实时定量PCR中的常见问题及解决办法
更新时间:2023-09-04 06:10:01 阅读量: 教育文库 文档下载
对实时定量PCR实验中遇到的常见问题总结。
实时定量PCR中的常见问题及解决办法
1、反应后无扩增曲线出现
1)确认程序中是否设置了信号采集步骤:两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
2)扩增效率问题:电泳检测realtimePCR反应产物,观察是否有正确大小的目的条带出现。如果没有,则逐一排查引物、模板以及反应条件问题。
3)循环数不够:一般可设置循环数为40。
2、Ct值出现太晚
1)模板浓度过低或模板降解:重新制备模板再进行实验。
2)扩增效率低:优化反应条件,或者重新设计PCR引物。
3)PCR产物过长:一般设计为100-200bp即可。
4)反应体系中含有抑制剂:常在模板质量不高时出现,重新制备模板或将模板稀释后使用。
3、扩增曲线形状异常
1)扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
2)扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高,基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct值- 4),重新分析数据。
3)个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
4、阴性对照出现扩增曲线
1)阴性对照在35个循环以后出现扩增曲线很有可能是因为出现引物二聚体,属于正常现象。可通过融解曲线分析进行判断。
2)反应体系被模板污染:更换水、反应试剂、引物。
5、标准曲线线性关系不佳
1)加样误差:将模板稀释,扩大体积是一个有效的解决办法。
2)标准品降解:重新制备标准品。
3)模板浓度过高:稀释模板重新实验。
6、实验重复性差
1)加样误差:将模板稀释,扩大体积是一个有效的解决办法。
2)模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差。适当增加模板量。
3)仪器误差:不同的孔温度控制不一致也会导致重复性差的问题。请专业人员对仪器进行校准。
7、融解曲线出现多峰
1)引物非特异扩增:重新设计引物,优化扩增条件。
2)引物浓度太高:引物浓度过高容易引起扩增条带弥散。适当降低引物浓度。
3)cDNA模板基因组DNA污染:重新制备cDNA。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理。
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