无菌灌装验证方案

无菌灌装模拟试验方案

验证分类：工艺验证 验证部门：冻干粉针剂车间

甘肃大得利制药有限公司

1.概述：为证明在确定的环境、工艺和操作下，生产过程能有效地防止微生物污染，使产品达到无菌要求，需进行培养基模拟灌装试验，来验证所提供产品的无菌可靠性达到可接受的标准。这是GMP对非最终灭菌无菌冻干粉注射剂生产的基本要求，是无菌制剂工艺验证的重要组成部分。但是此试验不能对常规生产造成不良影响。

无菌灌装模拟试验是指由掌握了无菌操作的人员在一个有控制的环境中，利用适宜的设备系统,将经灭菌（或经除菌过滤）的无菌培养基灌装于事先灭菌的容器中，制成无菌药物的过程。该验证是在与无菌灌装生产过程有关的其他验证如：洁净厂房、公用系统（工业用水系统等）、设备（包括蒸汽灭菌柜、隧道式干燥灭菌器等）等验证合格后，且操作人员熟练掌握了岗位SOP后进行的。

采用培养基代替药品进行无菌灌装对无菌工艺进行验证，即用经过湿热灭菌（除菌过滤）的液体胰酪胨大豆肉汤培养基代替产品药液，进行无菌灌装、半加塞操作，灌装后的样品送入冻干箱内放臵产品冻干程序所需时间，再进行压塞、轧盖，然后进行培养观察，以确认无菌灌装工艺的可靠性，以上整个操作过程应模拟正常的产品生产时的最差状态。

培养基灌装作为无菌灌装的模拟实验，可以直观、方便、准确地反映出无菌灌装过程的污染情况及问题。

2.目的：通过培养基无菌灌装模拟试验，来确认在冻干粉针剂灌装过程中所采用的各种方法和各种规程，防止微生物污染的水平达到可接受的合格标准的能力，或提供保证所生产产品的无菌性的可信限度达到可接受的合格标准的证据，为今后对粉针车间进行冻干粉针剂灌装作业管理确定依据，即通过对经过培养的灌装样品进行检查并对结果进行分析解读可以综合评估无菌工艺的可靠性，借以确定实际生产中产品被污染的概率，确保无菌产品的无菌性。

3.范围：此验证方案适用于粉针车间，非最终灭菌的无菌生产工艺模拟试验。 4.依据：药品生产质量管理规范》2010修订版 附录1：无菌药品生产；

《中国药典》2010年版二部附录 无菌检查；GMP指南

5.责任：质量部、生产部、质检科、粉针车间、设备部等部门负责本试验的执行、分析及报告。方案应对人员职责进行说明，比如监督和观察职责如何实施。

参加本次验证的人员名单： 宋秉生

孙维宏

黄建德

伏庆红

许海

被授权在生产时进入无菌灌装间的人员，包括观察人员和维修人员名单： 6.实施：

本次试验计划实施安排时间： 第一次 第二次 第三次 备注：

需要连续进行3次合格试验。

6.1 模拟分装数量及确定可接受的合格标准：

模拟的批次量应足够大，灌装的数量应该满足可以准确模拟正常生产操作的

要求，以模拟正常生产的条件并正确评估常规生产的污染风险，一般可接受的灌装量在5000至10000瓶。如正常生产的批次量低于5000瓶，培养基灌装至少应为实际生产线最大的批次量。

分装量与污染控制数关系表

警戒限：可信限为95%时污染概率大于0.05%；

合格限：可信限为95%时污染概率小于0.1%。

我公司灌装工艺使用的是隔离器操作，关键的灌装阶段极少人工操作，实

际生产的批次量是8500瓶（10ml西林瓶）、33000瓶（2ml西林瓶），一个班次在一班内就可以完成灌装工作，选择灌装批量5000瓶，灌装时间持续一个班。 6.2试验前生产系统的确认: 6.2.1人员培训：

在培养基灌装前必须准备好验证方案和相关文件，所有参与培养基灌装的人员应当经过适当培训以保证他们对方案和实际实施有足够的了解。

人员培训情况

6.2.2确认公用系统、工艺用水系统和空调系统、车间设备等是否处于正常运行状态。

系统评价表

6.3 试验过程： （附：工艺流程图） 图例：

C级洁净区

6.3.1培养基选择及其性能试验 6.3.1.1培养基的选择：

该试验选择了能够支持菌谱范围宽、可促进革兰氏阳性、革兰氏阴性、酵母菌和霉菌生长的胰酪胨大豆肉汤培养基。 6.3.1.2胰酪胨大豆肉汤培养基性能测试：

6.3.1.2.1责任：质量部微生物试验员负责该项工作。 6.3.1.2.2胰酪胨大豆肉汤培养基的配制： 分三次试验，每次分装100支试管。

附：胰酪胨大豆肉汤培养基配制记录

需配制培养基名称：胰酪胨大豆肉汤培养基 来源 ：

灭菌后观察培养基，外观要澄明，这样检查时能够很容易观察出由于污染导致的混浊和沉淀现象。 6.3.1.2.3培养基无菌性试验：

将上述100支试管，其中50支试管臵于30～35℃下培养7天，同时将另外50支试管臵于20～25℃下培养7天。7天内各试管培养基中应无任何微生物生长。 6.3.1.2.4微生物生长性能试验：

将上述50支试管中接种枯草杆菌，接种量为<100CFU；在另50支试管中接种白色念珠菌，接种量为<100CFU，将接种有枯草杆菌的试管臵于30～35℃下培养7天，将接种有白色念珠菌的试管臵于20～28℃下培养7天。7天内至少有50%以上接种的各试管的培养基中应有明显的微生物生长。

6.3.2无菌灌装试验用西林瓶无菌性试验：

评价方法：①西林瓶清洗灭菌后、灌装使用前，在无菌区打开烘箱箱门，在烘箱底层和最高层的四个角落处按无菌取样要求分别取出5只（共20只）西林瓶放入无菌取样锥形瓶中,密封，作为1号样品；②无菌灌装结束后，从生产线上剩余的西林瓶中随机取20只，放入无菌取样锥形瓶中,密封，作为2号样品。将以上样品送质检科，分别加入100ml氯化钠注射液，按《中国药典》2010年版二部附录“无菌检查法”—薄膜过滤法作无菌检查。

6.3.3 无菌灌装试验用胶塞无菌性试验：

评价方法：①胶塞清洗灭菌后，在最初卸料时，取卸料口处的胶塞20只，放入无菌取样锥形瓶中,密封，作为1号样品；②无菌灌装结束后，从振荡器上的剩余胶塞中随机取20只，放入无菌取样锥形瓶中,密封，作为2号样品，将以上样品送质检科，分别加入100ml氯化钠注射液，按《中国药典》2010年版二部附录“无菌检查法”—薄膜过滤法作无菌检查。

6.3.4 无菌灌装试验用铝盖的无菌性试验：

评价方法：①铝盖清洗灭菌后，在最初卸料时，取卸料口处的铝盖20只，放入无菌取样锥形瓶中,密封，作为1号样品；②轧盖结束后，从剩余铝盖中随机取20只，放入无菌取样锥形瓶中,密封，作为2号样品，将以上样品送质检科，分别加入100ml氯化钠注射液，按《中国药典》2010年版二部附录“无菌检查法”—薄膜过滤法作无菌检查。

6.3.5无菌灌装试验： 6.3.5.1环境条件及检测：

培养基灌装试验的环境条件应充分体现生产操作的实际情况，不应采取特

别的生产控制和预防措施，制造特别良好的工艺环境，这样会导致不准确的评估结论，造成工艺条件良好的假象。

其次，也不应当对净化空调系统重新调整而使其在最差的状态下运行的环

境条件进行验证。

对于环境最差条件的挑战应当是在工艺允许的苛刻条件范围内，对环境受

干扰程度（如生产现场人员最对、生产活动频率最高的挑战。 环境监控项目：

包括温湿度、压差、空气悬浮粒子、空气浮游菌、沉降菌、设施和设备表面的微生物以及操作人员的卫生状况监测等。 评价方法：

① 对各个功能间按GMP2010修订版进行温湿度、压差、悬浮粒子、浮游菌、沉降菌动态环境检测。

②无菌服灭菌后，取无菌包两个（其中一个为灭菌柜底层开门处最冷点），在缓冲间取出无菌衣，在两只袖子、前胸3处分别用25cm2的接触皿进行表面微生物检查。③灌装结束后，每个灌装人员的手指（10个，戴着无菌手套）分别在微生物培养皿上按压下指印，每皿5个手指（一只手套），进行表面微生物检查。④灌装结束，在灌装人员身上用25cm2的接触皿分别进行无菌服的双臂、前胸3处的表面微生物检查。

动态环境监测标准

6.3.5.2培养基配制：

配制好待除菌过滤（待请教），在灌装模拟试验过程中除菌过滤？ 由车间配料岗位在灌装前配制好适量的培养基。采用与实际生产相同的方式将培养基灭菌（除菌过滤）后，保存在储罐中，培养基在灌装前保存在储罐中得时间挑战最长工艺允许时间（2小时），并模拟这一阶段正常生产的所有操作：取样、过滤器完整性试验。然后使用实际生产的管路和设备送至灌装岗位进行灌装。

操作人员配制过程需注意一下几点：

①将配制培养基的注射用水冷却到室温，在室温下（20～25℃）配制。 ② 培养基的PH调整到适合微生物生长的范围。 ③ 培养基在储存容器中常温保存。

④ 培养基要看起来澄明，这样检查时能够很容易观察出由于污染导致的混浊和沉淀现象。

配制结束后按照要求清场并填写培养基配制记录。 6.3.5.3培养基灌装：

6.3.5.3.1容器/密封件规格及切换：

同一生产线可能用于不同大小容器的灌装。一般来说培养基灌装可以针对最大和最小的容器进行，除非其他不同规格容器的灌装工艺有很大差别。在初始验证时可以进行两次最大规格容器和一次最小规格容器的灌装挑战。在以后的周期性半年度灌装试验可以轮换，每次挑战一种规格。对于生产线切换不同规格产品的操作会增加污染的风险，因此在验证时也需挑战切换操作。

本公司冻干粉针车间需要进行10ml和2ml规格件的切换工作，我们初始验证进行两次10ml，一次2ml西林瓶的培养基灌装试验，2ml西林瓶实际生产时，产品“注射用腺苷钴胺”，属于光敏制剂，用琥珀色不透明西林瓶，为检出微生物的生长，选用了清晰透光的西林瓶进行模拟试验。

操作前按照标准操作流程将容器/密封件，灌装部位和设备等灭菌。 6.3.5.3.2灌装运行持续时间及灌装批次量：

模拟试验的时间不少于实际生产操作时间，以更好的反映人员所致污染的风险。

10ml灌装量，运行时间2小时，灌装总数量5000瓶。 2 ml灌装量，运行时间2.5小时，灌装总数量5000瓶。

灌装正常浓度培养基，每个容器灌装培养基的量并不需要和实际生产时完

全一样，可以根据容器大小来确定灌装量，但必须保证灌装后将容器来回翻转，培养基可以完全接触到容器和密封件内表面。10ml西林瓶灌装2ml，2ml西林瓶灌装1ml。

6.3.5.3.3灌装过程干扰设计：

在培养基灌装过程中，所有的正常操作如称重、检查、取样等都应模拟进行。还要进行干扰操作以挑战最差条件。工艺条件的选择选取合理的“最差条件”。用最差条件来对工艺流程、设备和整个系统进行挑战，用适合微生物繁殖的胰酪胨大豆肉汤培养基作为灌装试验的培养基，模拟日常生产过程中“最差的灌装条件”：

① 增加“装量检查”抽查的频率和装量调节次数，即由正常生产的每30min抽查增加为每15min抽查一次；

② 灌装人员每30min进行一次酒精手部消毒；

②灌装机“出现异常”，灌装人员通知维修人员进入灌装间“维修”； ③灌装时间（即灭菌后培养基在无菌区内暴露的时间）延长至5小时； ④设备运行速度调节至最差条件；

⑤选择操作最不熟练的工人。灌装时在关键区域保留最多的人员。 ⑥灌装暂停，操作工人更换班次。

⑦其他可能发生的活动，如漏液、倒瓶，故障维修等的处理。

6.3.5.3.4按灌装顺序对冻干框架编号，使灌装产品按灌装顺序送入冻干箱，灌装

数量为5000瓶含5瓶放臵探头。选择灌装批量5000瓶，一个班次可以灌装完毕。

装量抽检的西林瓶按使用顺序和时间编号、记录，并与生产线上的样品一同半加塞进入冻干箱。（正常生产时抽检的废弃） 注意事项：① 用压缩空气或空气来代替惰性气体。

② 10ml西林瓶灌装至少2～4ml培养基，以保证足够量培养基用于

培养。

③ 灌装过程用于手消毒的消毒剂（酒精），不能直接接触到培养基

上。假如要还班次，中间不进行消毒清场。

附：培养基灌装半加塞操作记录

培养基批号：

6.3.5.4模拟冻干：

将没有密封（半加塞）的容器装入腔室，保持腔室温度在正常温度，模拟抽

真空，使产品暴露于部分真空的环境中（可以通过抽真空引入空气流动，再通无菌空气以平衡气压，重复几次这样的操作来模拟冻干程序的运行，但要避免真空度过低，导致培养基的水分减少或微生物生长的抑制），这种方法不应进行冷冻操作，应确保培养基不处在缺氧或失水的状态，以避免抑制微生物的生长。 附： 培养基模拟冻干操作记录 培养基批号：

6.3.5.5轧盖：

按产品出箱要求冲氮、压塞和破空后，打开箱门，取出产品，传入轧盖间按盘号进行轧盖，记录轧盖后的产品数量。

附： 培养基模拟试验轧盖记录 培养基批号：

6.3.5.6灯检：

轧盖后的样品传入灯检间，灯检检查上下振摇两次后，按盘号倒臵转入培养托盘中，记录灯检数量，即最终有效的培养观察样品数量。 附： 培养基模拟试验灯检记录 培养基批号：

6.4培养观察：

在培养基灌装完成后，对密封好的最终产品进行培养。所有完好的灌装样品都应培养，对于与密封性无关缺陷（如外观缺陷）的灌装样品也应进行培养，不得剔除。有密封性缺陷的样品可作废品剔除，并记录剔除数量和原因。

每瓶容器在培养前和培养中间阶段都要来回翻转，这样确保容器的内表面和密封件（胶塞）内表面更培养基完全接触。

将灌装样品先倒臵于20～25℃的温度（室温）下培养7天，然后转入30～35℃的温度下继续倒臵培养培养7天；

在培养期间，由经过培训并有检查培养基灌装瓶污染经验的人员进行逐个目视检查，记录第1天 、第3天、第7天 20～25℃温度下的培养观察结果，和第8天、第10天、第14天30～35℃温度下培养的观察结果。

附： 培养基模拟试验培养观察记录 培养基批号：

7. 验证结果评价

运用微生物污染水平评价无菌模拟灌装试验是否符合生产要求，如果试验结果证明其污染水平超过规定的合格限度，则应立即停止生产，调查并记录污染产生的原因。

原因调查至少应包括如下项：

① 高效过滤器完整性测试及性能测试，环境微生物，悬浮粒子等检测。 ② 人员管理、操作培训情况。

③ 净环系统验证、水系统验证、设备验证及清洁验证等验证情况。 ④ 本次试验异常情况。

调查结束后，质量部会同生产部根据调查所确定的或可能发生的原因，制定纠正或改进方案，报相关部门组织讨论，确定实施方案，并予以实施，然后重复模拟灌装试验三次。 8.验证过程注意事项：

8.1整个培养基灌装过程中需要严格控制丢弃任何已经灌装的培养基，避免将一些潜在污染的可能性也同时丢弃了。任何丢弃都要有充分的理由，并做好相应的记录和解释。即有书面规程可以剔出报废的产品才可以丢弃。

8.2通常所有密闭性完整的容器都应被进行培养并检查。即只要符合最低装量的都不应丢弃

8.3为了评估偏差情况而设计的培养基灌装结果符合要求，也不能因此将偏差或引起偏差的行为看作正常操作。

8.4培养基灌装后应随即对生产设备和设施进行清洗、消毒和灭菌，避免残留培养基造成污染。

8.5每次培养基灌装都应有书面的批生产记录，用于记录生产工艺条件及各种模拟

操作实际完成情况。并对一个整批灌装过程中报废容器数量进行详细说明。 8.6整个培养基灌装必须在质量部门监督下进行，可以在培养基灌装阶段拍摄监控录像以帮助判断整个人员操作和无菌工艺的风险。参与人员应当经过充分培训，没有按照要求参加培养基灌装的人员不能直接参与实际生产。 8.7确定适当的收率及收率平衡标准。 9.发现污染后的处理：

发现任何污染样品均应进行调查。分离到的污染微生物应鉴别到种。调查过程中应详细分析可能的污染原因。此外，任何对于污染的调查都应充分评估其对上一次培养基灌装后生产并投放到市场产品的影响。

此外，不管批次量的大小如何，如果培养基灌装试验出现微生物污染，都是一种不良趋势，预示着污染的风险。因此当培养基灌装出现污染时，不管是否符合合格标准，都必须进行完全的调查，查明问题、制定纠偏措施。如果培养基灌装反复出现污染，即使每次结果都符合标准，也必须采取更严格的防治污染措施，并应考虑再次进行培养基灌装。

10. 评估无菌生产线状态的标准如下：

① 灌装数量低于5000瓶时，不得检出污染。

当有1瓶污染时，需进行调查，并在调查进行再验证。 ② 灌装数量在5000瓶～10000瓶时：

当有1瓶污染时，需进行调查，并应考虑重复培养基灌装 当有2瓶污染时，需进行调查，并应考虑再验证 ③ 灌装数量超过10000瓶时： 当有1瓶污染时，需进行调查

当有2瓶污染时，需进行调查，并应考虑再验证

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