TCID50和PFU的换算公式

1、PFU:plaque forming unit，空斑形成单位：感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。因此建议也可使用TCID50法。

2、MOI :multiplicity of infection，感染复数：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。

然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。其公式为：

P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。 其中：

P 为被感染细胞的百分率 P(0)为未被感染细胞的百分率 m为MOI值

例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则： P(0) = 1% = 0.01

m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。

(一) 原理 病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向

周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病

毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×103 ，则病毒原液的滴度为： 58÷0.2×2.5×103 ＝7.25×105 (PFU/ml)

PFUs＝0.7×TCID50的滴度

(二) 技术应用 蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。

1.病毒生物学纯化 (Virus biological purification) 在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时, 有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒, 亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化, 必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度,一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。

2.蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test) 蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少 50％的血清稀释度作为其中的效价。 试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作, 接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37 ℃二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。 （由于本试验的操作比较繁锁，目前在国内极少应用,国际上也没有把它作为一种各国都接受的诊断方法，仅在OIE国际动物卫生法典(第六版)中列为对裂谷热的规定诊断方法之一。） (三) 操作实例

1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或纯化

(1) 于55mm直径的灭菌塑料培养皿中培养绿猴肾细胞(Vero)，使形成单层。细胞培养时间约3－4天，接种量约为2 000 000/ml个细胞？。选取单层细胞全部覆盖，不留有空洞的培养皿用作试验。

(2) 用细胞培养液对AKV病毒作10倍倍比稀释至10-7并保存于4℃。

(3) 每个稀释度的病毒液接种3个平皿。

(4) 接种前弃去细胞培养液,用5mlPBS或细胞培养液冲洗单层细胞,然后弃去冲洗液。 (5) 每个平皿分别加入0.2ml病毒稀释液，对照组只用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱吸附一小时，每15分钟摇动一次，以便使病毒均匀分布。 (6) 按第4步骤冲洗未被吸附的病毒。

(7) 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5％琼脂(预热)中，每个平皿加入7ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养约2天，平皿需倒置。

( 8)取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的2％琼脂(预热)中，每个平皿加入5ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱中培养至次日。

(9) 结果计算 求每组三个培养皿的蚀斑平均数，组间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律 (即若10-2组平均100个蚀斑，则10-3组平均应在10个左右)，否则应考虑重新试验。以平均蚀斑数乘以病毒稀释的倍数再乘以5，即为每毫升病毒原液的蚀斑数。 (10) 选取特征性的若干蚀斑，分别以弯头吸管在琼脂层下吸取蚀斑以收获病毒，然后分别接种到预先制备的单层细胞培养瓶中进行增殖或传代。 (11) 本试验采用BHK21细胞，可应用于牛流行热病毒(BEFV)。

2.蓝舌病病毒(BTV)血清型鉴定试验(纸片法)

(1) 抗体纸片制备

① 取已知各种血清型毒株以1×107蚀斑形成单位接种绵羊, 接种后3-4周采血分离血清。

② 制备直径0.5mm的中性滤纸片，121℃15分种灭菌后保存于干燥环境。

③ 取上述滤纸片浸入不同血清型的免疫血清后真空冻干, 保存于4℃冰箱备用，使用前以灭菌水湿润。 (2) 病毒接种

① 用直径6cm的塑料培养皿培养BHK21或Vero细胞使成单层。 ② 以103PFU/0.2ml被检蓝舌病病毒接种于细胞上, 吸附1h。 ③ 洗去未被吸附的病毒，弃去洗液。 (3) 覆盖琼脂

① 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5％琼脂，每个平皿加入7ml，置平台冷却凝固。

② 在琼脂面上按梅花形图案放上不同型的血清滤纸片, 并做好记号。 ③ 把平皿放置在37℃二氧化碳培养箱培养2天。

④ 真空吸出平皿中的滤纸片。

⑤ 取2倍浓缩的细胞营养液加入等量的2%琼脂，每个平皿加入5ml，重新置37℃二氧化碳培养箱培养2-3天, 待明显蚀斑抑制环出现。

(4) 结果判定 出现明显抑制蚀斑形成(即滤纸片位置下仍保持活细胞被染色)的免疫血清即为该被检病毒的血清型。

注：本试验方法同时可应用于鹿流行性出血病病毒(EHDV) 与蓝舌病病毒(BTV)的鉴别。

3.新城疫病病毒(NDV)分离

(1) 取疑似患病禽的组织用细胞培养液匀浆,离心沉淀后取上清液。 (2) 用16孔微量培养板制备鸡成纤维原代细胞。

(3) 细胞长成单层后吸去培养液，向每孔滴加0.1ml被检病料, 置37℃吸附2小时后弃残液。

(4) 制备1％琼脂的BME，置40－50℃水浴待用。

(5) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成覆盖层。 (6) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。

(7) 制备含0.002％中性红的1%琼脂的BME，置40－50℃水浴待用。

( 8)吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成第二覆盖层。 (9) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。 (10) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。

注：本试验方法在样品中病毒含量少的情况下比单纯用细胞培养分离要敏感。

4.试验用各种成份的配制

(1) 细胞营养液(用于稀释病毒) ：10倍199保存液 ：4ml 犊牛血清 ： 0.8ml

3%碳酸氢钠 ： 2.4ml

双蒸水 ： 32.8ml ，40ml (2) 两倍浓缩细胞营养液(配制首层琼脂用) ：10倍199保存液：20ml

犊牛血清 ： 4ml

3％碳酸氢钠 ：12ml

1％二乙氨基乙基(DEAE) ：10ml(可选择) 双蒸水 ：54ml ，100ml (置40－45℃水浴备用)

(3) 1.5％琼脂 ：精制琼脂糖 ：1.5g

双蒸水 ：加至100ml

(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃水浴备用。)

(4) 含中性红两倍浓缩细胞营养液(配制第二层琼脂用) ：

10倍199保存液 ：20ml 犊牛血清 ：10ml 3％碳酸氢钠 ：12ml 0.5％中性红 ：6ml 双蒸水 ：52ml ，100ml (置40－45℃水浴备用)

说明：在第二层琼脂中，中性红的最终浓度应为1:5000－1:10000。 (5) 2％琼脂 ：精制琼脂糖 ：2g

双蒸水 ：加至100ml

(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃水浴备用。)

定血清－稀释病毒法(病毒中和试验) 1.病毒毒价的测定 毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位，过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，

半数致死量(LD50)作为毒价测定单位即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。

用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量 (EID50)。

用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。

在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。

(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。

测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3 000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10-1、10-2、10-3 ……10-9，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。

表2-24 LD50的计算（接种剂量为0.03ml）

病毒稀释度 接种鼠数 活鼠数 死鼠数 积累总计 死亡比 死亡率 (%)

活鼠 死亡 10-4 5 0 5 0 15 15/15 100 10-5 5 0 5 0 10 10/10 100 10-6 5 1 4 1 5 5/6 83 10-7 5 4 1 5 1 1/6 17 10-8 5 5 0 10 0 0/10 0 10-9 5 5 0 15 0 0/15 0

LD50的计算：按Reed和Muench氏法计算。

高于50%的死亡分数-50% 83%-50%

距离比例= ──────────────────── = ────── = 0.5 高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数 83%－17% LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数

本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。代入上式：

LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.5 则LD50=10-6.5，0.03ml，即该病毒作10-6.5稀释，接种0.03ml能使半数小鼠发生死亡。 注意：稀释血清法中和试验，计算TCID50或LD50，MID50时，计算公式应改为：TCID50的对数=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数。 如按Karber氏法计算，其公式为：

IgLD50（或TCID50）=L+d(S－0.5)

L为病毒最低稀释度的对数，d为组距，即稀释系数，S为死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，S=1+1+5/6+1/6=3 IgLD50=－4+(－1)×(3－0.5) =－6.5

则 LD50=10-6.5，0.03ml

注意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，S应为保护比值之和。

(2)EID50的测定（以新城疫病毒为例） 将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成

10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度，分别接种9-10日龄鸡胚尿囊腔，鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.2ml，每个稀释度接种6只鸡胚为一组，以石蜡封口，置37-38℃培养，每天照蛋，24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置4℃保存。连续培养5天，取尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性，记录结果，按上述方法计算 EID50。

(3) TCID50的测定（以致细胞病变病毒为例） 取新鲜病毒悬液，以10倍递次稀释成不同稀释度，每个稀释度分别接种经Hank’s液洗3次的组织细胞管，每管细胞接种0.2ml，每个稀释度接种4只细胞管，接种病毒后的细胞管放在细胞盘内，细胞层一侧在下，使病毒与细胞充分接触，放置37℃吸附1h，加入维持液，置37℃培养，逐日观察并记录细胞病毒管数，按上述方法计算TCID50。

2.中和试验

(1) 病毒稀释度的选择 选择病毒稀释度范围，要根据毒价测定的结果而定，如病毒的毒价为10-6，则试验组选用10-2－10-8对照组选用10-4－10-8其原则是：最高稀释度要求动物全存活（或无细胞病变），最低稀释度动物全死亡（或均出现细胞病变）。 (2)血清处理 用于试验的所有血清在用前须作56℃30min加温灭活。但来自不同动物的血清，灭活的温度和时间也是不同的。

(3)病毒的稀释 按选定的病毒稀释度范围，将病毒液作10倍递次稀释，使之成为所需要的稀释度。

(4）感作 将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内，第一排每管加入与病毒等量的免疫（或被检）血清作为试验组；第二排每管加入与免疫（或被检）血清同种的正常阴性血清作为对照组；充分摇匀后放37℃感作12h。

(5) 接种 按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物（或鸡胚、组织细胞）。观察持续时间，根据病毒和接种途径而定。

中和指数据计算 物按Reed和Muench两氏法（或Karber）法分别计算试验组和对照组的LD50（或EID50、TCID50） 试验级LD50 (EID50、TCID50)

中和指数 = ──────────────────

对照组LD50 (EID50、TCID50)

假如试验组LD50为10-2.2，对照组LD50为10-5.6。则中和指数为103.3，103.3=1 995，也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大1995倍。

(7)结果判定 固定血清―稀释病毒法进行中和试验，当中和指数大于50，表示补检血清中有中和抗体；中和指数在10-50为可疑；若中和指数小于10为无中和抗体存在。

固定病毒-稀释血清法（血清中和试验） 1.病毒毒价的测定（微量法）

(1) 病毒的制备 将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变（CPE）达75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。

(2) 病毒毒价测定 取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10-1，10-2，10-11……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5%CO2温箱37℃培养，从48-14h逐日观察细胞病变，记录结果。

按Reed和Muench两氏法计算TCID50。 56%-50%

距离比例 = ──────── 56%-33%

本例高于50%病毒稀释度的对数为－6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为－1。 表2-25 TCID50计算（接种剂量50μl）

病毒稀释度 接种数 CPE数 无CPE数 累 计 CPE率 百分数(%) CPE 无CPE

10-2 8 8 0 39 0 39/39 100 10-3 8 8 0 31 0 31/31 100 10-4 8 7 1 23 1 23/24 96 10-5 8 5 3 15 4 15/19 79 10-6 8 4 4 10 8 10/18 56 10-7 8 4 4 6 12 6/18 33

10-8 8 2 6 2 18 2/20 10

10-9 8 0 8 0 26 0/26 0 IgTCID50 = －6＋0.26×(－1) = －6.3

则TCID50=10-6.3，50即病毒作10-6.3稀释，每孔接种50μl，可使半数组织细胞管发生病变。 2.中和试验

(1) 血清的处理 动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃。加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。

(2) 稀释血清 取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。

(3) 病毒 取－70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCID50稀释（与等量血清混合，其毒价为100TCID50）。如本例病毒价为10-6.3，50μl。所以应将病毒作2×10-4.3稀释。

(4) 感作 每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。

病毒与血清混合，0℃下，不发生中反应，4℃以上中和反应即可发生。常规采用37℃作用1h，一般病毒都可发生充分的中和反应。但对易于灭活的病毒可置4℃冰箱感作，根据不同耐热性的病毒感作温度和时间应有所不同。

(5) 加入细胞悬液 在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置5%CO2 37℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，14h终判。

由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。

设立对照 为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进行该种病毒的中和试验时，尤为重要。

阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变。

病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照相馆，先将病毒作0.1、1、10、 100、1000 TCID50稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。 0.1TCID TCID50应不引起细胞病变，而且100TCID TCID50必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。

血清毒性对照相：为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检血清毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血清（相当于中和试验中被检血清的最低稀释度）。 正常细胞对照相：即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。

(7) 结果判定和计算 当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，血清毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检血清孔出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现

保护者为阳性；固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。 用Reed和Muench两氏法（或Karber法）计算结果，如表2-26 80%－50%

距离比例＝──────＝0.5

80%－20%

Ig TCID50=高于50％血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数 Ig TCID50＝－1.5－0.5×（－0.3）＝－1.35

表2-26 固定病毒－稀释血清法中和抗体效价计算 血清稀释 CPE数

总孔数 CPE数 无CPE数 积累 CPE比率 百分数 CPE 无CPE

1:4(10-0.6) 0/4 0 4 0 12 0/12 0 1:8(10-0.9) 0/4 0 4 0 8 0/8 0 1:16(101.2) 1/4 1 3 1 4 1/5 20 1:32(10-1.5) 3/4 3 1 4 1 4/5 80

1:64(101.8) 4/4 4 0 8 0 8/8 100 则TCID50＝10-1.36，50μl

因10-1.35=1/22，即1:22的血清可保护50％细胞不产生病变，1:22就是该份血清的中和抗体效价。

影响中和试验的因素：

(1) 病毒毒价的准确性是中和试验成败的关键，毒价过高易出现假阴性能，过低会出现假阳性。在微量血清中和试验中，一般使用100-500 TCID50。

(2) 用于试验的阳性血清规戒律，必须是用标准病毒接种易感动物制备的。

(3) 细胞量度的多少与试验有密切关系，细胞量过大或过小易造成判断上的错误，一般以在24h，内形成单层为宜。

(4) 毒价测定的判定时间应与正式试验的判定时间相符。

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