GZUIFR-H49-1菌株的产酶条件优化 外文翻译

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一株新的嗜热毁丝真菌GZUIFR-H49-1的产角蛋白酶

的条件优化

原文来源：J.D. Liang，Y.F. Han，J.W. Zhang et al .Optimal culture conditions for keratinase production by a novel thermophilic Myceliophthora thermophila strain GZUIFR-H49-1．Journal of Applied Microbiology 110, 871–880.

摘要

目标：为了研究培养基成分和培养条件对一株新的嗜热毁丝真菌GZUIFR-H49-1产角蛋白酶产量的影响。

方法和结果：有产角蛋白酶活性的嗜热菌株GZUIFR-H49-1通过形态学分析和ITS1-5.8S-ITS2rDNA 引物进行分子分析，确定其为一株嗜热毁丝真菌。通过单因素实验分析得出，在培养基的成分检测中，淀粉，尿素，硫代硫酸钠，氯化钙分别是最有效的碳源，氮源，硫源和金属离子。通过Plackett–Burman设计得出尿素和pH值是对酶活有罪显著性影响的两个因素。产酶条件通过Box–Behnken 设计进一步优化后，最终使角蛋白酶活性从最初的800U/L提高到5100U/L,得到了6.4倍的提升。

结论：本研究说明，最优化设计能够为培养基和培养条件的优化提供实用且非常有力的工具。嗜热毁丝真菌GZUIFR-H49-1是一株有作为角蛋白酶产业化菌株的能力。

本研究的意义和影响：本研究鉴定了一株有潜力用来得到角蛋白产物的嗜热菌株GZUIFR-H49-1。产角蛋白酶条件的最优化实验和方法为新型真菌的开发和应用提供了思路。

前言

干重中含有80-90%角蛋白的羽毛(Ghosh et al. 2008)是禽类生产工业中的一个主要废物。世界各地每年都会产生几百万吨的禽类羽毛(Szabo et al.2000; De Azeredo et al. 2006)。这种富含角蛋白的废物有很大的潜力作为动物饲料中蛋白质和氨基酸的来源。因为饲料蛋白来源的短缺，禽类羽毛废物已经被作为一种限制性蛋白质饲料来添加到饲料中去。然而，当前的工厂中使用物理和化学方法获得的羽毛粉对环境不友好，还会破坏氨基酸组成，动物难消化，营养品质与产品收益不稳定(Sangali and Brandelli 2000; Mabrouk 2008)。幸运的是，当把来自微生物的角蛋白酶和有角蛋白酶活性的微生物用来降解时，这些问题就可以迎刃而解，从而把废物变为产品(Riffel and Brandelli 2002; Cao et al. 2008)。

角蛋白是最丰富的不溶性结构纤维状蛋白质，也是头发、指甲、角、毛、皮肤和羽毛的主要成分。它不能通过酸、碱等化学试剂和常见的蛋白水解酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等轻松降解的，但很容易被蛋白酶所降解(Balaji et al. 2008; Mabrouk 2008)。角蛋白酶产物通常可以被角蛋白所诱导。在含

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有角质的底物，如羽毛中，有角蛋白酶活性的微生物可以被诱导生成大量角蛋白酶。更有趣的是，角蛋白酶可以广泛应用于农业、工业、生物医学、生物能源和其他领域，例如，饲料、家禽加工、纺织品、皮革、美国进口、化妆品和生物转化的处理等。这种酶可以用于羽毛转化为增值性产品，包括动物饲料、肥料、胶水、薄膜和铝箔等。

可生产角蛋白酶的微生物已发现几种不同的微生物种类，，包括真菌、细菌和放线菌。据报道在真菌中，一大批高产蛋白酶菌株存在于皮肤寄生性真菌和一些其他属中。然而，嗜热真菌的最低生长温度为20℃，最高为50℃，且鲜有报道其可以产生角蛋白酶。与嗜温菌相比，嗜热菌可能会有优势，因为其加速的反应过程和生物量与酶的积累减少了工业活动中污染的风险。从嗜热菌株中得到的酶也往往比那些从嗜温菌中得到的有更大的稳定性。

培养基及培养条件的优化对酶的生产起着至关重要的作用。角蛋白酶生产菌株受许多因素如温度，pH值和培养基中的碳，氮源的性质所影响。此外，这些因素在不同的物种中有不同的影响。所以，就必须优化可以使角蛋白酶超量生产的培养基成分和培养条件。通过y因素设计及响应面分析来优化也是一种获得最佳的工艺条件重要的途径。在本报告中，我们确定和描述一株分离到的新型的可快速生长的有角蛋白酶活性的嗜热真菌，然后通过优化各种培养基及培养条件的响应面方法来提高蛋白酶活性。

1 材料和实验方法

1.1样品收集和菌株分离

本实验中采用的嗜热毁丝真菌GZUIFR-H49-1是从中国四川省绵阳市的辣椒根际土壤中收集和分离到的。先将土样在三角瓶中加无菌水用力摇匀，再将土壤悬液涂布于由羽毛粉作为主要碳源和氮源的M培养基中，37℃中培养。挑取单菌落，涂于PDA斜面事关，4℃保存于贵州大学真菌资源所。

1.2菌株鉴定

1.2.1形态学鉴定

将菌株GZUIFR-H49-1接种在PDA上，35℃生长2.5天后，通过菌落特征，菌丝结构和生长温度来鉴定。

1.2.2分子鉴定

Taq酶和dNTP来自于上海三公公司。将菌株GZUIFR-H49-1在PDA平板上孵化后，取新鲜的菌丝用于DNA 的提取。提取的DNA咋-20℃冰箱保存。ITS 区域包含5.8S rDNA，可以用引物ITS5和ITS4来扩增。第一轮的变性温度为94℃，5分钟，扩增过程需要35个循环，循环中变性温度94℃40s，退火温度为49℃40s，延伸温度为72℃60s，最后一个延伸步骤需要72℃10分钟。PCR产物通过UNIQ-10PCR产物纯化柱进行纯化。

菌株GZUIFR-H49-1的ITS－5.8S-ITS4区域核酸序列同基因库中相近来源的真菌的序列进行对比分析后，对引物进行修改。

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1.3羽毛处理：

鸡的羽毛来自于养殖场的处理废物。首先，将羽毛在1%的清洁剂中浸泡12小时，再用蒸馏水洗涤10-20分钟直至干净。接着，在60摄氏度烘干后，最后粉碎后过一毫米孔径的筛子。

1.4培养基

用于激活的基础培养基含：羽毛粉20；NaCl, 0.5; KH2PO4, 1.0 and K2HPO4, 6.0 at pH 7.5. PDA培养基用于菌种的鉴定和培养。

1.5产酶

菌株接种于装有50ml的液体培养基的250ml锥形瓶中，置于37摄氏度摇床中120转每分钟培养。粗酶液经过滤纸过滤后在8000rpm离心5分钟。

1.6角蛋白酶活测定

酶活测定方法借鉴Anbu等人的方法。称取20mg的羽毛粉，加入9.5ml的0.1mol/l的Tris-HCL缓冲液（pH为7.8），最后加入0.5ml的过滤后的酶液。反应混合物在37°C孵化2 h。孵化后,含10毫升反应混合物的50毫升三角瓶浸入冰水中10分钟,剩下的羽毛粉被过滤掉。随后, 通过微孔膜过滤滤液收集。然后, 在280nm处测量清晰的混合物的吸光度。角蛋白酶的酶活单位表示为一个单位对应与37°C反应 1 h相比在280 nm的吸光度值的增加0.01。数据由三个平行的平均值决定。

1.7确定最佳发酵时间

菌株H49-1接种于BLM培养基中，在发酵的第4，5，6，7，8天的时候分别取样测定酶活。

1.8单因素实验

几种补偿碳源(淀粉、麦芽糖、葡萄糖和甘油),氮源(NaNO3,NH4NO3，NH4Cl 和尿素)、硫源(Na2SO4 ，Na2SO3,Na2S2O3，bME)和二硫苏糖醇(DTT))以及矿物盐(MgSO4.7H2O、氯化钙、CuSO4.5H2O ZnSO4，七水硫酸亚铁)单独添加(碳源20 g/l,氮源0.1%、硫源0.5mmol/l和金属盐0.01%)与BLM培养基中用于H49-1角蛋白酶生产。孵化六天后(培养液中孢子浓度约为 1.2＊10^7每毫升,在37°C,120转每分钟)进行角蛋白酶活的测定。BLM作为空白对照实验。每个实验进行三个平行。试剂(包括淀粉)都是分析纯级,并在当地购买试剂公司。

1.9 Plackett-Burman设计

Plackett-Burman设计法是一种两水平的实验方法设计，它试图用最少的试验次数达到使因素的主效果尽可能准确的估计，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，工进一步研究。PB 法主要通过每个因子取两水平进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性。对在此研究中,Plackett-Burman实验设计的意义是用来对Soliman等人角的蛋白酶生产的方法进行一些修改。为了减小实验误差的值,每组值进行三个平行。sas软件包9.1版本是用于Plackett-Burman实验设计和分析实验数据。

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1.10 Box-Behnken设计

进一步优化改善角蛋白酶活。Box-Behnken设计有三个独立变量,每个变量三个水平和中心的点的三个平行。Box-Behnken设计法，简称BBD，是响应面优化法常用的实验设计方法，适用于2～5个因素的优化实验。每个因素取3个水平，以（－1，0，1）编码。根据相应的实验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程，分析各个因素的主效应和交互效应，最后在一定的水平范围内求出最佳值。用于测定角蛋白酶活的因素符合一个多项式模型：

Y＝b0 t b1X1tb2X2tb3X3tb12X1X2tb13X1X3 tb23 X2 X3 tb11 X12 tb22 X2 tb33 X32

Y是预测响应(角蛋白酶活动)的值,b0截距项,b1、b2和b3线性系数,b12,b13和b23是相关系数,b11、b22 b33二次系数。整个组的实验进行了一组三个平行来求平均响应值。再根据BBD实验得到的拟合方程，可采用绘制出响应面图的方法获取最优值，也可采用方程求解的方法获得最优值。另外使用一些数据处理软件来使结果更方便优化。但响应面分析的得到的是一个预测的结果，需要进行实验来加以验证。sas软件包版本9.1被用于试验设计和回归分析获得的数据。

结果

1 菌株GZUIFR-H49-1的鉴定

研究结果表明,菌株H49-1的表型特征如下。在PDA上快速增长, 在35°C 中生长2.5天达到85毫米,蔓延在整个培养皿中。边缘有毛缘,被丛卷毛或粉状;颜色最初为白色,变成棕色,然后反向白色深棕色。菌丝光滑,0.9-1.8微米或宽3.6 -6.3微米;没有球拍形菌丝。终端和横向分生孢子无柄或为可变长度的短的突起或侧向分支,单独或2-3成链，分枝,光滑或多疣,大多数椭圆形,4.5-8.1 2.3-6.5微米，与基底测量0.5－2微米,孢子形成丰富。没有居间分生孢子和厚垣孢子。H49-1嗜热,生长最低20°C,最佳35 - 40°C和最大55°C。

使用菌株H49-1的序列在基因库中进行查询。密切匹配显示最大为90－98%的是包括嗜热毁丝菌属和其他相关物种。这些物种的序列都是从基因库中检索并进行系统发育分析。R通过DNA 的its1-5.8s-its2序列关系，来分析菌株H49 - 1和相关物种在系统发育树上的关系(图2)。从系统发育树看,它分为进化枝A和支系B。支系B中主要包含的是属毛壳菌属的成员。菌株H49-1不属于支系B,这说明此菌株是相对毛壳菌属的系统发育关系遥远。A的进化枝中主要成员属于棒囊壳属。菌株H49-1是属于(92%)这个进化枝。

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图1 嗜热毁丝真菌H49-1的孢子和菌丝

a 可繁殖的菌丝和成熟的孢子；

b 不同粗细的菌丝；

c 孢子生成处菌丝肿胀;

d 成熟的

表面光滑或有疣的孢子；e 孢子连接处菌丝较细

2 最适发酵时间的确定

在BLM培养基中, 菌株H49-1的角蛋白酶活性分别在4日,5日,6日,7日和8日时可以达到600±26.46,500±30.00,800±51.96,400±26.46和300±34.64 U / l)的水平。所以,发酵的最优结束时间是6天。

图2 发酵时间与角蛋白酶活的关系图。

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6 3 最优碳,氮和硫源和金属盐离子

通过增加不同的补偿的碳、氮和硫的来源培养菌株H49-1后测角蛋白酶活来优化。淀粉为最佳碳源。在添加淀粉的BLM 培养基中孵化后6天后，角蛋白酶活提高到1800 U ／l 。如图4b c 中显示，尿素和硫代硫酸钠，分别可以最高水平的提高角蛋白酶活，与BLM 的培养相比，分别可以增加200和600 U ／l 。但其他氮源和硫源在一定程度上抑制角蛋白酶活动。实验得知氯化钙是最有效的金属盐,角蛋白酶活可增加1600 U ／l 。然而,CuSO4和MgSO4会抑制角蛋白酶活动。

图3 培养基中添加不同来源的碳源（a ），氮源(b),硫源(c)和金属离子(d)对嗜热毁丝真菌

H49-1角蛋白酶活性的影响。

4 筛选Plackett-Burman 设计的重要因素

通过使用Plackett-Burman 统计设计来评估对菌株H49-1最优产角蛋白酶的影响因素。基于单因素实验的结果和以前我们的实验室的工作结果，八个因素被选为实验变量(八个变量，两个水平)应用于Plackett-Burman 设计，如表1中列出。使用sas 软件包对Plackett-Burman 实验的结果进行统计分析后的角蛋白酶活显示在表1。由条件的统计分析可看出,尿素(X2)和pH 值(X6)是(P < 0.05) 在这个实验中角蛋白酶的生产的重要因素。

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7 图4 通过对八个因素两个水平进行PB 实验设计后对进行数据分析的结果。

5 使用Box-Behnken 进一步优化设计

上述实验结果的基础上,考虑到鸡羽毛作为诱导物和碳源角蛋白酶生产、鸡毛、pH 值和尿素被选为三个独立变量,调查他们的互动和影响角蛋白酶的生产应用Box-Behnken 设计实验。设计矩阵和Box-Behnken 设计实验的结果显示在表2。回归模型如下：

Y ＝5266.667 - 25X1 - 162.5X2 - 212 .5X3 - 1058.333 X12 - 175X1 X2?- 575 X1 X3 - 1783.333 X2 – 1633.333 X32

图5 Box-Behnken 实验的设计和响应值；三因素的多元现行回归分析

Y ＝是预测的角蛋白酶活(U ／1);X1 =(g ／l)是鸡毛的浓度;X2 =(g ／1)尿素的浓度和X3 =为初始pH 值。结果由角蛋白酶活的值来衡量。计算回归结果显示中，模型的决定系数R2值为0.9940,这表明,角蛋白酶活性变化观察到的99.40%

可以

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归因于鸡毛的浓度,尿素,初始pH值,这些变量之间的交互影响。确定调整系数Adj.-R2 = 0.9831也是足够高说明高拟合模型的意义。X1为30.08%,并没有显著的概率。X1和X2以及和X3之间的交互,显著性概率> 95%的概率。然而,没有发现X2和X3之间的交互作用对角蛋白酶活回归模型的显著性影响。上述回归模型的拟合响应是绘制在图5。在回归模型中,当鸡毛,尿素和的浓度和初始pH值分别为为20.10 g／1.0g/1和7.9,预测的最大角蛋白酶活可达到5277.38 U／1。通过采用单因素实验，Plackett-Burman和Box-Behnken设计来优化工艺参数,我们可以获得角蛋白酶活从800年5277.38 U／1，约6.6倍的增加。为了证明回归模型的预测值的准确性,在最优的羽毛粉20.10g/1、尿素0.9770 g/1,初始pH值7.933和另一种金属离子(氯化钠5g /1,K2HPO4 6g/1和KH2PO4 1 g/1)的实验条件下进行三个平行,在最优培养基实验中获得的平均角蛋白酶活性是5100 U／1。实验结果表明,潜在的最优值的角蛋白酶活动5277.38 U／1基本符合实验值5100 U／1。

讨论

微生物角蛋白酶生产会受到培养条件和培养基成分的影响,如温度、pH值、碳和氮的来源,尽管这些因素对不同的物种有不同影响。因此,选择和优化培养条件和培养基成分对于利用微生物生产角蛋白酶是非常重要的。通过研究碳源对嗜热毁丝真菌H49-1在角蛋白酶生产的影响表明,这些补偿的碳源能够促进角蛋白酶生产。淀粉是角蛋白酶生产最有效的补偿的碳源。然而,这些影响是不适用于所有微生物。例如,培养基中补充糖(木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇) 对生产角蛋白酶有负面影响的的真菌如短帚霉。类似的结果在地衣芽孢杆菌的研究中也有报道。这些结果表明,碳源对角蛋白酶生产的影响与所检测真菌物种密切相关。与一些单糖或双糖相比，淀粉可以更有效地促进角蛋白酶生产。例如,淀粉是一个可以有效增加角蛋白酶活的底物。

大多数氮的来源,比如、酪蛋白、大豆,明胶,丙氨酸,NH4NO3和NH4Cl, 在生产时添加到培养基中可以抑制角蛋白酶的活性。但是，在我们的实验中尿素是积极的氮源,这表明角蛋白酶生产中，尿素是一种有效的补偿的氮源。这一结论部分文献也有过报道。

到目前为止,只有很少的报道中有报道用硫源来影响角蛋白酶的生产。在我们的实验中,硫化物对角蛋白酶生产有一定的影响。在我们的测试中不同硫源里，硫代硫酸钠是一个唯一的可以增加嗜热毁丝真菌H49-1的角蛋白酶产量的补偿的硫源。但在lin等人的研究中有研究结果。在他们的研究中,巯基乙醇, Na2S2O3和Na2SO4作为高效催化剂可以促进来源于链霉菌属的角蛋白酶分解角质的底物。然而,硫代硫酸钠会抑制强烈的角蛋白底物的分解。这些研究结果表明硫化物对角蛋白酶分解底物的影响，会依赖于产这些角蛋白酶的微生物的种类。

在这项研究中,金属离子钙离子能显著增加角蛋白酶活动(2.13倍高于对照组)。这个结果与先前别人的报道相符。这表明Ca2 +是一个对角蛋白酶生产有促进作用的离子。锌离子对菌株H49-1的角蛋白酶生产的会有积极的影响,但其他一些研究人员的研究则表明锌离子是不重要的或对短帚芽孢杆菌等真菌的角蛋白酶产量有负面的影响,这些结果暗示了来源于不同微生物的角蛋白酶可能有不同的酶学属性。

使用多变量实验设计技术,如Plackett-Burman和Box—Behnken设计, 在许多微生物培养物的优化中的应用越来越普遍。然而,通过对嗜热真菌培养基成分和培养条件的优化来获得角蛋白酶却很少报道。在本篇报道中,培养基和培养条件

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对嗜热毁丝菌属的角蛋白酶生产的影响属首次报道。对于嗜热毁丝菌株H49-1的培养基成分和培养条件的优化，从而获得了高角蛋白酶活性的实验表明多元实验设计技术是一种有用且强大的工具，在以后对于利用嗜热真菌进行角蛋白酶生产有很大作用。

致谢

此研究得到了国家自然科学基金的支持(30670010和30670010号)。我们感谢R.T.V.福克斯博士修改此手稿。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/p01q.html