2022年(生物科技行业)微生物化验室的检查指南

（生物科技行业）微生物化验室的检查指南

微生物化验室的检查指南

I简介

质检化验室的检查指南重点强调了有关化学分析方面的内容，对于微生物检查的内容涉及比较少，本文将作为化验室检查中对微生物检查方面的指南。对于任何壹次质检室的检查，我们都建议需要有熟悉这方面知识的分析学家或者微生物学家参和检查。

II非无菌药品的微生物检测

由于种种理由，我们发现壹些外用制剂、滴鼻剂和吸入剂会产生微生物污染的问题。但USP中有关微生物检测的章节<1111>对此方面只提到了“对于非无菌药品的微生物特性，应根据产品用途、产品特性以及对使用者产生的潜在危害进行评价”。USP建议对某些种类的药品应进行微生物污染总数及微生物鉴定方面的检测。例如，对植物药、动物药和某些矿物药应进行沙门氏菌的检测，对口服液应进行大肠杆菌的检测，对外用制剂应进行绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的检测，对供直肠、尿道或阴道用的制剂应进行酵母菌和霉菌的检测。在药典的壹些各论中也包括了特定的微生物限度要求。

作为药品微生物污染可接受水平和类型的总指南，FDA药物局的Dunnigan 博士对微生物所产生的健康危害作了评论。在1970年，他指出使用被革兰氏阴性菌污染的外用制剂会产生中度到重度的健康为害。通过文献的报道及我们的调查发现，多种感染都和外用制剂的革兰氏阴性菌污染有关。最典型的例子就是几年前在麻萨诸塞州的壹家医院发生的洋葱假单胞菌污染聚维酮碘事件。

因此，每家X公司都应该为他们的非无菌药品制定微生物限度标准。USP微生物限度章节<61>也提供了检测壹些微生物的方法，但且不包括所有的致病菌。例如，在外用制剂或者滴鼻剂中如存在大量的洋葱假单胞菌会对人体产生危害，

可是，在USP中却未能提供鉴别该微生物的方法。

有关这个问题的相应例子仍有对间羟异丙肾上腺素吸入剂的召回事件。USPXXII专论中规定对这种产品不需要进行微生物检测。但FDA将被唐菖蒲假单胞菌污染的间羟异丙肾上腺素吸入剂作为I类召回。不良反应评估指出这些污染菌对肺部感染的风险非常大，且且对患有慢性阻塞性呼吸道疾病、囊肿性纤维化和免疫功能低下的病人具有潜在的生命威胁。然而，药典中有关微生物限度检测章节中介绍的方法且不能检测出这种细菌。

现行的USP微生物限度章节<61>规定微生物检测要进行复测，可是当下也有人建议应取消这壹规定。和其他检测壹样，对初测的结果应进行回顾和检查。微生物污染不会均匀的分布在壹批产品或取样的样品中，在壹个样品发现微生物，而在另壹个样品中没有发现微生物且不会对最初的检测结果产生影响。复测的结果应进行回顾和评价，可是更应该强调复测方法的基本原理和合理性。

为了分离出产品中的微生物，FDA实验室和许多药品生产企业的实验室壹样，采用壹些含有抑制剂如吐温或卵磷脂的培养基。这种培养基能使产品中的防腐剂失效，且能为已受损的或生长缓慢的微生物细胞提供更好的生长环境。其它壹些生长参数如较低的培养温度和较长的培养时间（至少5天）也能为受损细胞和生长缓慢的细胞提供更好的生长环境。

例如，FDA实验室采用《细菌分析指南》第6章中的化妆品检测方法来鉴别污染非无菌药品的微生物。这种方法包括在改良的letheen肉汤中进行微生物的聚集。经培养后，在血琼脂和麦康凯琼脂培养皿中作进壹步的鉴别。这个鉴别方法要求FDA的微生物学家对所有潜在的致病菌的复苏进行最优化处理，且对复苏后的微生物进行计数和分类。这种方法的另外壹个重要的作用就是用来确定在

所有使用的培养基中微生物的生长特性。

选择合适的中和剂很大程度上决定于产品的防腐剂及处方组成。如果在增菌培养肉汤中有菌落生长，那么应将该菌落转移到更具有选择性的琼脂培养基或者合适的增菌琼脂中继续培养，这对于接下来的微生物鉴别是很有必要的。

微生物检测应包括对细菌总数测试中发现的菌落进行鉴别，而且，这种鉴别应不仅仅局限于USP规定的鉴别方法。

对细菌总数测试和增菌测试中发现的菌落数进行鉴别的重要性取决于产品本身及预期用途。如果在检测口服固体制剂如片剂时，能够允许在微生物污染水平较高时才进行微生物的鉴别。可是，对于其它制剂，如外用制剂，吸入剂或者滴鼻剂，壹旦在细菌总数测试和增菌测试中发现有菌落存在，就应该立即进行微生物鉴别。

Ⅲ设施、设备和培养基

检查开始前应对分析方法进行回顾，且检查用来培养微生物的培养皿和试管（对防止培养皿和试管被微生物污染应有警示说明）。要特别值得注意的是，复测项目是否形成文件，对微生物污染调查中的特殊项目是否确定。这些内容在回顾阳性结果的分析过程（产品因素或环境因素）都应该进行评价。应该要求对前壹天的培养皿和培养基进行观察，且和之前的记录进行比较。对用于灭菌的压力蒸汽灭菌锅进行检查。压力蒸汽灭菌锅不能将蒸汽替代为无菌过滤空气，因此，对于密封的瓶装培养基来说，这是没有问题的。可是对于非密封性的培养器皿来说，非无菌空气就有可能会污染培养基。另外，灭菌时间少于规定时间也会使培养介质灭菌不彻底，引起检测结果的假阳性。这些问题在工作量大的实验室中是普遍存在的。

过热会引起培养基中的营养物质变性或烧焦，因此应对压力蒸汽灭菌器的温度进行检查。温度应低于上述强调的微生物的最佳复原温度。对于假阳性结果的出现，最明显的问题就是不能区分这个结果是由操作疏忽导致的微生物污染引起的仍是由样品的实际污染引起的。

IV无菌检测

在1991年11月10日，FDA公布了壹篇有关无菌生产制剂和最终灭菌制剂生产的议案。其中列举了壹些无菌生产，但受到污染或者有可能被污染，后来被召回的壹些制剂的名单。大多数对这些召回产品的调查都是从最初的无菌检测失败开始的。FDA对厂家的生产、质量控制、调查和失误的调查，以及产品质量事故的证据（无菌检测失败），最终导致了产品的召回。

USP指出对待用于做无菌检测的设施应和用于生产的设施相同。USP中提到“和无菌生产的设施壹样，用于无菌检测的设施也应进行微生物挑战试验和尘埃粒子监测”。对无菌检测设施的设计应考虑到洁净服和缓冲间。环境监测和洁净服应和产品生产的相壹致。

由于在做无菌检测过程中要处理大量的产品和培养基，我们建议应实地检查无菌检测的操作，不过许多X公司都会以当场操作会引起操作人员紧张为由阻止检查。检查组应该特别注意那些会对正常的操作环境产生破坏的操作，虽然这些方面仍不足以使这部分的检查不合格。

检查无菌检测过程的壹个重要方面就是检查初次实验中结果为阳性的那些记录。索要壹份阳性结果检测的清单有助于检查生产和控制记录以及调查报告。对那些高风险的无菌灌装制剂，尤其要检查检测结果为阳性的批次及对此展开的

调查研究记录。当无菌灌装制剂的初次检测结果为阳性时，生产厂家如不能确定是由无菌检测控制过程引起的，那么是很难确保能够将产品正常放行。

应检查使用阴性对照的过程。阴性对照对于无菌检测来说是很重要的。阴性对照最好是采用已高温灭菌或辐照灭菌的样品作为对照组。或者，也能够采用在培养基灌装过程中灌装安瓶或小瓶的方法。

要特别注意那些生产无菌灌装制剂却从来没有出现过初次无菌检测阳性结果的厂家，因为这种情况是很少见的。如果真的出现这种情况，那么他们的记录很有可能是伪造的。同样，无阳性结果也有可能是该检测方法未对产品或防腐剂本身对细菌的抑制作用进行验证。

应检查自动操作系统或者隔离系统，如LaCalheneX公司的无菌隔离系统。这些设备能够达到无人操作。如果在这种系统中操作的无菌检测结果仍为阳性，那么即使通过复验也很难将产品放行，尤其在阴性对照试验结果为阴性的情况下。

应对样品的培养时间进行评价，有关这个方面的规定最近刚被确实。USP 规定无菌检测样品至少要培养7天，有人建议将时间延长至14天。样品培养时间的长短应该由产品的性能和无菌检测的方法决定。7天有可能是不够的，尤其是当有生长缓慢的菌存在的时候。应对培养基灌装、检测环境、和无菌测试的结果进行回顾，确保不存在生长缓慢的细菌。同样，要对细菌培养的方法进行比较，确定是否符合经核准的或待申请的列表上的方法。

V方法学和验证

要明确无菌检测方法的出处。生产厂商会参考许多种方法，包括USP，BAM 和其它微生物参考资料。实际上是不可能对所有的致病菌的检测方法都进行完全的验证。不过，检测方法最好要确保样品中的抑菌剂能被中和。

在检查过程中，也包括批准前的检查，应对微生物检测的方法学进行评价。例如，检测方法应能鉴别出洋葱假单胞菌或其他假单胞菌等致病菌属。在进行批准前的检查时，应将现场使用的方法和企业申报资料时所报的方法进行比较。同时也要确认实验室是否有做这些实验需要的设备，这些设备是否可用，在做实验的期间的状态是否良好。

USP规定能够采用其它方法代替药典中规定的方法，可是要经过详细的验证证明俩种方法具有等同性或者比规定的方法更好。

在制备培养基时会使用到脱水的培养基，应对制备好的培养基定期做微生物挑战试验。其中包括USP中的微生物指示剂，仍有正常菌种。培养基的制备过程、灭菌（过热）过程和储存过程都会影响到培养基培养微生物的能力。这些问题在检查时都应引起重视，同时对于壹个管理良好的微生物实验室来说，也应充分考虑到这些因素。

VI数据存储

微生物测试结果能够写在实验日志或者活页纸上，且进行分析。不过壹些生产企业不能提供表格、汇总或者其它反应微生物测试结果的打印物，在进行鉴别潜在存在的微生物问题时这些数据是要用来作回顾分析的。当数据的汇总没有时，检查组应检查足够多的数据对实验室的检测结果和质量控制进行汇总评价。

壹些实验室利用预先打印好的表格来记录测试数据，检查过程中也有实验室指出只能在单个的批记录里才能见到微生物检测数据。然而，大多数情况是，预先印好的表格有很多复印件。壹些企业采用日志本的方式来记录数据，对这些日志本也应进行检查。

另外，许多企业仍配备了自动化的微生物鉴别系统。这类系统所进行的测试及鉴别的日志对于处理潜在微生物问题时也是很有用处的。

非胃肠道给药制剂的生产厂家常常会采用这种自动化的微生物鉴别系统，这类系统能够和环境、水处理系统、验证和人员进行有效隔离。（这句话翻译不确定）

巴尔的摩实验室的微生物学家是使用自动化微生物分析系统的专家。他们是首批使用此类设备的FDA实验室，且且在对这些仪器的验证上有丰富的经验。对于这类分析系统的信息和问题能够直接联系巴尔的摩的实验室。如有些厂家使用大型的这类设备，就应该派巴尔的摩的实验室的人员参和检查。

VII质量管理

分析和解释微生物检测数据是确定检测结果中比较困难的壹个方面，要求在微生物学方面有很丰富的知识和经验。要理解微生物检测的方法，更重要的是要理解该方法存在的局限性，而这往往又是难度比较大的。例如，生产厂家发当下天然药物的口服制剂中存在较大量的阴沟肠杆菌，由于他们没有检测出大肠杆菌，就将该批药品放行了。FDA检测时发当下这批的大多数样品中发现阴沟肠杆菌，在壹个样品中甚至发现了大肠杆菌。在这个案例中，该企业没有认识到微生物的污染是不均壹的，微生物测试方法是存在缺陷的，而在做鉴别测试时，其

它微生物的存在会掩盖特定的微生物。检查时应了解样品中发现的微生物和可能存在的致病菌的关系。例如，如果操作过程中有阴沟肠杆菌存在，那么也有可能会存在指示剂能检测出的致病菌存在。生物学家应考虑壹些因素如方法学、微生物在样品中的生长状态、其它的壹些和微生物分析有关的基础性因素来评价这些潜在的因素。

应评价外部委托实验室的管理程序来审计他们的工作质量。

VII．委托检测实验室

许多生产厂家会委托私人或者独立的实验室进行微生物检测。由于这些实验室只仅限于完成厂家要求的项目，因此要确定壹份给委托实验室的特定的操作要求。应评价这些要求能保证必要的测试都能够进行。例如，在最近壹次检查中，产品为局部外用药，要求做的检测项目为细菌总数和USP规定的指示微生物测试。委托实验室就只做了这些测试，却没有从产品的预期用途出发寻找有可能存在的其它致病菌。

对分析结果尤其是那些有额外测试或者复测的项目，应该进行回顾。检测后应提供检测报告。不论检测结果是不合格的仍是合格的，如果被委托实验室不能提供完整的测试结果，这也是正常的情况。（字面意思好像是这样，可是好像不符合逻辑）

委托实验室或者生产厂家必须进行抑菌/抑真菌测试。这些测试结果必须为阴性，否则任何无菌测试的结果都是无效的。

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