrutin in the solution after ethanol extraction. After comparing different extraction techniques and the mass change ratio, relative abundance, we initially get the method of extraction Amorfrutin from the Amorpha.

Key words: natural products, Amopha fruticosa, extraction, Amorfrutin，diabetes mellitus

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目 录

第1章 绪 论 .................................................................................................................... 1 1.1 研究背景 ....................................................................................................................... 2 1.1.1 紫穗槐果实中化学成分的研究 .......................................................................... 3 1.1.2 天然活性物质提取方法 ...................................................................................... 3 1.2 物质鉴定及分析方法 ................................................................................................... 5 1.2.1 液质联用法 .......................................................................................................... 5 1.2.2 硅胶层析法 .......................................................................................................... 6 1.2.3 液相色谱法 .......................................................................................................... 7 1.3 紫穗槐果实的化学成分和Amofrutin的研究现状 ...................................................... 9 1.4 实验目的和意义 ......................................................................................................... 10 第2章 紫穗槐果实里Amorfrutin的提取 ...................................................................... 11 2.1 实验仪器装置和试剂 ................................................................................................. 11 2.1.1 实验仪器 ............................................................................................................. 11 2.1.2 实验装置 ............................................................................................................. 11 2.2 实验试剂 .................................................................................... 错误！未定义书签。 2.3 实验原理 ..................................................................................................................... 12 第3章 结果与讨论 .............................................................................................................. 1

3.1 方案一结果....................................................................................................................... 2 3.2 方案二结果....................................................................................................................... 3 3.3 方案三结果....................................................................................................................... 3 3.4 讨论 ................................................................................................................................. 5

第4章 结论 ...................................................................................................................... 12 致谢 ...................................................................................................................................... 25 参考文献 .............................................................................................................................. 26

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第1章 绪 论

1.1 研究背景

紫穗槐为豆科紫穗槐属多年生落叶灌木。在世界范围内具有广泛的分布。紫穗槐属植物全世界约25种，原产北美，我国引入栽培的只有紫穗槐一种，南北均有栽植?，紫穗槐在我国又称绵槐、油条、椒条、穗花槐、紫翠槐、苕条。临床上单方应用，“治烧烫伤，痈疮，湿疹”。 多年生豆科落叶小乔木, 原产北美洲， 多作为水土保持树种, 其枝条可用于编织，叶子可作绿肥，其根、茎、叶可作药用。其挥发油是一种理想的天然香料，具有止痒驱蚊的功能，紫槐的这些重要用途，已经引起人们的广泛关注，近几年来国内已经开始有紫穗槐种子为原料的产品生产 。

之前国内外的科学家对紫穗槐果实里的化学成分进行研究，发现紫穗槐果实里含有丰富的有机化合物，主要为黄酮类化合物以及一些挥发油的成分。有医学研究发现，紫穗槐果实里的黄酮类化合物具有一定的抗癌活性。

天然产物活性成分(功能因子)具有特定的功效[15]。通过体内外试验和临床验证证明了它们具有抗氧化、抗衰老、抗菌消炎、抗癌、提高免疫力、降血脂、降血压、降血糖等功效。目前，国内外对天然产物活性物质进行了全方位和多领域的研究，研究其原料及原料的栽培和培养技术，以期获得高含量活性成分的原料，研究天然产物的提取分离制备技术、活性物质的构成与结构、功效和机理等，方兴未艾。研究的主要目的和实际的应用在于开发生产功能保健食品、添加剂或药品。天然产物的提取分离制备技术，传统方法主要是溶剂萃取，如热水浸提、碱液提取和醇类提取等。其它溶剂的考察主要集中在如丙酮、乙酸乙酯、乙醚、苯 氯仿、正丁醇等有机溶剂对活性物质的提取上。近年来，人们在传统方法的基础上采用了微波、超声波物理助提技术和酶分解等生物技术来提高提取率。

大多数活性物质的粗提物中活性物质含量偏低，为了得到高含量和高纯度的产品必须进行精制，根据天然产物的性质常用精制方法有：沉淀剂法、层析技术、超临界C02萃取技术、膜分离技术。层析技术，包括吸附层析法、柱层析法、薄层层析法(TLC)、纸层析法、气一液层析法、升华法和高效液相层析法(HPLC)等。工业化生产中常用的是柱层析，常见的吸附剂有：硅胶、硅藻主、氧化镁、氧化铝、纤维素、聚酰胺、分子筛

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和离子交换树脂等，应用广泛的主要为聚酰胺，大孔树脂等吸附剂。超临界C02萃取技术，超临界流体C02是萃取小分子、低极性、亲脂性物质的理想溶剂。超临界流体萃取技术与传统提取方法相比具有萃取时间短、效率高、高选择性提取、工艺流程简化、低温操作、适于对热敏性物质提取、无溶剂残留、安全无毒、可实现有效成分的快速、准确分析等优点。膜分离技术，用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法。对于提取的活性物质，尤其是未知结构的物质要进行鉴定，主要方法有：纸色一紫外及可见光谱分析；高效液相色谱(HPLC)一质谱分析(MS)；核磁共振波谱法(NMR)；X一衍射法等。 1.1.1 紫穗槐果实里化学成分的研究

Amorfrutin先后被发现于甘草及紫穗槐的果实的提取物中，其具有很好的抗炎效果，并在后期的实验中在小鼠身上进行了实验验证[9]。科学家们对甘草的研究提取也验证了其具有抗糖尿病效应，不仅可以降低血糖，还能抗炎，且耐受性极好。此外，Amorfrutin及其类似物还可以预防脂肪肝－一种因过量高脂营养引起的常见病。紫穗槐果实中的Amorfrutin提取物有如此重要的功效，对其研究势在必行，而可能在提取方法等方面的技术不成熟，可能引起提取的化合物不纯或者提取量不多，这个时候，如果能在实验室人工合成Amorfrutin，通过不断实验来验证能否得到较高产率的物质，则可选取相应的方法来进行大规模的投入生产。

Amorfrutin可被用作功能性的营养补剂或作为为患者量身定制的温和性治疗[8]。鉴于糖尿病等代谢性疾病的迅速蔓延，我们的目的是进一步开发这些物质以在未来用于人体。为了这一目标，研究人员必须在对糖尿病患者的临床研究中检测这些物质和植物Amorfrutin提取物的效应。

目前国内外实验室对紫穗槐果实里的化学成分进行多种研究。有研究用活性跟踪法从紫穗槐叶中分离出有效混合物,经薄层制备,分离出4种化合物纯品。经鉴定分别为-脱氢-灰叶酚；脱氢-鱼藤素-灰叶素；脱氢-灰叶酚。对大皱鳃金龟甲的试验表明,这些化合物中的任何一种,单独给药时,均不具有明显的杀虫效果,但以一定的比例混合后用药, 则表现出理想的杀虫效果，可能是协同作用的结果[15]。

采用GC—MS对紫穗槐果实中挥发油成分进行分析的方法：用挥发油提取器对紫穗槐果实中的挥发油进行了提取和测定。采用30m X0.25lnln弹性石英毛细管柱，ND检测器，结合GC-MS，对挥发油进行了分析。得到结论是：紫穗槐果实挥发油含量是2．1％，从中分离出30个化合物，鉴定了其中的26个成分，并测定了相对含量，其主要成分为大

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牦牛儿烯(11.40％)、13一蒎烯(5.85％)、蒈烯一3(3．02％)、古巴烯(5.84％)、石竹烯(8.40％)、奥(4.49％)、D一伪一旺雪松烯(4.53％)、l，3，3一三甲基一[2,2,1.02,6]三环已烷(13.63％)[26]。

1.1.2 天然产物提取工艺与方法

近年来，随着人们对天然产物的药用和营养价值认识的逐步深入，世界范围内掀起了天然产物中活性成分研究的热潮，国家自然科学基金资助项目中就有多项是关于此课题的研究，然而天然产物的成分十分复杂且有些物质含量甚微， 提取时又要求活性成分不能被破坏，溶剂萃取等传统提取方法已远远不能满足对天然产物进行深入研究的需要。如何快速，有效地将活性成分提取出来以及对提取物的进一步分离纯化已成为天然产物研究的瓶颈,特别是近年来人们环保意识的迅速提高和国家可持续发展战略的施行，更使得开发新的天然产物提取技术成为大势所趋。目前，科学工作者在对传统方法进一步改善的同时，又发展出了多种新的提取技术[7]。

对天然产物中活性成分进行提取，最常用的是溶剂萃取法，所用溶剂包括水和有机溶剂，水能够溶出的成分较多，导致后处理困难，有机溶剂分亲水性和亲脂性两种，选择性好，但挥发性大且一般有毒，提取方法主要有浸渍、渗漉、煎煮、回流和连续提取，浸渍和渗漉简单易行。一般在常温或温热条件下操作适于热不稳定成分的提取但溶剂消耗量大、费时长、提取效果差。水煎煮法是我国最早使用的传统方法，大部分成分可被不同程度的煎出但具有挥发性以及遇热易破坏的成分不宜用此法。用易挥发的有机溶剂加热提取则需采用回流法。为了弥补回流提取中溶剂消耗量大，操作麻烦的不足，可采用连续提取，又称索氏提取法。这是溶剂萃取中最常使用的方法，提取效率较高但提取液受热时间长，热不稳定成分易分解[42]。

近来发展的自动索氏提取将高温渗漉与常规索氏提取相结合。溶剂用量比常规索氏提取少一半，且所需时间大幅度缩短。

水蒸气蒸馏也是一种常用的提取方法。被提取的成分应具备以下条件，具有挥发性、沸腾期间与水长时间共存而不发生化学变化、难溶或不溶于水。显而易见上述传统方法具有许多缺点:

1.大量使用有机溶剂产生的废液废渣严重污染环境且不可避免的溶剂残留会影响产物的质量和稳定性。

2.提取效率低，步骤多，选择性差，较难实现自动化或联用提取。

3.温度高，时间长,。使得能耗大且易造成热敏性成分分解和挥发性成分损失。因

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此，发展快速、高效、尽量不用或少用有害试剂、将环境污染减到最低限度的绿色样品处理技术已成为该领域科学工作者追求的目标。

超临界流体萃取法是近二、三十年来迅速发展起来的一项新技术[42]。目前，在我国主要用于天然产物中有效成分的提取。超临界流体是指处于临界温度和临界压力以上的既非气态又非液态的物质，它兼有液体和气体的优点。其密度与液体接近，而密度与溶解能力基本成正比，所以它和液体一样，很容易溶解其它物质。同时，它的粘度和表面张力很小，只是略高于气体。这使得溶质在其中的扩散系数要比在液体中大得多，在临界点附近超临界流体的温度和压力发生微小变化即可导致溶质的溶解度发生几个数量级的变化。根据这一特性9可通过控制体系的温度和压力，使各种待萃取组分按它们在超临界流体中的溶解度大小先后提取出来。并得到初步分离最常用的超临界流体。它的化学性质不活泼、无毒无味、价格适中且具有较低的临界温度和临界压力，是萃取小分子、低极性、亲脂性物质的理想溶剂。但对于糖苷，多萜等极性或大分子化合物则显得无能为力。加入极性改性剂可使CO2的溶解性和选择性得以改善。但如何将超临界流体萃取的应用范围扩大到极性甚至离子型物质仍是该技术今后发展的重要方向之一[42]。

在对紫穗槐果实里化学成分进行提取和分离时，一般采用硅胶柱层析，高速逆流色谱法等方法对紫穗槐种子的乙酸乙酯提取物进行分离，并对提取化合物进行杀菌活性测定。有研究结果是从紫穗槐种子的乙酸乙酯提取物中分离得到7个化合物．分别为5-羟基-7,4-二甲氧基异黄酮、2-羟基-4，4-二甲氧基查耳酮、4一二甲氧基异黄酮、鱼藤酮、2一羟基灰叶素、异灰毛豆酚、异灰叶素。其中鱼藤酮、11一羟基灰叶素、异灰毛豆酚、异灰叶素对黄瓜霜霉活性较好。 发现紫穗槐内大多数黄酮类化合物为抗菌性化合物。

超声波辅助乙醇溶液浸提法和索氏提取法提取新疆地方植物药材紫穗槐中黄酮化合物并进行含量测定。以芦丁为对照品，NaNO2-Al(NO3)3-Na0H体系为显色剂，利用分光光度法在510nm处测定提取物中的总黄酮的含量。校准曲线为A=11．825C-0.0139。r=0.9992。超声提取法所得总黄酮的含量以芦丁计算为2．3562％，索氏提取法所得总黄酮的含量以芦丁计算为2．6375％．平均回收率分别为102．16％和96．53％。索氏提取法的提取优于超声波辅助乙醇浸提法，该法简单、准确，可用于新疆紫穗槐果实总黄酮的测定。

在研究紫罗兰花辩类黄酮化合物的最佳提取工艺时。有方法是采用颜色反应法和紫外一可见光谱法分析紫罗兰白色品种“艾达”(Aida)、红色品种“弗朗西丝克”(Francesco)的花瓣色素，并采用单因素试验和正交试验确定2种颜色紫罗兰花瓣类黄酮化合物的最

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佳提取工艺。 在对紫穗槐进行提取工艺的优化时，就和紫罗兰花瓣的提取有不同之处。先硅胶层析，在通过高速逆流色谱法对层析后的粗组分进行色谱法分离。

1.2 天然活性产物的分析方法

目前国际过内对于从植物等中提取分离的天然活性产物分析方法主要有液质联用法、硅胶层析法、和液相色谱法等，其中液相色谱法又包括固液吸附色谱法、液液分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法、离子色谱法等。 1.2.1 液质联用法

液质联用（HPLC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。

液相色谱－质谱联用仪是以液相色谱为进样分离系统并通过一定的接口与质谱仪耦合到仪器的分析仪器。样品经过色谱分离后经离子源离子化产生带有一定电荷、质量数的离子，采用不同的质量分析器把电离子按质荷比（m/z）分开,得到依质量顺序排列的质谱图。通过对质谱图的分析处理，进行定性、定量分析。液相色谱－质谱联用仪主要由液相色谱、离子源、质量分析器、检测器、真空系统和计算机等几部分组成。

色谱的优势在于分离，为混合物的分离提供了最有效的选择，但其难以得到物质的结构信息，主要依靠与标准物对比来判断未知物，对无紫外吸收化合物的检测还要通过其它途径进行分析。质谱能够提供物质的结构信息，用样量也非常少，但其分析的样品需要进行纯化，具有一定的纯度之后才可以直接进行分析。因此，人们期望将色谱与质谱联接起来使用以弥补这两种仪器各自的缺点。

据统计，已知化合物中约80%的化合物是亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物的分析不适宜用气相色谱分析，只能依靠液相色谱。如果能成功地将液相与质谱联接使用，这一技术将在生物、医药、化工和环境等领域大有应用前景。为达到这一目的需要一个起―接口‖作用的装置将液相与质谱联接起来。

这个接口要解决三个主要的问题：

（1）液相色谱中使用的流速较大，而质谱需要一个高真空环境工作； （2）要从流动相中提供足够的离子供质谱分析；

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（3）去除流动相中杂质对质谱可能造成的污染。

近年来，液相色谱-质谱联用在技术及应用方面取得了很大进展，在环境、医药研究的各领域应用越来越广泛，且随着现代化高新技术的不断发展及液相色谱质谱联用技术自身的优点，液相色谱质谱联用技术必将在未来几年不断发展且发挥越来越重要的作用。

HPLC-MS除了可以分析气相色谱-质谱（GC-MS）所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性的化合物之外，还具有以下几个方面的优点：

①分析范围广，MS几乎可以检测所有的化合物，比较容易地解决了分析热不稳定化合物的难题；

②分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过MS的特征离子质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量；

③定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息； ④检测限低，MS具备高灵敏度，通过选择离子检测（SIM）方式，其检测能力还可以提高一个数量级以上；

⑤分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果；

⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。

1.2.2 硅胶层析法

硅胶层析是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使物质分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。硅胶层析主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯， 硅胶柱层析惯用方法为：

（1）称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。 （2）搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。

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（3）装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。

（4）压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

（5）上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。 （6）过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡，太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。例如：10mg试样量，1g硅胶H，0.5ml馏分；1~2g试样量，50g硅胶（200-300），20-50ml馏分。

(7）检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。

（8）送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的―硅胶‖峰。 1.2.3 液相色谱法

液相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。

当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析，此缺点可高效液相色谱法来克服。

液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效（又称高压）液相色谱法： 液固吸附色谱

(1)高效液相色谱中的一种，是基于物质吸附作用的不同而实现分离。其固定相是一些具有吸附活性的物质如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

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(2）液液分配色谱法

基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，通过溶质在两相之间进行分配以实现分离。根据固定相与流动相的极性不同，分为正相色谱和反相色谱。前者是用硅胶或极性键合相为固定相，非极性溶剂为流动相；后者是硅胶为基质的烷基键合相为固定相，极性溶剂为流动相，适用于非极性化合物的分离。 （3）离子交换色谱法

基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对离子交换基具有不同的亲和力而实现分离。薄壳型离子交换树脂柱效高，主要用来分离简单的混合物；多孔性树脂进样容量大，主要用来分离复杂混合物。 （4）凝胶渗透色谱法

又称为尺寸排阻色谱法 。1959年首先用于生物化学领域。以溶剂为流动相，多孔填料（如多孔硅胶、多孔玻璃）或多孔交联高分子凝胶为分离介质的液相色谱法。当混合物溶液入凝胶色谱柱后，流经多孔凝胶时，体积比多孔凝胶孔隙大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而从凝胶颗粒间隙中流过，较早地被冲洗出柱外，而小分子可渗透到凝胶孔隙里面去，较晚地被冲洗出来，混合物经过凝胶色谱柱后就按其分子大小顺序先后由柱中流出达到分离的目的。用凝胶渗透色谱的优点是：分离不需要梯度冲洗装置 ；同样大小的柱能接受比通常液相色谱大得多的试样量；试样在柱中稀释少，因而容易检测；组分的保留时间可提供分子尺寸信息；色谱柱寿命长。它的缺点是：不能分离分子尺寸相同的混合物，色谱柱的分离度低；峰容量小；可能有其他保留机理起作用时引起干扰。凝胶渗透色谱法为测定高聚物分子量和分子量分布提供了一个有效的方法，此外还可用来分离齐聚物、单体和聚合物添加剂等。 （5）离子色谱法

采用柱色谱技术的一种高效液相色谱法，样品展开方式采用洗脱法。根据不同的分离方式，离子色谱可以分为高效离子色谱 、离子排斥色谱和流动相离子色谱3类。高效离子色谱法使用低容量的离子交换树脂，分离机理主要是离子交换。离子排斥色谱法用高容量的树脂，分离机理主要是利用离子排斥原理。流动相离子色谱用不含离子交换基团的多孔树脂，分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。

离子色谱仪由淋洗液贮存器 、泵 、进样阀 、分离柱 、抑制柱、电导检导器和数据处理单元等组成。离子色谱仪最重要的部件是分离柱，装有离子交换树脂。抑制柱是抑制型离子色谱仪的关键部件，其作用是将淋洗液转变成低电导部分，以降低来自淋洗液

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的背景电导，同时将样品离子转变成其相应的酸或碱，以增加其电导。分离阴离子，抑制柱填充强酸性阳离子交换树脂；分离阳离子，抑制柱填充强碱性阴离子交换树脂。检测器分通用型检测器与专用型检测器。前者如电导检测器，对检测池中所有离子都有响应；后者如紫外-可见分光光度计，对离子具有选择性响应。

1.3 紫穗槐果实化学成分和Amorfrutin的研究现状

紫穗槐原产于美国、加拿大和墨西哥。这种新的抗糖尿病物质因此被命名为Amorfrutin。研究人员利用糖尿病小鼠证实Amorfrutin不仅具有降低血糖的特性，还具有抗炎效应。此外，它们还可以预防脂肪肝-一种因过量高脂营养引起的常见病[40]。科学家们发现紫穗槐果实等物质里所含有的天然活性物质具有简单的化学结构。

研究证实，经过硅胶柱层析、薄层制备色谱、高效制备色谱等分离手段，从紫穗槐果实的石油醚和醋酸乙酯提取物中分离得到15个单体化合物。利用理化性质和波谱学方法，鉴定了其中的12个化合物的化学结构，包括1个芪类化合物，9个黄酮类化合物，1个三萜类化合物和1个高级脂肪醇。分别为3,5-二羟基-4-牻牛儿基联苄(1)、5,7-二羟基-8-牻牛儿基双氢黄酮(2)、6a,12a-去氢鱼藤素(3)、6a,12a-去氢-α-毒灰叶酚(4)、灰叶素(5)、去氢色蒙酮(6)、7,4-二甲氧基异黄酮(7)、5-羟基-7,4-二甲氧基异黄酮(8)、7，2，4，5-四甲氧基异黄酮(9)、2-羟基-4，4-二甲氧基查耳酮(10)、β-谷甾醇(11)、正三十碳醇(12)。其中化合物6为一个新的天然产物，化合物1为首次从豆科植物中分离得到的已知化合物，化合物8、10、11、12为首次从紫穗槐属中分离得到的已知化合物，化合物2、3、4、5、7、9为首次从中国产的紫穗槐果实中分离得到的已知化合物。研究人员利用糖尿病小鼠证实Amorfrutins不仅具有降低血糖的特性，还具有抗炎效应。此外，它们还可以预防脂肪肝-一种因过量高脂营养引起的常见病[41]。

沈阳化工研究院焦娇等研究员从植物形态、果实性状、显微特征、化学成分等方面对紫穗槐果实进行了生药学研究。通过硅胶柱层析、薄层制备色谱、高效制备色谱等分离手段，从紫穗槐果实的石油醚和醋酸乙酯提取物中分离得到15个单体化合物。利用理化性质和波谱学方法，鉴定了其中的12个化合物的化学结构，包括1个芪类化合物，9个黄酮类化合物，1个三萜类化合物和1个高级脂肪醇。分别为3,5-二羟基-4-牻牛儿基联苄(1)、5,7-二羟基-8-牻牛儿基双氢黄酮(2)、6a;12a-去氢鱼藤素(3)、6a,12a-去氢-α-毒灰叶酚(4)、灰叶素(5)、去氢色蒙酮(6)、7,4-二甲氧基异黄酮(7)、5-羟基-7,4-二甲氧基异黄酮(8)，2,4,5-四甲氧基异黄酮(9)、2-羟基-4，4-二甲氧基查耳酮(10)、β-谷甾醇(11)、正三十碳醇(12)。其中化合物6为一个新的天然产物，化合物1为首次从豆科植物中分

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离得到的已知化合物，化合物8、10、11、12为首次从紫穗槐属中分离得到的已知化合物，化合物2、3、4、5、7、9为首次从中国产的紫穗槐果实中分离得到的已知化合物[10]。

1.4 实验目的和意义

对于原产于美国的甘草和紫穗槐果实中含有的Amorfrutin的抗性研究对医学有巨大的意义，如果证实了紫穗槐的果实中确实含有Amorfrutin且能通过实验找到最优的提取分离方法，那将具有不可估量的价值。

本实验主要目的就是分离鉴定紫穗槐果实里是否含有Amorfrutin，然后优化鉴定和提取工艺。由于Amorfrutin有着抗癌、抗菌等药物活性，所以对Amorfrutin的提取对研研究发明新的药物便有了实际的意义。因此，就需要我们通过实验找到可行的提取方法，完善提取工艺，以便从国内栽培的紫穗槐果实里得到更多更纯的Amorfrutin，继而得到高产率的Amorfrutin，最终希望能将研究结果投入生产，获得大量高效的Amorfrutin抗性药物，

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第2章 紫穗槐果实里Amorfrutin的提取

2.1 实验仪器装置和试剂

2.1.1 实验仪器

实验所用仪器见表2-1，

表2-1主要仪器一览表 序 号 1 2 3 4 5 6 名 称 恒温磁力搅拌器 循环水式多用真空泵 旋转蒸发器 恒温水浴锅 帕斯帝卡超纯水机 液相色谱质质谱联用仪 型号 85-2B SHZ-D(Ⅲ) RE52CS W-O PSDK-30-D LCMS-2010EV 备 注 金坛市医疗仪器厂 郑州博科仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 巩义市予华仪器有限责任公司 北京子涵世纪科技有限公司 SHIMADZU/岛津仪器有限公司 2.1.2 实验装置 图2-1 提取紫穗槐果实里的Amorfrutin装置图 12

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2.2 实验试剂

表2-2 主要试剂一览表

序 号 1 2 3 4 5 6 名 称 紫穗槐种子 乙二醇二甲醚 乙酸乙酯 石油醚(60~90℃) 碳酸氢钠 无水硫酸钠 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 级别 生产厂家 太平洋紫穗槐培育中心 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 2.3 实验原理 本实验采用溶剂萃取法对紫穗槐果实里的Amorfrutin进行提取。采取的溶剂是无水乙醇，由于乙醇的挥发性比较大，因此采用水浴加热回流。根据溶剂的互不相溶的性质，对分层后的含Amorfrutin的组分进行后处理，用液相质谱联用法对提取液里的成分进行鉴定。

为优化提取工艺，此实验分为三个方案进行对比实验。分别为用没有粉碎过的紫穗槐种子，和粉碎过的紫穗槐种子来进行提取实验。以及采用不同的萃取溶剂，分别对其提取后的产物的大致的量的比较，以得出紫穗槐果实里Amorfrutin提取的最佳工艺。

2.4 实验步骤

方案一：称取500g紫穗槐种子（种子为颗粒未经粉碎），与1000ml乙醇混合于三口烧瓶里，按如图2-1的装置图，在搅拌的条件下水浴83摄氏度加热并搅拌48小时（过程中需定时的向水浴锅中填充水，防止水浴锅因干涸而影响提取温度）。

冷却到室温后，用真空旋转蒸发仪进行抽滤，得到乙醇提取物。然后真空旋转蒸发浓缩，得到深红色粘稠液体（在旋蒸的过程中要注意防止爆沸，加入的提取液不能超过圆底烧瓶的一半），静置与烧瓶中，用封口胶封好以防止溶液挥发。并将乙醇回收利用。对得到的深红色粘稠液体再进行液相——质谱连用分析，观察进样前和进样后的质荷比和相对丰度的变化，并做好记录以备分析。流程图如图2-3：

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图2-3 方案一流程图

方案二：取2000g紫穗槐种子，粉碎后烘干。称取500g紫穗槐种子粉末（其余留下备用），与1000ml乙醇混合于三口烧瓶里，按图2-1的装置进行水浴83摄氏度加热，搅拌48小时。

冷却到室温后，用真空旋转蒸发仪进行抽滤，得到乙醇提取物。然后真空旋转蒸发浓缩，得到深红色粘稠液体（在旋蒸的过程中要注意防止爆沸，加入的提取液不能超过圆底烧瓶的一半），静置与烧瓶中，用封口胶封好以防止溶液挥发。并将乙醇回收利用。对得到的深红色粘稠液体再进行液相——质谱连用分析，观察进样前和进样后的质荷比和相对丰度的变化，并做好记录以备分析。如流程图2-4：

图2-4 方案二流程图

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方案三：称取粉碎过的500g紫穗槐种子粉末，与1000 ml乙醇混合于三口烧瓶里，按图2-1的装置图，水浴83摄氏度加热，反应48小时（此方案未进行搅拌）。

冷却到室温，抽滤，得到乙醇提取物，然后真空旋转蒸发浓缩，后得到深红色粘稠液体（在旋蒸的过程中要注意防止爆沸，加入的提取液不能超过圆底烧瓶的一半），并将乙醇回收利用。

将旋转蒸发后的粘稠液体浓缩后分配于5%的盐酸（HCL）和氯仿（CHCl3 ）溶液，分液漏斗萃取出氯仿层，经无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，抽滤，经旋转蒸发仪蒸出一定量的氯仿，回收利用（氯仿为毒性有机物在萃取以及旋蒸的过程中要注意自我保护不要大量吸入），得到暗色具有生物活性的油状液体。将此油状液体分配于90%的甲醇和石油醚的混合溶液中。用封口胶封好以防止溶液挥发。对得到甲醇相进行液相——质谱连用分析，观察进样前和进样后的质荷比和相对丰度的变化，并做好记录以备分析。流程图如图2-5。

图2-5 方案三流程图

液相质谱联用仪测定过程：

（1）开空气泵、液相色谱和质谱仪电源开关，开PC、机后使其联机成功，之后打开真

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空泵阀门。

（2）真空度达到2╳10-5 Pa后，通过调谐系统检查质谱运行情况。

(3)定液相色谱和质谱参数: 选择合适的色谱柱、流动相，设置梯度程序及柱温。选择离子源模式，设置质谱参数。数据采集的范围及条件设置。

(4)按设定的色谱条件运行一遍空程序以检查基线和本底，若发现柱子不干净则应冲洗柱子和质谱仪，直至基线平稳无峰为止。

(5)PC机上运行设置好的程序。待工作站显示仪器状态为“Ready”时，设置样品信息，进样。按“Start”键，PC机自动采集数据。

(6)运行好样品后，冲洗色谱柱，流动相中如含有挥发性缓冲盐，用5甲醇冲洗排出流路中可能有的缓冲液。

(7)放真空，再关液相色谱、质谱和PC机电源。

(8)调出谱图，根据定性及定量分析的需要，分别打开离子色谱图和质谱图，进行分析。

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第3章 结果与讨论

对紫穗槐果实中化合物提取的研究，方案一为直接将购进的紫穗槐果实加乙醇溶剂进行萃取；方案二为物理对照实验，将紫穗槐果实经粉碎处理后做相同的乙醇萃取处理；方案三再改变萃取条件，对粉碎处理的紫穗槐果实用5%的盐酸和氯仿萃取，再用甲醇萃取处理，最后对比三种提取方法处理下得到的提取物成分及产量，得到结论如下：

3.1 为粉碎的紫穗槐果实的乙醇萃取结果

方案一得到如图3-1、3-2的液相质谱图：

图3-1未粉碎紫穗槐果实提取物的乙醇溶液液相谱图（48h）

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图3-2未粉碎紫穗槐提取物的乙醇溶液质谱图（48h）

图3-1紫穗槐提取物的乙醇溶液（48h）为以甲醇为流动相，ESI源的液相色谱图，由于使用甲醇为流动相，甲醇极性很大，在很短时间内把紫穗槐提取物的乙醇溶液中大部分的有机成分都洗脱出来，由此可得一个总量的大峰，第一幅图为洗脱出的总的成分的量为红色曲线；第二幅图为在相同的时间进度下，Amorfrutin的量的曲线图，通过对比可以看出在总的乙醇所含成的中，Amorfrutin所占的比重可达70~80%。第二幅图中的相对分子质量339为Amorfrutin的碳的同位素的化合物。

从图3-2紫穗槐提取物的乙醇溶液质谱图（48h）可以看出，由原来未进样前的质荷比(m/z)为：301.0，310.9，313.0，319.7，350.1，369.0，变为图上的309.0，315.1，326.1，339.0，341.1，342.1，在所测样进入色谱仪中之后，大约半分钟内质荷比为质荷比(m/z)为339.0以及质荷比340的峰逐渐增高，之后的一段时间内340的相对丰度与其他峰的比值接近10:1。其中质荷比(m/z)为339.0为Amorfrutin裂解掉一个H自由基所得质荷比，340为Amorfrutin未裂解的质荷比，两者的相对丰度与其他峰比较相差巨大，有力的证明了在我们本土生长的紫穗槐种子中，含有一定量的Amorfrutin，而具体的 Amorfrutin A、Amorfrutin B的分类则有待进一步实验的分析。

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3.2 粉碎处理的紫穗槐果实的乙醇萃取结果

方案二得到如图3-3、3-4的液相质谱图：

图3-3粉碎紫穗槐提取物的乙醇溶液液相谱图(48h)

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图3-4粉碎紫穗槐提取物的乙醇溶液质谱图（48h）

图3-3紫穗槐提取物的乙醇溶液（48h）为以甲醇为流动相，ESI源的液相色谱图，由于使用甲醇为流动相，甲醇极性很大，在很短时间内把紫穗槐提取物的乙醇溶液中大部分的有机成分都洗脱出来，由此可得一个总量的大峰，第一幅图为洗脱出的总的成分的量为红色曲线；在相同反应量以及相同反应条件的情况下，由图3-3的液相色谱图可以看出最高峰值要比未粉碎的种子提取物高10 G Counts，可以说明种子经过粉碎之后提取效果明显好于未粉碎的。

从图3-4紫穗槐提取物的乙醇溶液质谱图（48h）可以看出，由原来未进样前的质荷比(m/z)为：301.0，313.0，310.9，319.0，324.0，339.0，350.1，369.0（其中339.0为上一个样中残留的待测物的峰值）逐渐变为339.0、350.1直到最后完全为质荷比(m/z)为339.0，340.0的峰，图2-5可以看出以质荷比(m/z)为339.0与其他峰相比相对丰度比值接近10：1，有力的证明了在我们本土生长的紫穗槐种子中，含有一定量的Amorfrutin。

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3.3 粉碎处理的紫穗槐果实甲醇萃取结果

由方案三得到3-5和3-6的质谱图： 方案三得到3-5和3-6两个质谱图。 图3-5 粉碎紫穗槐提取物的甲醇溶液液相谱图(48h)

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图3-6粉碎紫穗槐提取物的甲醇溶液质谱图（48h）

图3-5粉碎后的紫穗槐种子提取物的甲醇溶液（48h）是以甲醇为流动相，ESI源的液相色谱图，由于使用甲醇为流动相，甲醇极性很大，在很短时间内把紫穗槐提取物的甲溶液中大部分的有机成分都洗脱出来，由此可得一个总量的大峰，第一幅图为洗脱出的总的成分的量为红色曲线；第二幅图为在相同的时间进度下，Amorfrutin的量的曲线图，通过对比可以看出在总的甲醇中所含成的Amorfrutin所占的比重约60~70%，由此可知在甲醇的萃取液中含有大多数的Amorfrutin，证明萃取步骤正确活性物质在甲醇相。

从图3-6粉碎后的紫穗槐种子提取物的乙醇溶液质谱图（48h）可以看出，由原来未进样前的质荷比(m/z)：301.0、311.0、313.0、339.0、350.1、369.0（其中339.0为上一个样中残留的待测物的峰值）变为图上的324.1、338.2、339.0、340.0、363.1，在所测样进入色谱仪中之后，大约半分钟内质荷比为339.0以及质荷比340的峰逐渐增高，之后的一段时间内质荷比(m/z)为339的相对丰度与其他峰的比值接近20:1。其中339.0为Amorfrutin裂解掉一个H自由基所得质荷比，质荷比(m/z)为340为Amorfrutin未裂解的质荷比，两者的相对丰度与其他峰比较相差巨大，有力的证明了在萃取后的甲醇溶液中，含有一定量的Amorfrutin，由此证明萃取方法的正确性，而具体的 Amorfrutin A、Amorfrutin B的分类则有待进一步实验的分析。

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而对于甲醇萃取液的进一步处理，在本文中没有提及。下一阶段的具体实验将对甲醇萃取液进行进一步处理。将甲醇提取液旋转蒸发蒸出一定量的甲醇，控制剩余溶液的量，以便过硅胶柱。通过过柱分出含有Amorfrutin范围的几个点，在进一步过柱洗脱出Amorfrutin，但目前存在一个问题我们没有Amorfrutin纯产品，所以无法对紫穗槐种子中Amorfrutin的含量进行定量分析，过柱分离也存在一定难度（因无法对其极性进行判断，导致薄层色谱分析无法确定产物），现在一方面寻求得到Amorfrutin纯品，另一方面对其洗脱出的各种物质进行鉴定，来判断何种产物为Amorfrutin。

3.4 总结

通过以上三步不同条件下的实验以及实验结果分析，可以初步确定紫穗槐种子里含有Amorfrutin并且其含量远大于前期预测值。通过第一步和第二步进行比较可以发现，经过粉碎后的紫穗槐种子提取出来的目标产物要多于未粉碎过的紫穗槐种子。由于粉碎后的紫穗槐种子粉末在烧瓶里颗粒较小，粘性比较大，导致不易搅拌，而且影响到实验装置的气密性，导致乙醇的大量挥发。为解决此问题，在第三步实验里面通过采用不搅拌进行对比实验，提取紫穗槐种子里的Amorfrutin。由图3-5和图3-6里面产物的相对丰度可以看出，不搅拌和搅拌的反应结果提取物产量相差不大，且Amorfrutin大多数存在于甲醇相中，对紫穗槐种子中Amorfrutin的进一步提取提供了有效的数据。

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第4章 实验结论

本实验是与Amorfrutin的合成工作同时进行的，而Amorfrutin的提取成功能很大的促进Amorfrutin的合成工作，具有很大的实际意义。而本次实验只是做了定性的研究，证实了紫穗槐果实中确实含有Amorfrutin，且将紫穗槐果实粉碎处理后得到的产率更高，用5%盐酸及二氯亚砜和甲醇萃取处理的紫穗槐果实中提取到更多的Amorfrutin，证明经粉碎处理，用甲醇萃取的提取方法更为高效可行。但是至此也只做了定性的研究，后期更进一步的实验则是希望能能对相关方法及提取产物进行定量分析，从紫穗槐的果实中定量提取大量的Amorfrutin产物且提取工艺方法成熟高效。

具体实验结论如下：

（1）国内栽培的紫穗槐果实里也含有活性物质Amorfrutin。

（2）提取紫穗槐果实里的Amorfrutin时，把果实粉碎后，效果更好，而且在实验过程中不必搅拌，更方便实验操作。

（3）用溶剂萃取法对紫穗槐果实里的Amorfrutin进行提取时可用乙醇做溶剂。经盐酸和氯仿萃取后，再用甲醇和石油醚进行萃取，在甲醇相里可得到所要提取的Amorfrutin。

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致谢

经过三个月的实验和论文写作时间，毕业论文即将告一段落，也意味着四年大学生活即将结束。在这里要感谢一直在帮助着我的老师和同学。这篇论文是在我的导师王超教授的多次指导下完成的。从论文的选题到结构安排，从内容到文字润饰，都凝聚了他大量的心血。 在实验过程中，每周一次大型的组会，耐心的给我们解决实验过程中遇到的问题，与我们讨论实验方法，给我提出切实可行的指导性建议，并细心全面地修改了我的论文。王老这种一丝不苟的负责精神，使我深受感动。 在此，请允许我向尊敬的王超老师表示真挚的谢意！

在这里要特别感谢帮我校正文字和排版的孔雅俊学姐，谢谢你在实验过程中带给我无限多的帮助。尤其是在写毕业论文的时候，因为我的波普分析要从开始学习，遇到了很多困难的时候，谢谢你耐心地帮我讲解波普书上我不懂的知识。这篇论文能够按时完成，与您有着重大的关系。谢谢你为了我可以尽快地完成论文事宜牺牲了自己的宝贵休息时间，熬夜加班的帮着我分析图谱。

感谢我的伙伴 ，柴晓丽同学。感谢你反复的帮我检查论文格式，帮我排版，是你在我失意时给我鼓励，在我失落时给我支持，感谢你和我一路走来，我们不仅是实验的伙伴，也是同学，朋友。你是最棒的！

最后，再次感谢为我们默默地无私奉献自己的各位老师，老师们辛苦了！ 衷心祝愿母校师大的明天更加美好！

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