08分子实验

分子生物学基础实验

分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。

实验一 质粒DNA的小量制备

一、实验原理

要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。

质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。

所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。

质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。

二、实验目的

1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂

材料：大肠杆菌E.coli，含pEGFP-N3、pET-28质粒。 试剂：

1. LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH调pH至7.3左右。如

固体培养基则添加15g/L琼脂。

2. 溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。

灭菌后存放。

3. 溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS母液，临用前一天晚上加入

0.2mol/LNaOH，4℃保存。

4. 溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。 5. 酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24:1，然后

等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。 6. 无水乙醇 7. 70％乙醇

8. pH8.0 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。 仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。 四、操作步骤 （一）培养细菌

将带有质粒pEGFP-N3、pET-28的大肠杆菌接种在含20μg/mL卡那霉素(Kan)的LB液体培养

基中，37℃振荡培养过夜。

（二）从菌落中快速提取制备质粒DNA

1．取1.5mL菌液置于1.5mL Ep管中，10000rpm离心3min。

2．弃上清，加入150μL GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。 3．加入200μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。

4．加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。

5．4℃，10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离心一次。

6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4℃，12000rpm离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。

7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置10min。用离心机于10000rpm离心10min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。

8．用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心5min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。

9．用25uL含无DNA酶的胰RNase(20 ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供下午电泳使用。贮存于-20℃备用，可长期保存。 五、注意事项

1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。

2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈

振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。

3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则

应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。

4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前

必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。

5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白

色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。

6．实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep管，全部弃用，不回收。 7．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转

接，每次接种时应挑单菌落。 六、思考题

1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？ 2．质粒的基本性质有哪些？

3．碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？ 4．抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？ 5．如何提高质粒DNA的产量？

6．为什么质粒DNA不能反复在4℃、-20℃、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？

实验二 DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定

一、 实验原理

测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。 1．紫外分光光度法

DNA或RNA定量时，应在260nm和280nm两个波长下读数。根据计算在260nm波长下，每1ug/mL DNA钠盐的A值为0.20，即在A260=1时，双链DNA含量为50ug/mL，单链DNA与RNA含量为40ug/mL，单链寡核苷酸的含量为33 ug/mL。

双链DNA含量＝A260×50×稀释倍数（ug/mL） RNA含量＝A260×40×稀释倍数（ug/mL） 单链DNA含量＝A260×33×稀释倍数（ug/mL）

此外还可以根据260nm和280nm的读数间的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。 2．琼脂糖凝胶电泳法

根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。

由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。

表2－1 λDNA/ Hind Ⅲ中DNA片断

片段 1 2 3 4 5 6 7 8 碱基对数目/kb 23.130 9.419 6.557 4.371 2.322 2.028 0.564 0.125 相对分子质量 15.0×106 6.12×106 4.26×106 2.84×106 1.51×106 1.32×106 0.37×106 0.08×106 DNA含量/ % 47.7 19.4 13.5 9 4.8 4.2 1.1 0.3 DNA含量/(ng/mg) 476.9 194.1 135.2 89.9 47.9 41.8 11.6 2.6 二、实验目的

1．从以上实验中提取到的质粒DNA，为了能作下一步的酶切，连接及转化实验，必须测定DNA的纯

度、含量以及分子量大小。

2．本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测DNA、含量与相对分子质量大小。 三、实验材料和试剂

材料：自制的质粒DNA、λDNA/ Hind Ⅲ、。 试剂：

1．标准DNAmarker(λDNA/ Hind Ⅲ)

2．限制性内切酶EcoRⅠ或HindⅢ和10X缓冲液

3．酶反应中止液：0.2 5％溴酚蓝(含40％蔗糖)，已配好。

4．溴化乙锭染液（EB）：使用前稀释1000倍，母液已配好。注意：EB是一种诱变剂，配制和使用时

应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。

5．0.5×TBE缓冲液：Tris 2.18g、硼酸1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸馏水定容至400mL。可配成5×TBE母液，使用时稀释10倍即可。 6．0.7％琼脂糖 仪器：

37℃水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管(1.5mL)、加样器(20uL～lmL)、吸头。

四、实验操作

（一）质粒DNA的酶解

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