纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA的检测

利用两组探针修饰的微粒：(1)表面标记有可与待测乙肝病毒(HBV)DNA另一端结合的纳米金探针1(信号探针)以及可与信号探针部分结合的纳米金探针2(检测探针);(2)表面标记有可与待测HBVDNA一端结合的磁珠探针(捕捉探针1)。检测靶HBV DNA时,磁珠探针与信号探针在液相中可分别与HBV DNA靶序列一端结合最终形成三明治样结构。再以磁场将三明治样复合物从反应液中分离,以DTT溶

第3 8卷21 0 0年 8月DOI 0 3 2 S J. 0 6. 0 0 0 1 3:1 . 7 4/ P. 1 9 2 1 . 1 3

分析化学 ( E X A U )研究报告 FN I HU X EC ieeJ u a f ayia h mi r hn s o r lo lt lC e s y n An c t

第 8期l 3~ ll 13 38

纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒 D NA的检测汪毅毛红菊臧国庆张宏莲金庆辉赵建龙2(中国科学院上海微系统与信息技术研究所，上海 2 0 5 ) 00 0

(上海交通大学附属第六人民医院，上海 20 6 ) 0 0 2

摘

要

利用两组探针修饰的微粒： 1表面标记有可与待测乙肝病毒 ( B () H V)D A另一端结合的纳米金探 N

针 1信号探针 ) (以及可与信号探针部分结合的纳米金探针 2检测探针 ) ( ) (;2表面标记有可与待测 H V D A B N一

端结合的磁珠探针 (捕捉探针 1。检测靶 H V D A时， ) B N磁珠探针与信号探针在液相中可分别与 H V D A B N

靶序列一端结合最终形成三明治样结构。再以磁场将三明治样复合物从反应液中分离， D Y溶液将信号以 T

探针从纳米金颗粒上洗脱。洗脱后的信号探针数量反映靶基因的多寡，信号探针一段与预先点样的基因芯片上的捕捉探针 2结合，检测探针与信号探针另一段相结合，后用银染液将检测探针显色从而得到靶目标最 D A相对定量信息。结果表明， N本检测方法的检测灵敏度达到 1 mo L水平。检测时间少于 15h检测 0 l/ .,结果与 H V D A水平呈现较好的线性关系且无假阳性结果； B N本方法有望用于乙肝病人血清中 H V D A的 B N快速筛测及其它微生物基因的检测。 关键词乙肝病毒 D A;米金探针；物条形码扩增；米探针芯片 N纳生纳

1引言 乙型肝炎是乙肝病毒 ( B所引起的一种传播快、 H V)潜伏期长、害广的传染病，我国慢性无症状危H V感染者或慢性无症状 H V携带者已超过 1 2亿， HB B B .是 V感染者中存在数量最大的群体。采用有

效的指标和方法实现早期诊断和病情监测对于控制传播、断预后和指导用药都有重要意义…。判 P R一直是临床上检测 HB N C VD A的主要方法，具有较高的特

异性和灵敏度，却存在依赖酶促反但应，所用试剂较为昂贵且不易保存，所需周期长和易污染，应完毕后对其扩增的靶基因较难定量的反缺点。近年来，荧光定量 P R试剂盒开始用于临床检测 HB灵敏度高，量分析效果好。其中， C V,定 S B re Y R G en法不需要设计特异性探针，成本较低，但易产生假阳性结果。而 T q n探针法有着的特 a Ma异性较好，应用时需设计与目标序列互补的荧光探针 J但。基因芯片技术在医学各个领域中的应用日益广泛 '。但现阶段芯片检测的灵敏度不够高，检在

测核酸时低于 P R扩增的灵敏度； C其次基因芯片检测技术一般采用荧光标记探针技术，配套昂贵的需

仪器来阅读和分析杂交信号，存在着系统成本遗高，灵敏度低等问题；限制了基因芯片技术的应用]。近年来，于纳米材料的分子检测技术已被用于病原体和肿瘤相关 D A检测 01、白检基 N 11蛋，]测¨ H以及 m co N irR A检测。纳米材料尤其是金纳米颗粒 ( odn np rce, u P )具有很好的 G l a o at l A N s, i s

生物相容性和较大的比表面积，金纳米粒子表面可以标记大量的生物活性分子 (核苷酸探针或是蛋寡白分子 ) hn。。Z ag等 将固定于金电极表面的探针 D A分子与靶分子结合，加入与靶分子结合的 N再纳米金探针，成夹心结构，形通过伏安法测定修饰在纳米金上的六氨合钌的氧化还原电流，以识别和可测定溶液中互补的靶 D A,成了具有纳米金放大作用的 D A电化学生物传感器；直接以硫化铅 N制 N或( b )微粒和靶分子杂交，合微分脉冲溶出伏安技术 ( P S测定 P n, PS超结 D A V) b从而间接判断靶分子的杂交

情况。但是上述电化学方法检测灵敏度仍不够高；探针用量大，杂交过程繁琐，专门仪器读取结且需果，限制了该方法的应用。Mi o等运用比色法检测靶 D A的存在， z u引 N结合了靶 D A的纳米金探针 ( N末

端完全互补 )在一定的盐离子浓度下会聚集。但其检测灵敏度不高，能检测 5 50 m LL的目标只 O 0 o/D A分子。本研究基于 M

ri¨ N i n等开发的 B A技术，纳米金颗粒标记的探针结合基因芯片方法用于 k C将2 1 -1 2收稿；0 00 -3接受 0 00 - 0 2 1-22本文系国家卫生部重大专项 ( o. 0 9 X104 15 2 0 Z 10 43 1和上海市科委项目( o.0 5 n 0 70, 9 R 4 7 0 ) N s 2 0 Z 0 0—0, 0 9 X 0 0 -0 ) N s 9 2 m 5 0 0 Z 13 80资助 Ema:j o m i s .cc— i hma@ al i a.a l .r e

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