EMSA试剂盒使用方法介绍

基因结构和功能系列

CAT#:131039-100 低温运输，-20℃保存 即用型EMSA试剂盒 Electrophoretic Mobility Shift Assay Kit

使用手册V1.0

产品及特点 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay），也称gel shift，是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。其原理如下： 本产品具有下列特点： 1. 一站式，使用方便，本试剂盒提供了进行EMSA实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA上样液等主要试剂，使EMSA实验变得简单方便。 2. 非特异性结合低，EMSA结合缓冲液中含有poly(dI-dC)等有效成分，其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。 3. 用户需自备待标记的EMSA探针、用于探针标记的同位素、EMSA胶配制的相关试剂。 4. 本试剂盒足够标记10-20次探针，足够进行100个蛋白和探针的结合反应。 规格及成分 成 份 T4 Polynucleotide Kinase T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10×) Nuclease-Free Water 探针标记终止液 5M 醋酸铵 编号 131039A 131039B 131039C 131039D 131039E 100次包装 100 U 100 μL 1 mL 100 μL 600 μL

EMSA结合缓冲液(5×) EMSA上样液(蓝色，10×) EMSA上样液(无色，10×) TE溶液 使用手册 131039F 131039G 131039H 131039I 1份 200 μL 200 μL 200 μL 2 mL 运输及保存 自备试剂 使用方法 低温运输，-20℃保存，有效期一年。 待标记的EMSA探针、用于探针标记的同位素、EMSA胶配制的相关试剂等 一、探针的标记： 1. 探针标记的反应体系如下： 成 份 待标记探针(1.75pmol/μL) T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10×) Nuclease-Free Water [γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/mL) T4 Polynucleotide Kinase(5-10u/μL) 总体积 用量 2 μL 1 μL 5 μL 1 μL 1 μL 10 μL 按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。 2. 37℃反应10分钟。 3. 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。 4. 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。 5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 二、 探针的纯化： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作： 1. 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积（即25微升)的5M醋酸铵，再加入2倍体积（即200微升）的无水乙醇，混匀。 2. 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

3. 在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。 4. 在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 三、 EMSA胶的配制 1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。 2. 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。 成 份 TBE buffer(10×) 重蒸水 39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v) 80% 甘油 10% 过硫酸铵(ammonium persulfate) TEMED 用量 1 mL 16.2 mL 2 mL 625 μL 150 μL 10 μL 3. 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。 四、 EMSA结合反应： 1. 按照下表加入EMSA结合反应各成分： 成 份 Nuclease-Free Water EMSA结合缓冲液(5×) 细胞核蛋白或纯化的转录因子 未标记的探针 未标记的突变探针 目的蛋白特异抗体 阴性对照 7 μL 2 μL 0 -- -- -- 样品 5 μL 2 μL 2 μL -- -- -- 探针 冷竞争反应 4 μL 2 μL 2 μL 1 μL -- -- 突变探针的冷竞争反应 4 μL 2 μL 2 μL -- 1 μL Super- shift反应 4 μL 2 μL 2 μL -- -- 1 μL --

标记好的探针 总体积 1 μL 10 μL 1 μL 10 μL 1 μL 10 μL 1 μL 10 μL 1 μL 10 μL 2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温

（20-25℃）放臵10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放臵20分钟。 3. 加入1微升EMSA上样缓冲液(无色，10×)，混匀后立即上样。 注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。 五、电泳分析 1. 用0.5×TBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1×的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。 2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1×的EMSA上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。 3. 按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。 4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。 5. 在干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。 六、结果分析

上图为典型的EMSA分析图，各上样孔介绍如下： 1. 为阴性对照反应(标记探针)； 2. 为常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)； 3. 为探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍量的标记探针)； 4. 为突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针)； 5. 为Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+目的转录因子的特异抗体)。

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