基因组提取 16S RNA PCR及连接转化 - 图文

一、实验材料

菌种：某浸矿混合菌。

设备：eppendorf管、移液枪、台式高速离心机、电泳仪、水浴锅、PCR仪、无菌操作台、牙签、枪头、酒精灯。

试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、LB液体培养基、LB固体平板培养基、TE缓冲液（pH 8.0）、切胶回收试剂盒、Taq DNA polymerase，10 mM dNTPmix，引物，双蒸水，琼脂糖、溴乙锭EB、电泳缓冲液（50×TAE电泳缓冲液：取Tris 24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA（pH8.0） 20ml，加蒸馏水至100ml）、pGM-T 克隆试剂盒、Hind III、石蜡。

二、实验步骤

1 细菌基因组DNA提取 1.1 样品收集

菌种培养至OD600为1-1.5，此时1 mL 菌液中约含1.0×109细胞，用灭过菌的1.5mL离心管去菌液1 ml，室温10,000 rpm离心1 min，收集菌体。

1.2 基因组DNA的提取

（使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的使用说明。）

1.向菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮； 2.向管中加入20 μl 蛋白酶K溶液，混匀；

3.加入220 μl 缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；若溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯；

4.加入无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

6.向吸附柱CB3中加入500 μl 缓冲液GD，12,000 rpm离心30秒，倒掉废

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液，将吸附柱CB3 放入收集管中；

7.向吸附柱CB3中加入700 μl 漂洗液PW，12,000 rpm 离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；

8.向吸附柱CB3中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心2分钟，将溶液收集到离心管中。为了增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心2分钟。洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率，且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

1.3 DNA检测

配置0.8%的琼脂糖凝胶，点样5μl ,约80V 电泳20-30分钟，置于凝胶成像系统或紫外投射检测仪上观察条带。具体步骤如下：

1制胶（80ml）：称取0.64g琼脂糖，加入80ml 的1×TAE缓冲液（pH8.0），摇匀；微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；将胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入5.0 μl EB 后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4-6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约30-45min）。将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。

2 点样：用微量移液器将5μl含蓝色染液的Marker加入点样孔下部，样品与Loading Buffer混匀后进行点样。

3 电泳：打开电源开关，调节电压至3-5V/cm(约80V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约20-30min后即可观察结果。

4 观察：将电泳好的胶置于紫外投射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸

2

条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。

2 16s rDNA PCR扩增

1 在冰盒上操作，按从大体积到小体积的次序将各成分加入一无菌PCR管中。

试剂

10×PCR Buffer dNTPs 引物1 引物2 DNA模板 Taq 酶（2U/μl

体积/μl 2.5 1 0.5 0.5 2 1

dd H2O 15.5 Mgcl2

2

2 调整好反应程序，将上述混合液混匀，立即置PCR仪上，执行扩增。 PCR反应程序如下：

94 ℃ 94 ℃ 55 ℃ 72 ℃ 72 ℃

5 min 45 s 45 s 90 s 5 min

32 cycles

反应结束，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

2.3 琼脂糖凝胶电泳检测

1 制胶（80ml）：称取0.8g琼脂糖，加入80ml 的1×TAE缓冲液（pH8.0），摇匀；微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；将胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入5.0 μl EB 后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4-6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约30-45min）。将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。

2 点样：用微量移液器将5μl含蓝色染液的Marker加入点样孔下部，样品与

3

Loading Buffer混匀后进行点样。

3 电泳：打开电源开关，调节电压至3-5V/cm(约100V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40min后即可观察结果。

4 观察：将电泳好的胶置于紫外投射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

3 连接及转化

由于前天未得到PCR产物，故采用实验室以前扩增的样品。

3.1 连接

1 将载体在冰上融化（尽可能避免反复冻融载体，在初次使用时最好分装成小份，每次使用时取出一份），短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。 2 按照下表内容在无菌的离心管中加入各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，可根据DNA片段的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。加入过多的片段反而会干扰连接反应。

使用2×Rapid Ligation Buffer

连接体系中的成分 目的PCR片段

对照片段（700bp，50 ng/μl） pGM-T 载体（约50 ng/μl） 2×T4 DNA Rapid Ligation

5 μl

Buffer

T4 DNA Ligation(3U/μl)

无菌去离子水

1 μl 补足到10 μl

1 μl 补足到10 μl

5 μl

反应体系 3 μl -- 1 μl

对照体系

-- 1 μl 1 μl

3 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。将混合反应液置于22-26℃反应5-10 分钟（反应不要超过15min，否则会降低连接效率），反应结束后，将离心管置于冰上。

3.2 转化

4

1 取部分连接产物加到50-100 μl TOP 10感受态细胞中（感受态细胞应刚从-70℃冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹混匀，冰浴30分钟（必要时使用超螺旋质粒pUC 19同步转化感受态细胞作为对照检测转化效率，将1μl pUC 19加入另一只感受态细胞管中，其余操作步骤与连接产物的转化步骤同步进行）。 2 将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴中放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。

3 向离心管中加入250-500 μl 37℃预热的SOC或LB（不含抗生素）的培养基，150 rpm、37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

4 将离心管中的菌液混匀，吸取400 μl加到含相应抗生素的LB固体琼脂平板培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开，待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。

4 单酶切

1 在一已灭菌的PCR管中依次加入下面体系（目的DNA为实验室先期提取）， 整个操作在在冰上操作。

试剂 10×Buffer 目的DNA片段

MspⅠ ddH2O

体积/μl

1 5 0.2 3.8

混匀，短暂离心。

2 将其放入37℃水浴2-3小时。 3 70℃水浴10分钟，终止酶切反应。 4 琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。

三、实验结果及分析

1 细菌基因组DNA提取

由于时间有限，提取总DNA后，先做16s rDNA PCR，然后做琼脂糖凝胶

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