广东省动物源沙门菌PMQR和ESBLs基因流行分布调查

广东省动物源沙门菌PMQR和ESBLs基因流行分布调查

摘要：【目的】检测分离自广东省散养型养殖场的动物源沙门菌中质粒介导喹

诺酮类耐药基因(PMQR)和β-内酰胺类基因（ESBLs）的流行情况。【方法】琼脂平板稀释法对阳性菌株进行16种抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）测定；采用PCR方法检测PMQR(qnr、qepA、oqxAB、aac(6’)-Ib-cr)和ESBLs(CTX-M、TEM、SHV、OXA、PER、VEB、GES、CMY-2)基因。【结果】72株沙门菌对16种兽医临床产用抗生素耐药率较高；qnrA 、qnrD、qnrS、aac（6′）-Ib-cr、oqxAB的检出率依次为6.94%、25%、5.56%、33.33%和6.39%，但未检测到qnrB、qnrC和qepA；aac（6′）-Ib-cr 的检出率较高，且与oqxAB和qnrD 常常同时存在；CTX-M(11.11%)、PER（1.39%）、CMY-2(9.72%)、TEM（56.94%）、OXA（69.44%），没有检测到VEB、GES、SHV。【结论】PMQR和ESBLs基因在广东省兽医临床传播广泛，且对临床常用抗菌药物耐药较为严重，药敏谱呈多样化，多重耐药株比例较高,需引起重视。

关键词：沙门菌；PMQR；ESBLs；耐药基因

Prevalence of ESBLs and PMQR Encoding Genes in Salmonella from animal origin in Guangdong

Abstract：【Objective】The detected isolated from farm animals in Guangdong

Province source of Salmonella in the plasmid-mediated quinolone resistance gene (PMQR) and β - lactams (ESBLs) gene prevalence。【Method】16 antimicrobial agents by agar dilution method of positive strains minimum inhibitory concentration (MIC) determination ；The PCR method to detect PMQR (qnr, qepA, oqxAB, aac (6 ')-Ib-cr) and ESBLs (CTX - M, TEM , SHV , OXA , the PER , VEB , GES , CMY - 2 ) gene。【Results】72 strains of salmonella bacteria to 16 kinds of veterinary clinical antibiotic resistance rates higher；of qnrA , qnrD the qnrS , aac ( 6 ' ) - Ib - cr , oqxAB detection rates were 6.94% , 25% , 5.56 % , 33.33% and 6.39%，But not detected qnrB, qnrC , and qepA；AAC (6 ′) -Ib-cr detection rate is higher, and the oqxAB and qnrD often exist at the same time; CTX-M(11.11%)、PER（1.39%）、CMY-2(9.72%)、TEM（56.94%）、OXA（69.44%）; Not detected by VEB, GES, SHV。【Conclusion】PMQR and ESBLs gene is widely spread veterinary clinic in Guangdong Province；And for clinical commonly used antimicrobial drug resistance is relatively serious ，Drug susceptibility spectrum are diversified，A higher proportion of multiple antibiotic resistant strains，Need to bring to the attention。

Keywords： salmonella; PMQR; ESBLs; Resistance gene

引言：

自从喹诺酮类抗生素被应用于临床以后，耐药菌株便随之出现并日益严重[1] 。1998年首次在美国分离的肺炎克雷伯氏菌上报道了质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因qnr[2]后，目前为止，已有3类质粒介导的耐药决定因子(qnr、oqxAB、aac(6’)-Ib-cr)在世界范围内的各种肠杆菌属中报道。食品动物沙门菌可以通过食物链将耐药基因传播给人类[3]。β-内酰胺类和氟喹诺酮类是临床上最常用的2类重要抗菌药物，目前无论兽医临床还是医院分离的沙门菌对这两类抗菌药的耐药性非常严重，而且耐药机制也发展变化很快。这些耐药菌可以经水平传播方式或者随食物链传递给人类病原体，对公共卫生和人类健康造成威胁[4-5]。【本研究切入点】本研究检测了动物源沙门菌PMQR和ESBLS基因的流行情况及对临床上常用抗生素的耐药情况，旨在了解PMQR和ESBLS在中国广东省兽医临床上的流行情况，并为控制耐药菌的传播扩散及药物合理使用提供理论依据。【拟解决的关键问题】分离鉴定菌株，测定菌株对16种药物的MIC值，筛选PMQR和ESBLs基因阳性株；研究同一分离株是否同时携带不同的qnr 、qepA 、aac（6′）-Ib-cr 及oqxAB 基因；分析ESBLs基因的流行情况。 1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 样品来源

1.1.2 主要培养基

亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、亚硫酸铋琼脂（BS）、胆硫乳琼脂（DHL）、三糖铁琼脂（TSI）、LB肉汤（LB Broth）和LB琼脂（LB Agar）购自山东海博生物科技有限公司。MH肉汤培养基购自广东环凯。rTaq酶、DL2000 DNA marker、10×Loading Buffer购自宝生物工程（大连）有限公司。琼脂糖购自英国Difico公司。

1.1.3 主要仪器设备

电热恒温培养箱购自上海申贤恒温设备厂；PCR扩增仪（Mastercycler）购自德国eppendorf公司；Jim-X型电泳槽购自大连竞迈生物科技有限公司；HZQ-QX型全温振荡器购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司；WFH-2.1型紫外成像系统购自英国UVItec公司；JY600型稳压稳流电泳仪购自北京君意东方电泳设备科技有限公司；电子天平AE160购自瑞士METTLER公司；INNOVA-4000购自美国New Brunswich Scientific公司。 1.1.4 MIC所用药物

氨苄西林：北京鼎国生物科技公司，纯度95%；头孢噻呋钠：浙江海正药业，纯度89.6%；氟苯尼考：浙江海翔药业，纯度99.5%；盐酸四环素：宁夏启元药业有限公司，纯度95%；喹乙醇：山东格瑞恩动物药业有限公司，纯度95%；头孢曲松、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素均购自普博欣生物有限公司，纯度分别为85%、95%、95%；头孢他啶、头孢噻肟、恩诺沙星、盐酸环丙沙星、氯霉素均购自中国药品生物制品检定所，纯度分别为84.2、89.3%、99.5%、84.9%、99.5%；硫酸庆大霉素购自中国药品生物制品检定所，效价为633U/mg： 1.2 方法

1.2.1菌株的筛选

本实验室保存的临床分离菌株是由30%甘油制成的甘油菌，保存于-20℃的冰箱。从冰箱中取出，充分震荡混匀，接种到SC增菌液，37℃培养18~24 h。将SC增菌液中的细菌划线转种于BS和DHL琼脂平板上，分别于37 ℃的恒温培养箱中培养24~36h和18~24 h。观察菌落特征。将符合沙门菌形态特征的菌落接种TSI培养基上，斜面划线，底层穿刺接种。于37 ℃的恒温培养箱中培养18~24 h，观察细菌在其上的生长情况。将符合沙门特征的菌落接于LB肉汤中，水煮法提取细菌DNA，经过分子生物学鉴定[6]（扩增沙门特异性引物invA），将最终能扩出invA基因的临床分离菌确定为沙门菌，共有72株。（沙门菌的分离率） 1.2.2

提取细菌DNA 采用水煮法，25μl反应体系，设空白对照和阳性对照；扩增产物的检测：PCR 产物5μL点样进行琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察结果，并拍照保存。PCR引物见表1,运行参数见表2。

1.2.2 药物最小抑菌浓度（MIC） 采用临床与试验标准协会（ CLSI）所推荐的琼脂板稀释法进行。培养基采用MH 肉汤，质控菌采用大肠杆菌ATCC25922。 1.2.3 β-内酰胺酶基因和PMQR基因的检测 所检测的β-内酰胺酶基因包括blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaPER、blaVEB、blaGES、blaCMY-2。对于CTX-M型ESBLs基因的检测，先用通用引物扩增，再挑选CTX-M阳性菌株用特异性引物分别扩增blaCTX-M-1G、 blaCTX-M-2G、blaCTX-M-8G、blaCTX-M-9G和blaCTX-M-25G。被检的PMQR基因包括qnr、qepA、aac（6’）-Ib-cr、oqxAB。 阳性PCR产物送北京华大公司测序，将测序结果提呈NCBI进行序列比对。

表 1 PCR扩增所用引物序列、扩增片段长度

Tab.1 Sequences of specific primers used in PCR

目的基因 invA qnrA qnrB qnrC qnrD qnrS qepA aac(6')-Ib-cr oqxA

长度（bp） 283 516 469

447

500~600 417 548 482 529 引物序列（5‘-3’）

F：GGTGATGGTCTTGTCGCC R：GCTCGCCTTTGCTGGTT F：ATTTCTCACGCCAGGATTTG R：GATCGGCAAAGGTTAGGTCA F：GATCGTGAAAGCCAGAAAGG R：ACGATGCCTGGTAGTTGTCC F：GGGTTGTACATTTATTGAATC R：TCCACTTTACGAGGTTCT

F：CGAGATCAATTTACGGGGAATA R：AACAAGCTAGAGCGCCTG F：ACGACATTCGTCAACTGCAA R：TAAATTGGCACCCTGTAGGC

F：CGGCGGCGTGTTGCTGGAGTTCTT R：CCGACAGGCCCACGACGAGGATGC F：TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA R：CTCGAATGCCTGGCGTGTTT F：AGTCCATACCAACCTCGTCTCC R：GCGTGGCTTTGAACTCTGC

oqxB

blaCTX-M

blaCTX-M-1G

blaCTX-M-2G

blaCTX-M-8G

blaCTX-M-9G

blaCTX-M-25G

blaPER

blaVEB

blaGES

blaCMY-2

blaSHV

blaTEM

blaOXA 637 543 890 843 947 876 856

1014 827

1143 885

1083 813 F：CATTGGCGGCGTGAAGA R：CCTGATTATTGCGGGTGC

F：TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA R：CGATATCGTTGGTGGTGCCATA F：ATCCCATGGTTAAAAAATCACTGC R：CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTTG F：CTCAGAGCATTCGCCGCTCA R：CCGCCGCAGCCAGAATATCC F：ACTTCAGCCACACGGATTCA R：AAGTGGAGCGACAGAGC

F：GCGCATGGTGACAAAGAGAGTGCAA R：GTTACAGCCCTTCGGCGATGATTC F：GTAAGGGGGGGGATGTTAAT R：AACCGTCGGTGACAATTCTG F：GGGACARTCSKATGAATGTCA R：GGGYSGCTTAGATAGTGCTGAT F：CGACTTCCATTTCCCGATGC R：GGACTCTGCAACAAATACGC F：TTCATTCACGCACTATTAC R：TAACTTGACCGACAGAGG F：ATGATGAAAAAATCGTTATGC R：TTGCAGCTTTTCAAGAATGCG F：CACTCAAGGATGTATTGTG R：TTAGCGTTGCCAGTGCTCG F：ATAAAATTCTTGAAGACGAAA R：GACAGTTACCAATGCTTAAGC F：ACACAATACATATCAACTTCGC R：AGTGTGTTTAGAATGGTGATC

表2 PCR反应运行条件

Table 2 PCR reaction operating conditions

目的基因 运行参数

qnrA

qnrB

(94℃，3min)+{(94℃，30s)+（53℃，45s）+(72℃，1min）}×32+（72℃，10min）

(94℃，3min)+{(94℃，30s)+（53℃，45s）+(72℃，1min）}×32+（72℃，10min） (94℃，3min)+{(94℃，45s)+（50℃，45s）+(72℃，1min）}×30+（72℃，

qnrC

qnrD

qnrS

qepA

aac(6')-Ib-cr

oqxA

oqxB

10min）

(94℃，3min)+{(94℃，45s)+（50℃，45s）+(72℃，1min）}×30+（72℃，10min）

(94℃，3min)+{(94℃，45s)+（53℃，45s）+(72℃，1min）}×30+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，45s)+（60℃，45s）+(72℃，1min）}×30+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，45s)+（55℃，45s）+(72℃，45s）}×30+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，30s)+（55℃，30s）+(72℃，30s）}×30+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，30s)+（55℃，30s）+(72℃，30s）}×30+（72℃，10min）

blaCTX-M blaCTX-M-1G

blaCTX-M-2G

blaCTX-M-8G

blaCTX-M-9G

blaCTX-M-25G blaPER blaVEB blaGES blaCMY-2 blaSHV

(94℃，5min)+{(94℃，30s)+（59℃，30s）+(72℃，60s）}×30+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，45s)+（56℃，45s）+(72℃，60s）}×32+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，45s)+（56℃，45s）+(72℃，60s）}×32+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，45s)+（56℃，45s）+(72℃，60s）}×32+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，45s)+（56℃，45s）+(72℃，60s）}×32+（72℃，10min）

(94℃，3min)+{(94℃，45s)+（55℃，45s）+(72℃，60s）}×32+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，60s)+（55℃，45s）+(72℃，90s）}×30+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，60s)+（55℃，45s）+(72℃，90s）}×30+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，60s)+（55℃，45s）+(72℃，90s）}×30+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，60s)+（55℃，45s）+(72℃，90s）}×30+（72℃，10min）

(94℃，3min)+{(94℃，30s)+（56℃，30s）+(72℃，60s）}×32+（72℃，10min）

blaTEM blaOXA

(94℃，5min)+{(94℃，30s)+（53℃，30s）+(72℃，60s）}×35+（72℃，10min）

(94℃，5min)+{(94℃，30s)+（53℃，30s）+(72℃，60s）}×35+（72℃，10min）

2 结果

2.1 药敏试验（总耐药情况，PMQR、ESBLs阳性菌耐药情况）

72株沙门菌对兽医临床常用抗菌药物做药敏检测见表3。参照CLSI2007 抗菌药物感性试验执行标准，从表中可以看出，PMQR 阳性菌对抗菌药物的耐药性普遍较为严重。对氨苄西林的耐药率为100%，环丙沙星86.11%，萘啶酸100%，氯霉素97.22%，四环素100%，庆大霉素94.44%，头孢噻肟70.83%。对其它药物的耐药率分别为链霉素84.95%，恩诺沙星100%，卡那霉素90.28%，氟苯尼考100%，头孢曲松52.78%，头孢他啶41.67%，喹乙醇93.06%。PMQR 阳性菌株对头孢西丁的敏感性最高，其耐药率仅为1.39%。其次是头孢噻呋，耐药率 31.94%。结果显示，大部分PMQR 阳性菌株对8种以上药物耐药。（多重耐药）（表型与基因型之间关系）（三类喹诺酮耐药机制介导的耐药水平情况）

表3 PMQR 阳性大肠杆菌对16 种抗菌药的药敏试验

Table 3 Susceptibility of 93 PMQR-positive E. coli isolates to16 antimicrobial agents

药物Drug 百分数（%） AMP CTX CTR CXT CTZ CTF GEN KAN STR TET CIP NAL CHL FLF ENR OQX

菌株数（百分数）NO. of isolates(percentage)

敏感 中介 耐药

0 0 100% 26.39% 2.78% 70.83% 47.22% 0 52.78% 93.05% 5.56% 1.39% 56.94% 1.39% 41.67% 59.72% 8.34% 31.94% 4.16% 0 94.44% 6.94% 2.78% 90.28% 19.44% - 80.56%

0 0 100% 4.17% 9.72% 86.11%

0 0 100% 2.78% 0 97.22%

0 0 100% 0 0 100% 6.94% 0 93.06%

AMP：氨苄西林，CTX：头孢噻肟，CTR：头孢曲松，CXT：头孢西丁，CTZ：头孢他啶，CTF：头孢噻呋，GEN：庆大霉素，KAN：卡那霉素，STR：链霉素，TET：四环素，CIP：环丙沙星，NAL：萘啶酸，CHL：氯霉索，FLF：氟苯尼考， ENR：恩诺沙星，OQX：喹乙醇。

2.2 PMQR基因的检测

72株沙门菌中未检测到qnrB、qnrC和qepA。其中，qnrA有5株，qnrD有亚型qnrD1 18株，qnrS有两个亚型：qnrS1(3株)和qnrS2(1株)，oqxAB有19株，aac(6)-Ib-cr 共有24株。qnrA、qnrD1、qnrS、aac（6′）-Ib-cr，oqxAB 的检出率见表4。携带多个基因的检出情况如表5。

表4 阳性菌株数量

Table 4 Quantity of positive isolates

基因Gene qnrA qnrD1 qnrS oqxAB aac(6')-Ib-cr

数量NO. 5 18 4 19 24

百分数Percent(%) 6.94% 25% 5.56% 26.39% 33.33%（分析原因）

表5 携带多个基因菌株的检测结果

Table5 Detection of multiple-gene

基因Gene

qnrA、aac(6')-Ib-cr qnrD、aac(6')-Ib-cr qnrS、aac(6')-Ib-cr oqxAB、aac(6')-Ib-cr qnrA、qnrD qnrA、qnrS qnrD、qnrS qnrS、oqxAB、aac(6')-Ib-cr

qnrD、qnrS、oqxAB、aac(6’)-Ib-cr 百分数

数量NO. Percent(%) 1 1.39% 6 8.33% 2 2.78% 8 11.11% 1 1.39% 1 1.39% 1 1.39%

2 2.78%

1 1.39%

喹诺酮类药耐药严重原因之一 危险性 2.3 ESBLs基因的检测 72株沙门菌ESBLs的检测结果见表6。它们带有一种或多种ESBLs家族中的基因,其中，blaCTX-M基因有blaCTX-M-15（1株）、blaCTX-M-79（2株）、blaCTX-M-14（2株）、blaCTX-M-24（2株）、blaCTX-M-27（1株），blaCMY-2有7株，blaPER-1仅有1株，blaTEM基因有blaTEM-1（38株）、blaTEM-53（3株），blaOXA-1共有50株，各种亚型基因有交叉携带现象。

表6 ESBLs家族及其各亚型的分布情况 Table 6 Distribution of ESBLs genes

类型

blaCTX-M-1G

CTX-M-15 CTX-M-79

blaCTX-M-9G

CTX-M-14 CTX-M-24 CTX-M-27

blaPER-1 blaCMY-2 blaTEM

TEM-1 TEM-53

blaOXA

blaOXA-1

50

69.44%

2 2 1 1 7 38 3

2.78% 2.78% 1.39% 1.39% 9.72% 52.78% 4.17%

菌株数

1 2

百分数（%） 1.39% 2.78%

3 讨论

从药敏试验结果可以看出，本研究分离到的沙门菌株对临床常用抗菌药物耐药情况较为严重，提示耐药基因的存在可能是细菌具有耐药性的主要因素。从表3可以看出，头孢类药物的耐药性较低，而其他类药物，如氨基糖苷类、喹诺酮类药物的耐药性很高，有的可达100%。耐药情况较严重，这可能是由于本菌所分离的养殖场长期滥用抗生素导致。

本研究没检测到qnrB、qnrC和qepA。qnrA、qnrD、qnrS的检出率依次为6.94%，25%和5.56%。aac(6’）-Ib-cr 和oqxAB的检出率最高，分别为33.33%和26.39%。本研究中沙门菌株oqxAB 基因阳性率高于韩国、巴西和日本[7-9]，可能是由于国内各种喹诺酮类药物的使用量较大，促进了细菌对对喹诺酮类药物耐药性的产生。2006、2007年德国和土耳其分别报道从鸡分离到沙门菌中检测到

qnrS[10-11],qnrD是2008年首次在病人分离的沙门菌中鉴定出的[12],目前为止国内关于沙门菌此类基因的报道较少，而本研究中检测到数量较多，说明PMQR基因流行率有所提高，需要引起重视。由表5可以看出，PMQR 基因常常共存于同一菌株，形成蓄积，提高了细菌对抗菌药物的耐药性。且耐药基因谱型错综复杂，有9种组合方式。以oqxAB、aac（6′）-Ib-cr 的联合方式最为常见，其次为qnrD、aac(6’)-Ib-cr，有6株菌。同时携带qnrD、qnrS 、oqxAB和aac（6′）-Ib-cr 基因的菌株数较少，aac（6′）-Ib-cr 经常同其它PMQR 耐药基因同时存在，同时携带3 种或3 种以上耐药基因的菌株数较少。本研究中检出的同时包含多个耐药基因的菌株概率较高，与Yue[13]等人之前所作的相关研究结果相比，有上升趋势，应引起足够重视。

ESBLs基因在72株沙门菌中的检出率为CTX-M(11.11%)、PER（1.39%）、

CMY-2(9.72%)、TEM（56.94%）、OXA（69.44%），没有检测到VEB、GES、SHV基因。CTX—M型ESBLs在世界各地的流行分布存在差异，欧洲国家主要流行CTX-M-15，南美地区主要类型为CTX-M-2和CTX—M-9[14]，韩国以CTX-M-14型和CTX-M-15型分布最为广泛[15]。我国2006年报道了临床大肠埃希菌CTX-M-14的流行占绝对优势[16]。本研究检测出CTX-M-14产酶株，说明CTX-M-14已在食品动物沙门菌中传播扩散。通常由质粒介导的TEM和OXA内酰胺酶可通过点突变产生新的衍生酶来增宽其所能作用的底物范围[17] ，本研究检测到TEM-1、TEM-53和OXA-1等亚型，需引起重视。另外值得注意的是，近年来有关单一菌株同时产多种ESBIs[18] 以及由产复合ESBLs菌株[19-20]引起医院感染暴发流行的报道屡有出现。在本研究中有27株菌检出≥2种的耐药基因，显示出多重耐药的趋势。对临床分离菌ESBLs的基因分型检测，可以加强对产ESBLs的菌株的监测，有望为临床治疗提供更合理的治疗方案，以降低耐药性的发生率。 4.结论

本研究结果表明，PMQR和ESBLS基因在中国广东省养殖场的流行已经非常普遍，且PCR阳性沙门菌耐药较严重，对兽医临床上常用药物耐药率较高。虽然PMQR基因单独存在时仅介导细菌对喹诺酮药物低水平耐药，但多个PMQR 亚型基因经常共存于同一菌株，或与β-内酰胺酶基因共存于同一质粒，增强了细菌对药物的适应性，加速耐药基因传播。此外，PMQR基因阳性菌在喹诺酮药物选择压力下，更容易诱发染色体突变，从而导致菌株高水平耐药。因此，应加强PMQR和ESBLs基因检测，以便指导临床合理使用抗菌药物，预防与控制耐药基因传播流行。

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