植物转基因原理与技术

植物转基因原理与技术 植物转基因原理与技术

转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程。微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。

原 理

根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同，可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系。植物转基因流程图如下所示。 外植体）

愈伤组织 瞬时表达 外源基因 植物受体细胞 原生质体

生殖细胞 稳定表达

获得抗性生根转基因苗 转基因植物的检测和鉴定（PCR, Southern blot ,Northern blot,生理指标鉴定等）

技 术

就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术，直接转化技术和种质转化技术。下面分别叙述。 一 载体转化技术

载体转化技术是指通过农杆菌的Ti 或Ri质粒，植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法。其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法。病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。

土壤农杆菌是一类浸染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌。它的致瘤能力来源于存在于细胞内的Ti（tumour-induced）质粒。它利用Ti质粒控制植物细胞来生产自己独特的“食品”- 冠瘿碱，从而将植物细胞转变成特定营养的安全避难所和工厂。Ti质粒长200-250kb，上面分布着四个区：T-DNA(transferred DNA) ,Vir(virulence gene) ,控制结合转移的区域和与冠瘿碱利用有关的基因区。毒力基因即Vir基因控制着转移DNA 即T-DNA向植物细胞转移，T-DNA是唯一整合进植物基因组的区域，它编码植物激素和冠瘿碱合成酶。T-DNA转化植物的过程如下：植物受伤后释放酚类化合物信号分子被位于细胞膜的VirA蛋白感受，VirA蛋白是受配基刺激自身磷酸化的受体，并将磷酸基团转移给Vir区基因调控蛋白因子VirG。VirG调控着下游基因的表达来完成T-DNA的切割，包装和转移。

天然的Ti质粒因为太大，酶切位点多又诱导产生肿瘤，所以不适合作为载体。经过改造后可以作为基因工程载体，主要是通过破坏或缺失癌基因成为安全载体，太大不适合操作可以通过同源重互换或功能互补来解决。T-DNA整合进植物基因组与其边界序列相关，而与内部序列无关，因此可以将内部控制植物激

素和冠瘿碱合成酶的基因替换为外源基因，从而携带外源基因整合到植物基因组中去。Ti质粒载体系统主要有共整合载体系统和双元载体系统。共整合载体系统是利用含T-DNA的大肠杆菌小质粒插入目的基因后转到含天然Ti质粒的农杆菌中进行同源重组达到将目的基因插到Ti质粒中。双元载体系统是目的基因克隆于含T-DNA的大肠杆菌小质粒中，转移所需的Vir基因由缺失T-DNA的Ti质粒反式提供。农杆菌对植物的感染有以下几种方法：1活体接种法 把新鲜培养的农杆菌接种到植株的伤口部位，从而诱发肿瘤形成。造成伤口的方法有刀切，针刺，微粒轰击等。2共培养法 农杆菌和原生质体，悬浮细胞和愈伤组织共培养转化。3叶盘法 将植物的叶片，子叶或根等切成小片或打孔取叶盘，农杆菌浸染后进行筛选和鉴定。 Ri 质粒可以诱导毛状根，毛状根经过激素处理可以分化成可育得成体植株。但由于对Ri 质粒了解还不多，现在利用Ri 质粒转化系统的比较少，主要用在研究次生代谢产物为目的的根组织培养工作和研究根瘤形成。

植物病毒载体系统是将外源基因插到病毒基因组中，通过病毒浸染而将外源基因导入到植物细胞中。目前正在研究发展的植物病毒载体有三种：单链RNA 植物病毒载体系统，单链DNA植物病毒载体系统和双链DNA 植物病毒载体系统。 二 直接转化技术

不用载体，采用物理或化学方法直接将外源基因导入到受体系统，包括化学物质诱导法，电激法，基因枪法等。

1．化学诱导法 以原生质体为受体，借助于特定的化学诱导物质诱导外源DNA直接导入的方法。初期是从促进原生质体融合的方法衍生出来。目前主要有PEG介导和脂质体介导两种方法。PEG为细胞融合剂，它可以使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，从而有利于DNA分子的进入。脂质体法使用脂类化学物质包裹DNA成球体，通过原生质体的吞噬或融合作用把内含的DNA分子转入受体细胞的方法。这两种方法转化率较低，这与原生质体培养困难有关。

2．电激法（electroporation） 是利用高压脉冲在原生质体膜上造成非对称穿孔，这种孔径较小（8.4nm左右），并可在很短时间内(200ns)恢复到0.5nm，因此外源基因可以进入细胞。实际操作是可以根据实验条件和材料选择高压短时程法和低压长时程法。其转化率与化学诱导法相当。

3．微注射法（microinjection）是使用极细的毛细管在显微镜下降外源DNA注射到植物细胞或原生质体的一种直接而完善的方法。这种方法首先在动物细胞转基因中使用。由于植物细胞没有动物细胞的生长贴壁现象，因此必需固定后才能注射。显微注射虽然操作费事，但转化率很高。

4．基因枪法(particle gun)又称为微弹轰击法，其基本原理是将DNA包被在微小的金粉或钨粉表面，然后在高压的作用下微弹被射入细胞或组织。动力可以由火药爆炸产生或高压气体或高压放电产生。该方法与其他方法相比具有如下优点：无宿主限制:农杆菌只对某些双子叶植物敏感，而对多数单子叶植物不敏感，从而大大限制了应用范围。基因枪法无物种限制，对单双子叶植物都可适用，对动物和微生物同样适用。受体类型广泛：化学诱导法和电激法等介导基因转化需要以原生质体为受体细胞，而原生质体不易培养和再生，基因型依赖性强，使得住些方法受限。而基因枪法可以以几乎所有具有潜在分生能力的组织细胞为受体。

三 种质转化技术

种质转化技术（germ line transformation）也称生物媒体的转化系统，即基因转移主要利用花粉粒及花粉管通道，利用子房，幼穗及种胚注射外源基因的方法导入。其特点是转化不依靠物理化学过程，而是依靠生物自身的种质系统或细胞结构功能来实现的，是植物整体水平的转化，转化不需要植物组织，细胞和原生质体的分离，方法简便易行，并可与常规育种紧密结合。其具体方法如下：

1．花粉管通道法 授粉后使外源基因能沿着花粉管渗入，讲过珠心通道进入胚囊，转化尚 不具备正常细胞壁的卵，合子或早期胚胎细胞。着一技术原理可以应用于任何开花植物。

2．生殖细胞浸泡介导基因转化法 将供试外植体如种子，胚，子房 ，花粉等直接浸泡在外源基因溶液中，利用渗透作用把外源基因导入到受体细胞中。

3．胚囊子房注射法 用显微注射仪把外源基因溶液注入到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生高的

压力及卵细胞的吸收使外源基因进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株。 最后对各种转基因的方法进行比较如下表。

评价条件 农杆菌法 PEG法 电激法 微注射法 基因枪法 花粉管通道法 受体材料 完整细胞 原生质体 原生质体 原生质体 完整细胞 卵细胞 宿主范围 有 无 无 无 无 有性繁殖植物 组织培养条件 简单 复杂 复杂 复杂 简单 无

转化率 10-2-10-1 10-5-10-4 10-5-10-4 10-3-10-2 10-3-10-2 10-1 嵌合体比例 有 无 无 无 多 无

操作复杂性 简单 简单 复杂 复杂 复杂 简单 设备要求 便宜 便宜 昂贵 昂贵 昂贵 便宜 工作效率 高 低 低 低 高 低

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