生物化学BIOCHEMISTRY

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生物化学BIOCHEMISTRY

绪论Prolegomena

What is BIOCHEMISTRY?

CHEMISTRY：the branch of science which deals with the identification of the substances of which matter is composed, the investigation of their properties and the ways in which they interact, combine, and change, and the use of these processes to form new substances

Biochemistry: the branch of science concerned with the chemical and physic-chemical processes which occur within living organisms Including:

The chemistry of the components in living organisms (static biochemistry)

The principles for the chemical changes in living organisms (dynamic biochemistry) The chemistry of metabolism and cell functions (functional biochemistry) 生物化学的主要分支：

按化学的研究范畴划分：生物无机化学（bioinorganic chemistry），生物有机化学（bioorganic chemistry），生物物理化学（biophysical chemistry）

按生物学的研究领域划分：动物生物化学（animal biochemistry），植物生物化学（plant biochemistry），微生物生物化学（microbe biochemistry）按研究对象划分：蛋白质化学（protein chemistry），核酸化学（nucleate chemistry）按与生产、生活关系划分：生理生化（physiological biochemistry），工业生化（industrial biochemistry），农业生化（agricultural biochemistry），医药生化（medicinal biochemistry）生物化学的使命：揭示生命现象的本质，促进生命科学发展；改善人类健康水平和生活质量；促进物种的改良和优化；带动工、农业的发展和变革分子生物学Molecular biology：什么是分子生物学：在分子水平上研究生物大分子的结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学

主要研究领域：蛋白质体系，蛋白质-核酸体系，蛋白质-脂质体系分子生物学的三个支柱学科：生物化学，遗传学，微生物学

分子生物学的地位：由学科分支成长为主流前沿，殊途同归的集大成者，生物学科走向统一的前驱

古代生物化学（在化学中萌芽）：

19世纪以前：A.L. Lavoisier, “呼吸作用的本质和燃烧是一样的”；C.W. Scheele, 多种生化物质的分离；J.von.Liebig, 新陈代谢（stoff wechsel)；Hoppe Seyler, 1877年，提出“biochemie” 近代生物化学（由静态走向动态）：

19世纪中叶——20世纪50年代，相关学科的蓬勃发展：1804，John Dalton 提出原子论；1859，Port Darwin 进化论；1865，Gregor Mendel 遗传定律；1869，D.L.Mendelyeev 元素周期律

生物化学的发展：

1848, Helmhoitz & Bernard，肝脏的生糖功能；1869，J.F. Michel 分离“核素”（核酸）；1897，Bucher ，酵母榨出液可使蔗糖发酵生成乙醇；1902，D.A. Leeven，从核酸中分离胞嘧啶；1904，Knoop ，脂肪酸的?-氧化；1907，E.H. Fischer ，蛋白质的降解与合成；1912，F.G. Hopkins，确立维生素概念，形成剑桥生物化学学派；1921，F.G.班廷和C.H.贝斯特，分离纯胰岛素；1926，J.B. Sumner 分离脲酶，并证明其是蛋白质；1929，Lohmann & Fiske ，ATP的能量功能；1931，Warburg 制得呼吸酶并研究其生物氧化作用；1937，Krebs，三羧

酸循环的假说；1950，L.C. Pauling，蛋白质构象（?-helix）；1953，Watson & Crick DNA的双螺旋模型

现代生物化学阶段（分子生物学时代）：

20世纪中叶——至今，技术的进步使生物学走向新的时代：1933，Ernst Ruska，电子显微镜，1935，G.C. 海韦希，同位素技术，1940?s，遗传学开始向分子水平迈进，1930?s~1940?s，计算机和自动控制技术的巨大进步

生物学各分支向分子水平进军并走向融合：

A. L. Hodgkin, 神经兴奋和传导的离子学说；1953，F. Sanger，胰岛素序列测定；1954，S. Benzer，噬菌体基因精细结构分析；1954，M. Calvin，光合作用的CO2固定， Calvin循环；1956，E.W. 萨瑟兰，cAMP，第二信使；1956，F.H.C. Crick，中心法则；1962，M. W. Nirenberg，遗传密码的发现；1965，邹承鲁、刑其毅等，人工合成牛胰岛素；1970，H.O. Smith，限制性内切酶；1970，梁栋材等，精度0.25nm的胰岛素结构（1974，达0.18nm）；1975， F. Sanger，建立DNA序列分析方法；1980，A. Keluger，DNA与组蛋白的结构基因工程和基因技术的兴起： P. Berg，DNA体外重组；1973，S.N. Cohen，外源基因在大肠杆菌的表达；1975，美国Asiomar国际会议，制定第一个基因安全准则；1977，H.W. Boyer等，第一个基因工程产品——生长激素释放抑制激素（somatostatin）；1983，?噬菌体DNA全序列；1985，Mulis，聚合酶链式反应技术（PCR)；1987，转基因植物：荧光素转入烟草；1990，Anderson & Cular 第一例基因治疗成功；1997，第一只成年动物体细胞克隆的绵羊——Dolly；2000，人类基因组计划（HGP）公布第一张草图

生物化学的一些基本问题

什么是生命：我们所处在的地球充满着无数的生物，从最简单的病毒、类病毒到菌藻树草，从鱼虫鸟兽到最复杂的人类，处处都可以发现它们的踪迹，觉察到生命的活动。地球上的生物形形色色，千姿百态。不同的生物，其形态、生理特征和对环境的适应能力各不相同，都经历着生长、发育、衰老、死亡的变化，都具有繁殖后代的能力。

生命的特征：新陈代谢、生长发育、繁衍后代、遗传变异、环境应激性、自主运动、进化演变；结构复杂性、组织性和有序性、物质能量交换、生长发育、遗传变异、环境应激性、进化演变

生命的定义：

“生命是蛋白体的存在方式，这个存在方式的基本因素在于和它周围的外部自然界的不断地新陈代谢，而且这种新陈代谢一停止，生命就随之停止，结果便是蛋白质的分解。”——恩格斯

“生命是开放的非平衡系统中发生的一系列过程”——鲍尔

“非平衡态是通过熵从生物体流向周围介质来维持的”（耗散结构）——薛定鄂

生命是高度有序的，开放的，具有耗散特征的，远离平衡态的动力学系统，其基本框架为：DNA-RNA-蛋白质不断更新的自组织属性具有多级超循环结构在生命系统混沌与吸引子作用下不断朝更高层次迈进

生命的化学基础：全世界250余万种生物，无论是形态结构还是生理过程都千姿百态，迥然不同，但他们却有着相似的化学基础。从分子到细胞（图）

生命的化学组成：水：65%-75% 蛋白质：10%-15% 脂质：3%-7% 糖类：2%-4% 核酸：3%-5%其他有机物：<1% 无机物：2%-3%

构成生命的化学元素：组成生命体的物质是极其复杂的。但在地球上存在的92种天然元素中，只有28种元素在生物体内被发现。

第一类元素：包括C、H、O和N四种元素，是组成生命体最基本的元素。这四种元素约占

了生物体总质量的99%以上。

第二类元素：包括S、P、Cl、Ca、K、Na和Mg。这类元素也是组成生命体的基本元素。第三类元素：包括Fe、Cu、Co、Mn和Zn。是生物体内存在的主要少量元素。第四类元素：包括Al、As、Be、Br、Cr、F、I、Mo、Se、Si等。重要的有机化学概念：

什么是有机物：有机物原义是“有生机的物质”，即来自于生命体的物质。“有机”、“无机”并无绝对界限。从目前来看，有机化学主要研究是以C、H元素共价结合体为骨架的“有机化合物”的结构、特性以及相互之间的转化和反应

C 原子是构成有机分子的重要元素，它能形成四个稳定共价键，是有机分子的骨架；H 原子做为最小的原子，具有形成稳定共价键以及离子键、氢键的能力；所有有机化合物均包含C、H元素构成的分子骨架

一般情况下，C原子的四跟共价键是对称的，形成四棱锥结构。对C-C单键连接的分子我们一般接受这一假设； C原子可绕单键自由旋转； C=C双键或三键具有刚性，因此C原子与其他相连原子处于同一平面，不能旋转。

三种常用的有机分子结构：Fisher，Ball-and-stick，Space filling (图)

重要的有机官能团：所谓官能团，是指有机化合物中区别于共同碳骨架的结构部分。一般有机分子的化学性质主要取决于官能团。复杂的有机分子通常有多个官能团。

甲基，乙基，苯基，羟基，醛基，酮基，羧基，酯，醚，酐，乙酰磷酸，磷酸酐，氨基，酰氨基，胍基，咪唑基，巯基，二硫键，硫酯有机分子的构型构象：

不对称碳原子：当一个C原子上连接的4个基团各不相同时，该C原子即不对称C原子，因不对称C原子上基团连接方式的不同，而产生有机分子的不同构型和手性现象。构型：指有机分子内部基团的共价连接方式的差异。改变构型必须断裂共价键。

构象：由于各基团绕C原子旋转而产生的有机分子内各原子的空间排布的差异，不涉及共价键的断裂

R、S构型命名系统，D、L构型命名系统生物化学反应的基本原则：

1，共价键是通过两个原子共用外层电子而形成的：原子有通过获得、失去或共享电子的方式，达到“满电子状态”的倾向；如果形成共价键的原子“电负性”相近，那么形成的共价键是非极性的，否则就是“极性的”；共价键的强弱，可用“键能”来衡量，所谓“键能”就是断裂该键所需的能量，或者该键形成时所释放的能量。

2，多数生化反应是通过“亲核基团”攻击“亲电基团”来实现的：“亲核基团”指那些含有多余电子，倾向于通过提供共享电子而形成共价键的官能团或原子，含O、N、S的基团是生化中常见的“亲核基团”；“亲电基团”指有空的电子轨道，倾向于通过捕获电子而形成共价键的官能团或原子，H+和金属阳离子是生化中常见的“亲电基团”；C原子可同时表现为C+、C-（取决于所连接的基团）。

重要的生物化学反应形式：氧化-还原（oxidation-reduction reaction）；取代反应（substitution reaction)；异构化反应（isomerization reaction）；缩合反应（condensation reaction）中的脱水反应（dehydration reaction）；裂解反应（lytic reaction）中的水解反应（hydrolytic reaction）。（图）电负性，键能，化学反应键的断裂有均裂和异裂，细胞内常见的亲核基团（含电负性较强的原子，具有孤对电子），SN1反应和SN2反应，异构化反应，氨基酸的脱水反应和二肽的水解反应。

生物分子间的其他非共价的相互作用力：

氢键：两个电负性原子（O，N）分享一个H原子和形成；离子键：不同电荷的基团之间的

相互吸引；疏水力：非极性基团相互聚集而排斥水分子或极性分子产生；范德华氏力：当两原子相互临近时产生。

蛋白质Proteins（I）——Amino Acids and Proteins

蛋白质概述The overview for proteins

protein, any of a class of nitrogenous organic compounds which have large molecules composed of one or more long chains of amino acids and are an essential part of all living organisms,especially as structural components of body tissues such as muscle, hair, collagen, etc., and as enzymes and antibodies ：Carbon 50％；Hydrogen 7％；Oxygen 23％；Nitrogen 16%；Sulphur 0—3％；Other Trace（微量）

The content of Nitrogen in proteins is mostly 16%，Content of protein（g%）=the content of Nitrogen in the biological simples per gram ? 6.25

Proteins are macromolecules with huge Molecular Weight （6,000-1,000,000） The Molecular Weight of a protein due to the amino acid constitute in it.

The quantity of amino-acids residue in a protein without prosthetic group could be reckoned by divided its molecular weight by 110.

The average molecular weight(MW) of amino-acids is 138，but most of amino-acids in proteins are small, they have an average MW at 128，then, take of the MW of water,18, when they dehydrated to form protein. So we got the MW of amino-acids residue in protein is 110 蛋白质的分类：

1，简单蛋白（Simple protein）:除氨基酸以外不含其他成分的蛋白质：清蛋白（albumin）：溶于水、稀酸或稀碱；为饱和硫酸铵沉淀；e.g. 血清清蛋白、乳清清蛋白

球蛋白（globulin）为半饱和硫酸铵沉淀。（优球蛋白（euglobulin），不溶于水，溶于稀盐溶液；拟球蛋白（pseuglobulin），溶于水。）e.g. 血清球蛋白、肌球蛋白、种子球蛋白谷蛋白（glutelin）：不溶于水、醇、中性盐；易溶于稀酸或稀碱。 e.g. 米谷蛋白、面谷蛋白醇溶谷蛋白（prolamine）不溶于水无水乙醇，溶于70-80%的乙醇，含脯氨酸和酰胺较多。 e.g. 玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白

组蛋白（histone）溶于水和稀酸，为氨水沉淀。分子含碱性氨基酸较多。 e.g. 小牛胸腺组蛋白

精蛋白（protamine）溶于水和稀酸，不溶于氨水。含碱性氨基酸特别多。 e.g. 鱼精蛋白、蛙精蛋白

硬蛋白（scleroprotein）不溶于水、盐、稀酸或稀碱。 e.g. 角蛋白、胶原、弹性蛋白,

2，结合蛋白（conjugated protein）:除由氨基酸组成蛋白质部分外，还含有非蛋白成分，这些非蛋白成分，有时称辅基（prosthetic group）或配基（ligand）：核蛋白（nucleprotein）辅基为核酸。 e.g. 脱氧核糖核蛋白、核糖体脂蛋白（lipoprotein）与脂质结合的蛋白， e.g. ?1-脂蛋白，卵黄球蛋白

糖蛋白（glycoprotein）含单糖或多糖的蛋白质， e.g. 卵清蛋白、?-球蛋白（抗体）、血型蛋白

磷蛋白（phosphoprotein）辅基为磷酸基的蛋白质。 e.g. 酪蛋白，胃蛋白酶

卟啉蛋白（porphyrin protein）辅基含卟啉环的蛋白质， e.g. 血红蛋白、细胞色素C，叶绿蛋白，血蓝蛋白

黄素蛋白（flavoprotein）辅基为黄素腺嘌呤二核苷酸。 e.g. 琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶

金属蛋白（metalloprotein）与金属直接结合的蛋白质， e.g. 铁蛋白，乙醇脱氢酶，黄嘌呤氧化酶

3，根据蛋白质的分子外形分类：球状蛋白质（globular proteins），纤维状蛋白质（fibrous proteins） 4，根据蛋白质功能分类：

结构蛋白质（structural proteins），酶蛋白（enzymes），运输蛋白质（transport proteins），运动蛋白质（kinesis proteins），贮藏蛋白质（storage proteins），防御蛋白质（defensive proteins） The brief review of Protein’s function： Structural materials （结构物质）

Metabolic Catalysis （代谢作用催化） Storages of Nutritions （营养贮藏）

Transport between organisms and its environment（运输） Motility functions for organisms and cells（运动） Metabolic regulation（调节）

Biological Defense: immune （免疫）

Signal transduction and response（转导应答膜）

Record, Transcription and express the genetic information, control the growth of organisms 蛋白质的基本结构单位-氨基酸：蛋白质的水解：

酸水解：常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。

碱水解：一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。酶水解：目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。最常见的蛋白水解酶有：胰蛋白酶（trypsin），胃蛋白酶（pepsin）、糜蛋白酶（chymotrypsin）、木瓜蛋白酶（papain）

氨基酸（amino acids, Aa）的结构通式：

生物体中发现的氨基酸达180余种，但组成蛋白质的基本氨基酸一共只有20种

? 甘氨酸（glycine）氨基乙酸 Gly G ? 丙氨酸（alanine） ?-氨基丙酸 Ala A ? 缬氨酸（valine） ?-氨基异戊酸 Val V ? 亮氨酸（leucine） ?-氨基异己酸 Leu L ? 异亮氨酸（isoleucine） ?-氨基-?-甲基戊酸 Ile I ? 丝氨酸（serine） ?-氨基-?-羟基丙酸 Ser S ? 苏氨酸（threonine） ?-氨基-?-羟基丁酸 Thr T ? 半胱氨酸（cysteine） ?-氨基-?-巯基丙酸 Cys C ? 甲硫氨酸（methionine） ?-氨基-?-巯基丁酸 Met M ? 天冬酰胺（asparagine） ?-氨基丁二酸- ?-酰胺 Asn N ? 谷氨酰胺（Glutamine） ?-氨基戊二酸- ?-酰胺 Gln Q ? 天冬氨酸（aspartic acid） ?-氨基丁二酸 Asp D

? 谷氨酸（glutamic acid ） ?-氨基戊二酸 Glu E ? 赖氨酸（lysine） ?,?-二氨基己酸 Lys K ? 精氨酸（arginine） ?-氨基-?-胍基戊酸 Arg R ? 苯丙氨酸（phenylalanine） ?-氨基-?-苯基丙酸 Phe F ? 酪氨酸（tyrosine） ?-氨基-?-对羟苯基丙酸 Tyr Y ? 色氨酸（tryptophan） ?-氨基-?-吲哚基丙酸 Trp W ? 组氨酸（histidine） ?-氨基-?-咪唑基丙酸 His H ? 脯氨酸（proline） ?-吡咯烷基-?-羧酸 Pro P

除脯氨酸外，基本氨基酸的共同结构特点是：与羧基相邻的?-C原子上都有氨基，称?-氨基酸。除甘氨酸外，基本氨基酸的?-碳原子都是手性碳原子，因此都具有旋光性。构成蛋白质的基本氨基酸， ?-碳原子都属L-构型。氨基酸的分类：

1，根据侧链R基的化学结构可分为脂肪族、芳香族、杂环族和杂环亚族。

脂肪族氨基酸：一氨基一羧基中性Aa：Gly、Ala、Val、Leu、Ile，含羟基的Aa：Ser、Thr，含硫的Aa：Cys、Met，含酰胺基的Aa：Asn、Gln，一氨基二羧基的Aa：Asp、Glu，二氨基一羧基的Aa：Lys、Arg。芳香族氨基酸：Phe、Tyr 杂环族氨基酸：Trp、His 杂环亚氨基酸：Pro

2，按侧链R基的极性性质分类：

非极性R基Aa：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro

不带电荷的极性R基Aa：Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Cys、Gly 带正电荷的极性R基Aa：Lys、Arg、His 带负电荷的极性R基Aa：Glu、Asp

? 必需氨基酸：Ile、Met、Val、Leu、Trp、Phe、Thr、Lys，（携一两本甲色书来）其他不常见氨基酸：

蛋白质氨基酸：不常见Aa通常由常见Aa衍生：

4-羟脯氨酸：胶原；5-羟赖氨酸：胶原；6-N-甲基赖氨酸：肌球蛋白；?-羧基谷氨酸：凝血酶原；锁链素：弹性蛋白；微生物和昆虫的蛋白质常含有D-氨基酸非蛋白质氨基酸：?-丙氨酸（?-Ala）；?-氨基丁酸；L-瓜氨酸（L-Cit）；L-鸟氨酸（L-Orn）怎样记忆氨基酸的分类：

记少不记多，记简不记繁，口诀：甘丙丝半苏缬蛋；亮和异亮中性完；酸性谷氨天门冬；精氨赖氨皆是碱；芳香族里酪苯丙；组氨色脯有杂环。氨基酸的理化性质：

一般物理性质：无色晶体，熔点高（200?C），有味（不同），能溶于水，不溶于有机溶剂旋光性：除甘氨酸外，都具有旋光性。

光吸收：可见光区域没有光吸收。远紫外（?<200nm）都有光吸收。近紫外（220-300nm）只有Tyr、Phe、Trp有光吸收两性性质与等电点：

氨基酸的两性电离：在水等极性介质中，Aa的偶极离子在水中：既起酸（质子供体）的作用。又起碱（质子受体）的作用。按Lowry的酸碱质子理论，酸是质子供体，碱是质子受体

等电点和等点状态：

Aa的带电状态与溶液的pH值有关，当Aa所带的正电荷和负电荷相等即净电荷为0的兼性

离子状态：称等电状态。使Aa处于等电状态的pH称为氨基酸的等电点中性Aa的等电点：对于侧链基团不解离的氨基酸有：pI = (pK1+pK2)/2 酸性Aa的等电点：An acidic amino acid pI=(pK1+pKR)/2 碱性Aa的等电点：A basic amino acid pI=(pKR+pK2)/2

氨基酸的滴定：一般情况下氨基酸不能被滴定：等当点pH或过高（12-13），或过低（1-2），没有适当的指示剂可被选用。

氨基酸的甲醛滴定法：向AA溶液中加入过量的甲醛，用标准NaOH滴定时，由于甲醛与Aa中的-NH2作用形成-NH.CH2OH -N (CH2OH)2等羟甲基衍生物而降低了氨基的碱性，相对地增强了-NH3+的酸性解离，使Pk'2减少了2-3个pH单位，NaOH滴定的曲线A向pH低的方向转移，滴定终点也移动pH9附近。

原因：甲醛与H2N-CH2-COO-结合,有效地减低了后者的浓度,所以对于加入任何量的碱, [H2N-CH2-COO- ]/ [+H3N-CH2-COO- ]的比值总要比不存在甲醛的情况下小得多。加入甲醛的甘氨酸溶液用标准盐酸滴定时，滴定曲线B并不发生改变。氨基酸的常见化学反应：

1， ?-氨基的反应：

（1）亚硝酸反应：范围：可用于Aa定量和蛋白质水解程度的测定（Van slyke法）。注意：生成的氮气只有一半来自于Aa，ε氨基酸也可反应，速度较慢．

（2）与酰化试剂的反应：Aa＋酰氯，酸酐－→ Aa被酰基化。丹磺酰氯用于多肽链末端Ａa的标记和微量Ａa的定量测量．

（3）烃基化反应：Aa的氨基的一个氢原子可被烃基（包括环烃及其衍生物）取代．与2，4－二硝基氟苯（DNFB，FDNB）反应，最早Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的氨基末端的Aa

与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应， Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N末端Aa．在多肽和蛋白质的Aa顺序分析方面占有重要地位（ Edman降解法）

（4）形成西佛碱反应：Aa的α-NH2能与醛类化合物反应生成弱碱，即西佛碱（schiff ?s

base）。前述甲醛滴定也属于西佛碱反应

（5）脱氨基反应：Aa在生物体内经Aa氧化酶催化即脱去α-NH2而转变成酮酸

2， α-COOH参加的反应：（1）成盐和成酯反应

Aa + 碱－→ 盐：Aa + NaOH －→ 氨基酸钠盐(重金属盐不溶于水) Aa-COOH + 醇－→ 酯： Aa+ EtOH －－－→ 氨基酸乙酯的盐酸盐（该反应以干燥的HCL气体为催化剂，二氯亚砜做干燥剂）（Aa酯是制备Aa的酰氨or酰肼的中间物）（2）当Aa的COOH变成甲酯，乙酯或钠盐后，COOH的化学反应性能被掩蔽或者说COOH被保护，NH2的化学性能得到了加强或活化，易与酰基结合。

成酰氯反应：当氨基酸的氨基用适当的保护基保护以后，其羧基可与二氯亚砜作用生成酰氯。用于多肽人工合成中的羧基激活

叠氮反应：氨基酸的氨基通过酰化保护后，羧基经酯化转变为甲酯，然后与肼和亚硝酸变成叠氮化合物。用于多肽人工合成中的羧基激活

脱羧基反应：AA在脱羧酶的催化下生成一级胺和CO2。

3， ?-氨基和α-羧基共同参与的反应

（1）与茚三酮反应：茚三酮在弱酸性溶液中与?-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物中的氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。Pro与hyPro（羟脯氨酸）不释放氨，而直接生成黄色化合物。该反应用以定性，定量测定各种Aa，蛋白质，测定CO2 的量，从而可计算参加反应的Aa的量。

（2）成肽反应：一个Aa的NH2+另一个Aa的COOH可以缩合成肽，形成的键称肽键。 4，侧链R基参加的反应

（1）R功能基：羟基，酚基，巯基（二硫键），吲哚基，咪唑基，胍基，甲硫基，非?-NH2,非?-COOH。

酪氨酸的酚基在3和5位上容易发生亲电取代反应：二碘酪氨酸或一硝基酪氨酸和二硝基酪氨酸。酪氨酸的酚基可以与重氮化合物（对氨基苯磺酸的重氮盐）生成桔黄色的化合物。——Pauly反应。组氨酸的咪唑基可以发生类似反应但产物颜色为棕红色。

精氨酸的侧链胍基在硼酸钠缓冲液（pH 8-9, 25-35?C）中，与1.2-环已二酮反应，生成缩合物。该缩合物在羟胺缓冲液中，重新生成Arg。

色氨酸的侧链吲哚基在温和条件下可被N－溴代琥珀酰亚胺（N-bromosuccinimide）氧化。此反应可用于分光光度法测定蛋白质中色氨酸的含量，并能在色氨酸和酪氨酸残基处选择性化学断裂肽键。

蛋氨酸侧链上的甲硫基是一个很强的亲核基团，与烃化试剂如甲基碘容易形成锍盐（sulfonium salt）

此反应可被硫基试剂逆转。在逆转反应中，原有的甲基和新加入的甲基除去的机会是相等的，因此当用14C标记的甲基碘处理时，获得的蛋氨酸将有50%是同位素标记的。半胱氨酸侧链上的巯基（－SH）有很强的反应活性，可参与很多反应：

二硫键的形成和打开：2R-SH + 1/2 O2 －→ R-S-S-R + H2O ；Cu2+，Fe2+ ， Co2+和Mn2+存在下，巯基的空气氧化将显著提高。

胱氨酸中的二硫键在稳定蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和还原剂都可打开二硫键。过甲酸可以定量地打开二硫键，生成磺基丙氨酸（cysteic acid）残基。还原剂如巯基化合物（R-SH）也能打开二硫键，生成半胱氨酸残基及相应的二硫化物二硫苏糖醇（dithiothreitol，缩写为DTT），与胱氨酸中的二硫键反应形成一个含分子内二硫键的稳定六元环

巯基能和各种金属离子形成稳定程度不等的络合物e.g. 对氯汞苯甲酸（p-chloromercuribenzoic acid）

由于许多蛋白质，如SH酶，其活性中心涉及-SH基，当遇到重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶的失活，因此制备这类蛋白质时应避免进入重金属离子。

半胱氨酸可与二硫硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid，缩写为DTNB）或称Ellman氏试剂发生硫醇-二硫化物交换反应：

反应中1分子的半胱氨酸引起1分子的硝基苯甲酸的释放。它在pH8.0时，在412nm波长处有强烈的光吸收，因此可利用比色法定量测定-SH基。

蛋白质（II）——蛋白质的结构

蛋白质的共价结构:

蛋白质的一级结构（Primary structure）：蛋白质的共价结构，即蛋白质分子内部通过

共价键连接而形成的结构形式，包含： ①氨基酸在蛋白质内的排列顺序 ②二硫键的位置和连接顺序 ③侧链基团的修饰和连接情况（是否磷酸化，磷酸化位置；是否糖基化，糖基化位置，糖链组成；是否酯化，酯化位置，酯的组成） ④是否有辅基或其他分子,连接方式。肽键:

蛋白质是氨基酸通过脱水缩合形成肽键而形成的，实验证据：

（1）蛋白质分子中游离的α-氨基，α-羧基很少。若水解，游离α-氨基，α- 羧基以等mol数增加 →说明α氨基，α-羧基参与某种结合，水解时，这种结合断开。

（2）人工合成肽可以被蛋白酶水解

（3）包含O=C-N- H基团的化合物如双缩脲H2N-CO-NH-NH2能与硫酸铜--氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应。天然蛋白质也存同样反应。

（4）人工合成的多聚AA的X射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似。

（5）我国在世界上首次人工合成蛋白质-结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质的肽链结构学说的正确性。肽键的特点：酰胺键：由于酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基的共振作用，表现出高稳定性。 C－N具40％双键性质。C＝O具40％单键性质。共振杂化体。C－N键长：0.184nm C＝N键长：0.127nm C N键长：0.132nm

亚氨基（－NH－）pH 0－14没有明显的解离和质子化倾向

肽键是一个平面，称肽平面。可以有反式顺式结构，但旋转能障较高，反式稳定（Pro例外）蛋白质中的每一个氨基酸单位称氨基酸残基（residue）

肽链结构的命名与书写：根据含Aa的数目命名：**肽。从NH2末端Aa残基开始，称为：某氨基酰某氨基酰某氨基酰…..氨基酸。书写时氨基端在左边，羧基端在右边；以氨基酸的三字缩写或单字缩写代表对应的氨基酸；用短横线代表氨基酸残基之间的肽键肽的物理化学性质：

一般物理性质：短肽晶体、熔点很高（离子晶体、偶极离子）

肽的两性解离：决定于游离氨基末端、游离羧基末端以及侧链基团。肽链羧基的pK?比氨基酸的大一些，而氨基的pK?则要小一些多肽等电点的计算：中性肽的等电点：

溶液的 pH ＜3.5 3.5－4.5 4.5－7.8 7.8－10.2 ＞10.2

功能团解离（带电）状况 α-COOH COOH α-NH2 ε-NH2 占优势离子的净电荷－COOH －COOH －+ N H3 －+ N H3 +2 －COO－－COOH －+ N H3 －+ N H3 +1 －COO－－COO－－+ N H3 －+ N H3 0 －COO－－COO－－NH2 －COO－－COO－－NH2 －+ N H3 -1 －NH2 -2

酸性肽的等电点：

碱性肽的等电点：

常见化学反应：

①N端氨基酸残基与茚三酮、DNFB、PITC等反应 ②C氨基酸残基成酯、成酰胺、成盐

③侧链氨基酸的反应：磷酸化：Tyr、Ser、Thr；酯化：Ser、Thr、Tyr；糖基化： Ser、Thr、Cys

④双缩脲反应（Biuret reaction）：多肽与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，540nm处有最大光吸收。

为肽和蛋白质特有（两个或两个以上肽键），氨基酸没有该反应。

天然活性多肽：定义：在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位，但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。

常见活性多肽：谷胱甘肽（GSH）；?-Glu-Cys-Gly；巯基缓冲剂；脑啡肽（enkephalins）：神经系统中产生的一类短肽，具有多种特殊生物学功能；蕈毒素、蛇毒素：?－鹅膏蕈碱：能与真核生物的RNA聚合酶（RNA polymerase）Ⅱ和Ⅲ牢固结合而抑制酶的活性，因而使RNA的合成不能进行，但不影响原核生物的RNA合成；短肽类抗生素。蛋白质一级结构测定：

氨基酸顺序测定的一般步骤：

要求：样品均一，纯度97%以上，已知分子量（误差小于10%）

冷拉钢丝的拉力。

（2）胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在。其基本组成单位是原胶原蛋白分子

（3）一级结构分析表明，胶原蛋白?肽链的96%都是按三联体的重复顺序：(g1y—x—y)n排列而成。Gly数目占残基总数的三分之一，x常为Pro，y常为OH-pro(羟脯氨酸)和OH-lys（羟赖氨酸）。

（4）胶原蛋白的二级结构是由三条肽链组成的三股螺旋，这是一种右手超螺旋结构。螺距为8.6nm，每圈每股包含30个残基。其中每一股螺旋又是一种特殊的左手螺旋，螺距为0.95nm，每一螺圈含3.3个残基,每一残基沿轴向的距离为0.29nm

（5）原胶原蛋白分子在胶原纤维中都是有规则地按四分之一错位，首尾相接，并行排列组成纤维束。

（6）原胶原蛋白分子经多级聚合形成胶原纤维。在电子显微镜下，胶原纤维呈现特有的横纹区带，区带间距为60-70 nm，其大小取决于胶原的类型和生物来源。

蛋白质的四级结构：

定义：蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。

这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位(Subunit)，它一般由一条肽链构成，无生理活性或不具有完整生理活性。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。四级结构的类型：

（1）同聚体：由相同的亚基通过非共价键聚集而成的寡聚蛋白（2）异聚体：由不同的亚基通过非共价键聚集而成的寡聚蛋白（3）根据亚基的数目可以称：同**聚体，异**聚体

四级结构的维系：疏水力是维系四级结构的主要方式；亚基之间的契合关系。寡聚蛋白质与别构效应：别构效应（allosteric effect）：指蛋白质与配基结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象

别构蛋白质（allosteric protein）：具有别构效应的蛋白质，多为寡聚蛋白，包括活性部位和调节部位

同位效应：指别构蛋白质与一种配基的结合对于该蛋白和同种配基的结合能力的影响

正协同效应：第一个配基的结合引起第二个，第三个…配基更容易结合。这种同位效应称正协同效应

负协同效应：第一个配基的结合导致第二个，第三个 … 配基更难结合，这种同位效应称负协同效应

异位效应：如果蛋白质分子中，相互之间发生作用的部位是不同的，也即活性部位上所发生的反应将受到调节部位与效应物结合的影响，称异位效应血红蛋白的结构与功能：

组成：4个亚基组成，成年人红细胞由?、?两种亚基各两条构成。每条肽链都卷曲成球状，都有一个空隙容纳一个血红素，它们都能与氧气结合。以?2?2四聚体形式存在一分子Hb能与4分子氧气结合。分析Hb与氧气结合，发现Hb的4个亚基和4个氧气结合时平衡常数（Keq）并不相同。而是有4个不同的平衡常数，Hb与最后一个氧气结合时其结合力最大。 Hb与氧气结合将影响其四级结构，即亚基与亚基之间的相对位置发生变动，这种变化增强了Hb和O2的亲和力蛋白质各级结构之间的相互关系：各级结构之间的递进：

一级结构对高级结构的指导作用：一级结构是高级结构的基础；高级结构由一级结构和其他构象指导因素共同决定；（最低势能原则：分子的稳定构象往往是该分子内结构势能最低的状态）微环境和折叠辅助因子的影响。高级结构对低级结构的影响。

蛋白质（III）——蛋白质的主要研究技术

蛋白质的性质：

（一）胶体性质：蛋白质分子直径在1~100nm范围内透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开。丁达尔现象。水化现象。吸附现象。（二）酸碱性质：

等电点与电场迁移：蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移

一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用氨基酸侧链基团推算。（三）蛋白质的颜色反应：

①双缩脲反应：与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，540nm处有最大光吸收。

②米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这是酚类化合物的反应（Tyr）

③乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲哚基化合物的反应（Trp），明胶一般无此反应

④坂口反应：蛋白质加入次氯酸、?-萘酚、氢氧化钠可以生成红色化合物，胍基反应（Arg） ⑤酚试剂：福林（Folin）试剂，酚基（Tyr）可以把磷钼酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，Lowry法。

（四）光吸收性质：蛋白质在280nm处有强烈的光吸收，Phe、Tyr、Trp，其Trp贡献最大。蛋白质的沉淀与变性：

沉淀作用：蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。（1）可逆沉淀：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白质和其他物质分开：

①等电点沉淀法：调整pH至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离；适用于区分等电点差异大的亲水蛋白

②盐析与盐溶法：中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用；常用盐析剂：MgCl2、（NH4）2SO4、K2SO4

③有机溶剂沉淀法：改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用；常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质

（2）不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。

变性沉淀因素：高温，强酸碱，重金属盐，有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱，去垢剂：SDS（十二烷基磺酸钠）。

变性后蛋白质化学性质的改变：生物活性丧失，侧链基团暴露（颜色反应增强）。物理化学

性质改变：溶解性?、粘度?、扩散系数?。生物化学性质改变：易于酶解。蛋白质的分离纯化一般流程：

（1）前处理：分离组织、破碎细胞、去其他组分（注意问题：保持蛋白质的完整和活性）常用方法：超声粉碎，微研磨，酶消化，超速离心（2）粗分级

常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂

要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能收缩蛋白质溶液（3）细分级：进一步提纯

常用方法：层析、电泳（规模小，分辨率高）

（4）结晶：只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶。（结晶不一定意味着蛋白质已提纯）本身有一定提纯作用。蛋白质的纯度鉴定：

①活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性检测来确定纯度 ②抗原抗体效价法

③电泳、层析、超离心等方法

④恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否提纯。

⑥根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等蛋白质分离纯化常用技术：

（一）沉降分离（Sedimentation）：蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的差异。

（1）差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降速度的差异分离不同蛋白质。单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关。在生物化学中常用沉降系数（S）表征分子量：

定义：单位离心力场下的沉降速度 mp，分子颗粒质量（1-??）为浮力因子 f：摩擦系数

Svedberg单位：10-13秒，S

（2）密度梯度离心：利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密度的物质。常用蔗糖，CSCl等构建。

（二）层析、色谱（Chromatography）：（1）分配层析：一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从而区分不同的物质。

常用方式：分配柱层析，滤纸层析，薄层层析，离子交换层析，气相色谱

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高效液相色谱（HPLC）：利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积；溶剂系统采用高压，提高系统速度。（2）离子交换层析：

原理：利用不同离子在不同的pH下与固定相结合强度的差异，使待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交换，而与固定相结合，从而区分不同物质。

可分为：阳离子交换柱：强酸型、弱酸型；阴离子交换柱：强碱型、弱碱型常用介质：聚苯乙烯-苯二乙烯树脂，离子交换纤维素，离子交换葡聚糖洗脱方式：分段洗脱，梯度洗脱。

（3）分子排阻层析（molecular-exclusion Chromatography）原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。又称凝胶过滤、分子筛。

一般步骤：①柱平衡，②蛋白质混合物上柱，③洗脱液洗脱蛋白，④收集记录。

可以用于分析分子量：分子量与洗脱体积相关；排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的分子量。（4）亲和层析（Affinity chromatography）：原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开一般步骤：①制备交联有配体的层析柱；②蛋白质上样，平衡；③杂质洗脱；④可溶性配体洗脱目标蛋白质

（三）电泳（elecctrophoresis）：在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳电泳的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率：

带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用

? F(电场力)=qE(=qU/s) ? f(摩擦力)=fv

? q＝颗粒所带的电量

E＝电场强度或电势梯度＝U/s

U＝两电极间的电势差(以伏特表示) S= 两电板之间距离(以厘米表示)

f＝摩擦系数(与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关) v＝颗粒泳动速度(以厘米／秒表示)

? 当颗粒以恒速移动时，qE=fv ，即：v/E=q/f ，在一定的介质中对其一种蛋

白质来说q/f是一个定值，因而v/E也是定值，它被称为迁移率或泳动度：u=v/E

常见电泳形式：

（1）界面移动电泳：在U型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电泳过程中液面的移动来记录电泳结果。血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类

（2）区带电泳：在固定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成不同区带，可

以区分不同蛋白质。滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳

（3）SDS-盘式凝胶电泳：

1. 用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩胶和分离胶两部分. 2. 浓缩胶一般孔径较大，pH6.8，分离胶一般孔径较小，pH8.8 3. 样本加入SDS（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，使蛋白质分子带上均匀的负

电荷，分子形状变为一致的杆状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。 4. 具有：样品的浓缩效应，凝胶对分子的筛选效应。 5. 可以用于测定蛋白质分子量，以标准分子量的蛋白质做对照，迁移率与分子量的对数成反比。

6. 蛋白质可用考马斯亮蓝或者苯胺黑染色，也可将其转移到醋酸酯膜上，用相应的抗体鉴定，称west blotting

7. 样本与凝胶之间没有共价的结合，可以将电泳后的样本回收，复性后，将保持其功能。（4）等电聚焦电泳：利用蛋白质在等电点的pH时不会发生电场迁移的原理，缓冲液或固定介质中构建pH梯度，蛋白质“聚焦”在等于其等电点的pH点处，形成一个很窄的区带，从而区分不同的蛋白质。区分精度可以到0.02pH。

酶（I）——酶通论与酶促动力学

高效的生物催化剂——酶：

酶是生物催化剂，具有催化剂的普遍性质：提高反应速度，不改变平衡点；降低反应的活化能；自身在反应完成前后不发生改变不同于非酶催化剂的方面：

（1）催化效率高，可以提高反应速度108~1020，比非酶催化剂催化效率高出107~1013倍（2）具有高度的专一性，一种酶只作用于特定的一类甚至是一种物质，该物质称酶的底物（Substrate）

（3）酶容易失活，比一般催化剂要求的条件严格

（4）酶的催化能力受到严格的调节控制，如抑制剂、共价修饰、反馈调节、酶原激活、激素调剂等

（5）化学本质不同，酶是高分子物质，常带有辅酶、辅基（6）酶促反应常表现出底物饱和性酶的生物学意义:

（1）生命现象是由酶催化的多步反应的整合：营养素分子的分解；化学能的贮存和转换；从小分子前体合成生物大分子。

（2）酶是生物过程所必需的：在生理条件下无催化剂许多反应进行的太慢，不能适应生命的要求；由于细胞内环境的特殊，没有酶作为催化剂时许多生化反应不能进行（2）酶的研究是理解生命过程的必由之路：遗传现象的基础，帮助我们理解生物个体差异的由来，遗传缺陷引起代谢紊乱的机制；生理病理过程的发生机理，疾病的发生与治疗；应用于生物乃至于非生物产业。酶的化学组成：

（1）大多数是蛋白质(除小分子的有催化能力的RNA—核酶)

（2）一些酶的活性除肽链外不需要在酶的活性中心存在其他化学基团，称单纯酶

（3）另一些需要附加的非肽链成分的辅助因子(结合酶)：如果辅助因子与酶疏松地结合，

这种辅助因子称为辅酶；如果辅助因子与酶紧密地结合，这种辅助因子称为辅基。

（4）许多酶可以结合调节因子或共价修饰：这些因子并非酶催化所必须，但可以调节酶活性；包括激素、第二信使、钙调蛋白等；共价修饰包括：磷酸化、糖基化等。

（5）许多酶可以由多个亚基构成：可以同聚蛋白，也可以是异聚蛋白；可以分为催化亚基和调节亚基。酶活性的测定：

（1）酶活力与酶反应速度：

酶活力：指酶催化化学反应的能力，可以通过酶所催化的化学反应的速度来衡量。酶促反应

速度可以用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物增加量，反应速度的单位：浓度/单位时间。一般用最大反应速度来衡量酶的活性（2）酶的活力单位：

定义：一般指25?C，最适pH和底物浓度条件下，1分钟内能转化1?mol底物的最低酶量。酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数，称酶的比活力（U/mg蛋白质）酶的转化数，每秒每酶分子，转化底物的微摩尔数kcat 酶的分类与命名：（1）习惯命名法：（缺点：命名重复严重，难以统一） ①依据底物命名：底物+“酶”，e.g. 淀粉酶、蛋白酶 ②来源+底物+“酶”： e.g. 唾液淀粉酶、胃蛋白酶 ③反应性质+“酶”： e.g. 转移酶、氧化酶

④底物+反应性质+“酶”： e.g. 琥珀酸脱氢酶、谷丙转氨酶（2）系统命名法：（缺点：酶名太长，不便于记忆、书写、交流。“识繁写简”） ①底物+反应性质+“酶”

②列出全部底物，用“：”分隔

③反应性质按标准分类，出现同一底物同类反应时区分参与反应的基团 ④必要时列出反应的产物酶的标准分类：

? 氧化还原酶类：脱氢酶、氧化酶

? 转移酶类：在底物之间交换或转移基团 ? 水解酶类：催化底物加水分解

? 裂合酶类：催化底物失去或添加基团 ? 异构化酶类：催化同分异构体的相互转化

? 连接酶类：与ATP分解相偶联，催化两个底物合成一个产物的反应酶学编号：

? “EC”+酶大类编号+亚类底物编号+亚亚类号+序号 ? 之间用“.”分隔

? 可以通过酶学手册查出对应的标号。酶的应用：（1）抗体酶

具有酶催化活性的抗体：利用目标底物作为半抗原，免疫动物获得抗体，筛选或改造抗体，获得有催化活性的抗体

应用价值：专一性破坏病原体或病变组织（包括血凝块、血栓、硬化斑块等）；制药中的立体异构筛选；蛋白质结构分析、（2）酶工程：

定义：用工程学的手段和方法，改造酶或酶制剂，应用与生产的过程。目前有化学酶工程和生物酶工程。

化学酶工程：天然酶；化学修饰酶；固定化酶；人工模拟酶生物酶工程：基因工程大规模生产酶制剂（克隆酶）；基因修饰酶（突变酶）；全人工设计的新酶。

酶促反应动力学：米氏方程的导出

（1）酶促反应的中间产物理论与“稳态平衡”假说：酶促反应可分为两个阶段，第一步：酶与底物形成中间产物；第二步：中间产物分解，形成产物，并释放游离酶。两步反应都是可

逆的。各自具有反应平衡常数k1、k2、k3、k4。酶促反应处于稳态时，酶-底物中间产物的量相对稳定

（2）米氏方程：由中间产物理论可以得出酶促反应速度与底物浓度之间的关系。米氏方程的近似假设：底物浓度远大于酶浓度；稳态迅速建立；产物生成后立刻与酶分离；反应平衡倾向于底物?产物。米氏方程：

（一）米氏常数的意义：

（1）Km是酶的一个特征性常数：其物理意义为酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，单位为mol/L。只与酶的性质有关，与酶浓度无关。在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值

（2）可近似地表示酶与底物的亲和力：Km越小，表示酶与底物的亲和力越大；Km越大，表示酶与底物的亲和力越小

（3）如果一个酶有多个底物，则每个底物有一个对应Km， Km最小的底物是该酶的最适底物

（4）若已知Km ，就可计算出在某一底物浓度时，vo相当于vmax的百分率，如[S]=3 Km则v0=0.75vmax

（5）在可逆反应中，两个值中最小的反应方向是该酶促反应的主要方向（6）如果代谢途径各酶的Km值已知， Km值最大的酶是限速酶（二）Km与vmax的确定：

双倒数作图（Lineweaver-Burk法）：将米氏方程两侧取倒数，可将方程形式转变为直线；该直线在纵轴上的截距为1/ vmax；直线延长线与横轴交点为-1/ Km；作图方便，但存在点分布不好的缺陷。

v- v/[S]作图（Eadic-Hofstee法）：将米氏方程改写成V与V /[S]的函数，方程形式为一直线；直线斜率为- Km；横轴截距为： vmax/ Km

（三）多底物的酶促反应：依次反应机理；随机反应机理；乒乓反应机理；动力学问题酶抑制剂的反应动力学：

酶的失活与酶的抑制：因为变性因素而引起酶活性的丧失，称失活作用。一些物质与酶结合不引起酶蛋白变性，而导致酶活性的下降，称抑制作用，这些物质称抑制剂。抑制剂的类型：

①可逆抑制剂：抑制剂与酶以非共价键结合；能用透析、超滤方法除去抑制剂，使酶的活性恢复；可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。

②不可逆抑制：抑制剂与酶以共价键结合；不能用透析、超滤方法除去抑制剂；酶的修饰抑制

可逆抑制剂的抑制原理与反应动力学：

（1）竞争性抑制：抑制剂与底物相似，可以竞争性地与酶的活性中心结合。增加底物的浓度可以解除抑制。抑制剂不影响酶促反应的最大反应速度，但减弱酶与底物的亲和性，提高Km

（2）非竞争性抑制：抑制剂与底物不相似，抑制剂是与活性中心外结合位点结合。可形成酶-抑制剂—底物三元复合物。不改变酶与底物的亲和性，Km不变；但会引起最大反应速度下降

（3）反竞争性抑制：酶与底物先结合，然后再与抑制剂结合。稳定酶与底物的复合物，抑制产物释放。增加酶与底物的亲和性， Km下降；最大反应速度下降。三者的区别总结：

不可逆抑制剂的作用：

作用特点：“全或无”的抑制方式；增加酶量可以解除不可逆抑制剂的影响不可逆抑制剂的类型

? 有机磷化合物：作用于Ser、Thr羟基

? 有机汞、有机砷化合物：作用于含巯基的酶（包括辅酶、辅基） ? 氰化物、CO等：与Fe2+ 结合，抑制细胞呼吸相关的酶 ? 烷化剂：碘乙酸等，使巯基烷化

? Kcat型不可逆抑制：某些物质本身不具有抑制剂功能，但被酶催化发生反应后，转变为不可逆抑制剂，称为Kcat型不可逆抑制，也称“自杀性底物” 影响酶活性的其他因素：

（1）温度酶活性与温度的关系

酶的温度范围与最适温度

（2）pH

酶活性与pH的关系酶的最适pH

（3）酶的激活剂

凡能增强酶活性的物质称为激活剂

必需激活剂：激活剂与酶结合后酶才有活性

非必需激活剂：激活剂与酶的结合使酶活性由弱变强包括：金属离子、阴离子、有机小分子

酶（II）——酶促反应机理与活性调节

酶促反应的专一性机理：酶的活性中心：

? 存在于酶分子表面的具有结合和催化底物形成产物的空间区域 ? 活性中心=结合基团+催化基团

? 必须基团=结合必须基团+催化必须基团+活性中心外必须基团 ? 结合部位决定酶的专一性

? 催化部位决定酶所催化反应的性质 ? 活性中心在一级结构上不具有连续性 ? 酶活性与活性中心的高级构象关系密切 ? 底物与酶的结合一般是非共价的研究酶活性部位的方法：（1）化学修饰法：

? 用某些化学试剂与酶分子侧链基团以共价键结合，观察酶的活性改变，以确定活性中心的氨基酸残基

? 如果共价修饰后酶活性不受影响，则修饰的氨基酸残基不是活性中心内的；如果酶活性丧失或降低，则修饰的氨基酸残基可能位于活性中心内

? 修饰剂浓度与酶失活或降低的程度是否成正比，如果成正比，则修饰位于活性中心内 ? 底物或可逆抑制剂与酶鲒合后能否再被修饰剂共价修饰，如果能被修饰，则修饰部位不在活性中心内

（2）定点诱变法：

? 对于氨基酸或基因序列已知的酶，用改变氨基酸残基的方法确定活性部位的方法 ? 如果被代换的氨基酸不影响酶的活性，则该位置的氨基酸残基不是必须基团

? 如果被代换的氨基酸使酶活性丧失或降低，则该位置的原有氨基酸残基是必须基团 ? Vmax不变，Km值升高，该位置氨基酸为结合基团 ? Vmax降低，Km值不变，该位置氨基酸为催化基团 ? 酶活性完全丧失，该位置氨基酸为必须基团（3）辅酶、辅基连接法：

? 辅酶、辅基一般连接于活性中心

? 对于共价连接的辅基，变性后仍然与原Aa相连

? 非共价结合的辅酶，可以共价交联剂，将其与周围Aa交联，进而研究比邻关系酶促反应的专一性机理：酶专一性分类：

结构专一性：绝对专一性、相对专一性（基团专一性、族专一性、键专一性）立体异构专一性：旋光异构专一性、几何异构专一性诱导契合假说：

当酶活性中心与底物相互接近的时候，酶和底物之间相互诱导，使彼此的构象发生有利于相互结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合，进行反应

动力学原理：诱导契合比简单的刚性契合“模板”假说更能解释酶的催化高效性

主要证据：酶的活性取决于活性中心的构象；活性中心构象比其他部分更容易发生变化，这与酶—底物的诱导契合相一致；X-衍射的结果显示：酶活性中心结合底物之前，和结合底物之后的构象有较大的变化。

在大多数情况下酶分子要比底物分子大，所以一般构象改变以酶为主。酶促反应的催化原理：常见的催化机理： ? 邻近定向效应 ? 形变与张力 ? 共价催化 ? 酸碱催化

? 酶活性中心是低介电区域几个酶的催化实例： ① 溶菌酶 ② 丝氨酸蛋白酶家族：活性中心包含Ser催化基团：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白

酶、凝血酶、纤溶酶 ③ 天门冬氨酸蛋白酶家族：活性中心包含2个Asp催化基团：胃蛋白酶、凝乳酶、肾素、

HIV-1蛋白酶酶活性调节：

酶的别构调节效应：

（1）别构酶：某些酶分子在活性中心外存在另一配体的结合部位(别构部位)称为别构酶；由多个亚基构成，有四级结构；不遵循米氏方程

（2）别构调节剂：能与别构部位结合的配体称别构效应剂，具有别构效应的酶称别构酶。别构效应有别构激活(正协同效应)和别构抑制(负协同效应)两种。代谢底物经常是别构酶的别构激活剂，代谢产物往往是别构抑制剂（4）别构酶的动力学曲线及其意义：

正协同效应，S型曲线，在较小的底物浓度变化范围内产生较大的反应速度差异，实现对酶促反应的有效控制

负协同效应，与米氏方程类似，但表现出低浓度对底物浓度依赖性较大，高浓度则对底物浓度不敏感

（5）别构酶的动力学模型：齐变模型， MWC模型序变模型，KNF模型

（6）反馈调节与别构酶：连续代谢过程的反馈调节限速酶（别构酶）效应物

共价调节酶：

定义与特点：可以通过共价修饰改变活性的酶称共价调节酶。在修饰过程中，酶的活性在无活性(或低活性)与有活性(或高活性)两种状态中改变。共价修饰的互变是由不同的酶催化的。属于酶活性的快速调节。由激素信号启动的共价修饰会引起级联放大效应常见调节方式：磷酸化与去磷酸化；甲基化与脱甲基化；腺苷化与脱腺苷化；—SH与—S—S—互变

动力学改变：满足米氏方程；修饰前后，Km、Vmax将发生改变。

酶原的激活：定义：许多酶在体内存在无活性的前体形式，称酶原；酶原转变为有活性的酶的过程称酶原的激活

常见形式：切去多余的肽段。与共价修饰相比最大区别在于不可逆

生物学意义：酶的储存形式；肌体自我保护；对外界刺激快速反应；增加基因表达后调控的形式

实例：消化酶的激活；凝血过程。酶的其他调节方式：（1）多酶体系

? 连续的代谢反应链的若干催化酶相互聚集在一起，形成一个反应链体系，称多酶体系 ? 可分为：可溶性的、结构化的、在细胞结构上有定位关系的三种。 ? 多酶体系的自我调节：终产物的反馈调节

? 限速步骤：多酶体系总速度取决于其中反应速度最慢的一步，称限速步骤。（2）同工酶

? 催化同一种化学反应，但酶蛋白的分子结构组成却有所不同的一组酶。 ? 乳酸脱氢酶（LDH）：4个亚基构成、有两种不同的亚基类型（H、M），形成5种不同的同工酶，它们对底物的Km值是不同的。

? 生物意义：代谢调控；遗传分化；疾病治疗

核酸（I）——核苷酸与核酸

核酸概述：核酸是由核苷酸聚合形成的线状多聚核苷酸链

DNA：含D-2-脱氧核糖，胸腺嘧啶；主要的遗传物质；可以通过复制将遗传信息传到子代 DNA的分布：真核细胞细胞核或原核细胞核区；线粒体、叶绿体；DNA病毒 DNA的存在形式：

线状双链：真核细胞染色体，DNA病毒

环状双链：原核细胞染色体，细胞器DNA， DNA病毒线状或环状单链：DNA病毒

RNA：含D-核糖，尿嘧啶；与遗传信息的表达及其调控有关；常以单链形式存在

RNA分布：真核细胞细胞核、细胞质；原核细胞的质区；叶绿体、线粒体；RNA病毒 RNA种类：tRNA、rRNA、mRNA、辅助RNA、病毒RNA 核苷酸：

（一）构成：核苷酸由核糖（脱氧核糖）、碱基、磷酸构成。核糖与碱基构成核苷

（1）核糖：为五碳戊糖，其醛基与C4?位羟基缩合形成半缩醛，因此整个分子形成一个五元环。在C 1?位连接碱基，与嘧啶环上的N1或嘌呤环上的N9相连。脱氧核糖，C 2?位上羟基被H取代。5?、3?位连接磷酸。（2）碱基：常见碱基包括：A、T、G、C、U。稀有碱基：常见碱基修饰而获得，多见于tRNA。

（二）核苷酸的类型：

常见于核酸的核苷酸： DNA有：dA、dT、dG、dC； RNA有：A、U、G、C

其他核苷酸类型：三磷酸核苷酸：高能磷酸化合物，能量货币；环核苷酸：第二信使；稀有碱基核苷酸。

（三）核苷酸的连接：

核苷酸通过3?，5?-磷酸二酯键连接形成核酸，有方向性。一条核酸链有一个5?末端，一个3?末端。核酸内部的核苷酸排列方式称核酸一级结构，书写规则如下：5??3?，用直线代表核糖（脱氧核糖）， 5?在下方、碱基在上方，P表示磷酸，OH表示羟基。简式：直接用碱基符号代表核苷酸，表明末端磷酸化情况。

DNA的结构与功能：（1）DNA的一级结构：

? 脱氧核苷酸通过3?，5?-磷酸二酯键连接形成，分子量巨大的细长柔性分子（DNA是分子量十分巨大的分子，最大可超过108 bp，分子量大于 1?1011，可编码大量信息）

? 超过100种的DNA序列已经清楚，包括人、病毒、E.Coli酵母菌、线虫、拟南芥菜、玉米和水稻

? 原核和细胞器DNA的基因是连续的，没有内含子，很少重复序列和调控序列

? 真核生物的基因是断裂的，含有内含子，有众多的调控序列和重复序列，重复序列有低重复、中等重复和高度重复序列

? 人类基因组中编码蛋白质的基因约为31000个，酵母6000，果蝇13000，蠕虫18000，植物26000

（2）DNA的二级结构：

DNA二级结构的证据：Chargaff规则；电位滴定行为；X射线衍射双螺旋结构要点：

? 两条反向平行多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕

? 嘌呤与嘧啶碱基在内侧，碱基平面与纵轴垂直，磷酸与核糖在外侧，糖环平面与纵轴平行，右手螺旋

? 双螺旋平均直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm，两核苷酸间夹角为36?，每一圈10个核苷酸，螺距为3. 4nm

? 两条链通过碱基配对，由疏水作用和氢键维系在一起，两条链对应位置核苷酸按A-T，G-C互补配对， A与T形成两个氢键，G与C形成三个氢键，为双螺旋结构主要侧向稳定力

? 碱基平面之间的疏水力（碱基平面堆积力）为主要纵向稳定力 ? 由于两链间的相互缠绕，双螺旋表面形成大沟和小沟（Groove） DNA双螺旋结构的不同类型：

? A型：相对湿度75%条件下DNA的结构，螺体宽而短，碱基对与中心轴之间形成19?倾角，RNA与DNA杂合双链也呈A型

? B型：相对湿度92%条件下DNA的结构，为标准的双螺旋。

? Z型：左手螺旋，只有明显大沟，小沟在结构上几乎不可见。某些癌细胞的DNA，表达活跃的DNA中常有Z型构象存在

? 三股螺旋：在某些富含嘌呤的区段，如果临近的区域有富含嘧啶的区域，或有外源性的与其互补的寡聚核苷酸链，就可以形成三股螺旋（3）DNA的三级结构： ①超螺旋结构：

DNA分子可以在双螺旋的基础上，进一步绕同一中心轴扭转，造成额外的螺旋。环状分子的额外螺旋可以形成超螺旋： ? 超螺旋可以是右手螺旋（正超螺旋），也可以是左手螺旋（负超螺旋） ? 对于环状分子而言，有其拓扑学上特定规律：L=T+W ②其他三级结构：

与蛋白质结合形成复合体（病毒）：直接与蛋白质结合。可以进一步形成高级结构核小体结构：真核细胞染色体。与组蛋白结合（4）DNA的高级结构：

①原核生物染色体：没有组蛋白，没有骨架蛋白；其上一般有DNA聚合酶，RNA聚合酶；有操纵子结构；与mRNA、核糖体、未成熟的蛋白质并存

②真核生物染色体：与组蛋白结合形成核小体结构，并进一步装配与核骨架蛋白结合形成染色体；有非组蛋白与DNA结合，实现对基因表达的调控；基因结构更为复杂；不与mRNA、核糖体直接接触。

③染色体外DNA分子：质粒，cccDNA；细胞器DNA （5）DNA的生物学功能主要生物学功能：以核苷酸碱基序列的形式储存遗传信息；通过复制在亲代与子代间传递遗传信息；作为模板指导mRNA的合成，表达遗传信息证明DNA是遗传物质的实验： ? Avery，转化实验

? Conrat，植物病毒拆分重建实验 ? Hershey & Chase，噬菌体感染实验 RNA的结构与功能：（1）RNA一级结构概述

? 通常为线状核苷酸单链，无分支

? RNA分子通常是DNA片段转录生成的，因此RNA分子与DNA相比要小的多 ? RNA种类多样，参与蛋白质合成的RNA有：信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）

? RNA分子中稀有碱基的含量比DNA丰富，尤其在tRNA中最为突出，约占10％左右 ※ mRNA结构特点：

? 线状分子，分子量差异大，寿命较短

? 原核生物的mRNA是多顺反子(多个基因转录到一个mRNA分子上)，编码多个蛋白质 ? 真核生物的mRNA是单顺反子(一个基因转录到一个mRNA分子上)，只编码一条肽链 ? 真核生物的mRNA分子存在5?-帽子结构和多聚A尾巴（5?-帽子结构：真核mRNA 5?-末端的特殊结构，一般5?-末端为m7Gppp-，后面含若干修饰碱基。 Ploy-A尾：真核mRNA 3?-末端的特殊结构，长度不等的多聚腺苷酸。）

mRNA功能：以DNA为模板，传递遗传信息；参与蛋白质表达的调控。 ※ tRNA：

①一级结构特点：

? 由70-90个核苷酸组成，分子量25Kd，沉降系数4S左右 ? 5?-端大多为pG，少数pC

? 3?-端为CpCpAOH，可以接受活化的Aa，称接受末端 ? 含有较多的稀有碱基

②二级结构特点：分子内部，部分碱基互补配对，使整个分子形成由“臂”和“环”组成的三叶草形结构：

? 氨基酸臂：通常7对碱基构成，富含G，包含两个末端，3?-末端的CCA未参与配对，

呈单链状态，可以接受活化的Aa ? 二氢尿嘧啶环(D环）：8-12个核苷酸构成，含2个二氢尿嘧啶，通过由3-4对碱基构成

的双螺旋区（二氢尿嘧啶臂）与其他部分相连。

? 反密码环：7个核苷酸构成，中部为反密码子，常含次黄嘌呤核苷酸，通过5对碱基构

成的反密码臂与tRNA其余部分相连。与mRNA结合

? 额外环：3-18个核苷酸构成，不同tRNA有很大差异，可以用于tRNA的分类

? T?C环： 7个核苷酸构成，几乎都包含T?C序列，通过5对碱基构成的T?C臂tRNA

其余部分相连，与核糖体中5s rRNA结合 ③三级结构特点：倒L型结构，反密码臂与D臂同一轴线，氨基酸臂与T?C臂在同一轴线。

两轴线接近垂直：与核糖体的空穴互补；T?C序列参与和rRNA的结合。 tRNA的生物学功能：

? 携带Aa到核糖体参与蛋白质合成

? 参与核糖体大亚基与小亚基之间的装配

? 通过自身的反密码子识别mRNA上的密码子，决定Aa的参入顺序 ? 作为引物参与逆转录过程 ? 对蛋白质的表达有调控作用

※ rRNA：占RNA总量的80%；核糖体由40%的蛋白质和60%的rRNA构成；由很多臂环结构构成，碱基可与分子上相隔长距离的互补序列相互配对，高级结构复杂真核生物的核糖体（80S）：

? 大亚基：60S，含28S、5.8S、5S三种rRNA ? 小亚基：40S，含18S rRNA

原核生物的核糖体（70S）

? 大亚基：50S，含23S、5S两种rRNA ? 小亚基：30S，含16S rRNA

rRNA功能：与蛋白质结合稳定核糖体构象；蛋白质合成的催化者 ※ 其他RNA：

①hnRNA：不均一分子量；真核生物mRNA的前体；包含内含子

②snRNA：小分子量RNA，58-300b；广泛分布在细胞核和细胞质，有些与蛋白质结合 snRNA功能包括：帮助hnRNA、rRNA前体剪切成熟的功能；控制细胞分裂和分化；协助胞内物质运输；构成染色质

③asRNA：反义RNA；通过互补序列与特定mRNA结合，抑制mRNA的翻译；应用于水果防腐烂，抗病毒，抗肿瘤

④有催化功能的RNA：有些RNA，具有酶活性，可以催化生物反应。RNA催化反应包括：rRNA的成熟、肽键形成.

核酸（II）——理化性质和研究方法

核酸理化性质：

（一）一般理化性质： ? 两性解离，一般为酸性

? 微溶于水，不溶于一般有机溶剂 ? DNA溶液粘度极高，RNA则小得多

? 化学反应：D-核糖与浓盐酸-甲基间苯二酚（苔黑酚）共热产生绿色，RNA测定反应；D-脱氧核糖与酸和二苯胺一同共热分成蓝紫色，DNA测定反应。（二）光吸收性质：

核酸在260nm处有强烈光吸收，可以通过OD260来定量分析核酸： 1OD= 50?g/ml双螺旋DNA， 40?g/ml单链DNA（RNA），或20?g/ml单核苷酸 OD260/OD280可以鉴别核酸的纯度，DNA为1.8，RNA为2.0 （三）核酸的变性与复性：

变性：核酸原有的碱基配对关系和高级构象被破坏，成为无规线团，对DNA而言也指双螺旋的无规则拆分

变性后核酸性质的改变：光吸收增加，增色效应；粘度下降；浮力密度提高；生物学功能减弱或缺失

变性的因素：破坏氢键的因素；妨碍碱基堆积的因素；增加磷酸基静电斥力的因素

DNA热变性与Tm：

DNA的稀盐溶液加热到一定温度后，260nm的光吸收会骤然增加，增加幅度40%，表明DNA的热变性是一个突变过程。

熔解温度Tm：定义DNA热变性过程中，紫外光吸收增量到最大增量一半的温度为Tm 影响Tm的因素：

? 核酸均一性：均一性愈高，熔解过程的温度范围愈窄 ? G-C对含量： G-C对含量越高， Tm越高，在1?SSC溶液中，(G-C)%=(Tm-69.3) ?2.44。SSC溶液：0.15mol/L NaCl, 0.015mol/L柠檬酸钠 ? 溶液离子强度：离子强度越低， Tm越低

? 溶液pH：高pH容易变性， pH低于5.0则容易脱嘌呤 ? 变性剂：甲酰胺、尿素、甲醛

核酸的复性：变性核酸的高级构象在适当的条件下重新恢复的过程称核酸的复性，对DNA而言指双螺旋结构的恢复。

热变性的DNA的复性过程，需要缓慢的冷却过程，也称退火核酸复性过程中光吸收下降，称减色效应影响核酸复性的因素：

? 温度，复性温度不宜过低，一般以Tm-25?C为宜。 ? 核酸单链的浓度，一定范围内与浓度正相关 ? 核酸长度，分子量大的复性慢 ? 片段内重复序列多，易于复性

? 离子强度，一定的离子强度有利于核酸复性

分子杂交：在复性的过程中，不同来源的核酸片段，可能因具有互补片段而相互结合形成双链，称分子杂交。核酸的水解：

（一）核酸的酸水解和碱水解：核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别：

? 在0.1mol/L的NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2?-或3?-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响

? 这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2?-OH的邻基参与作用有很大的关系，在RNA水解时，2?-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物

酸易水解N-糖苷键，嘌呤碱基比嘧啶碱基易被酸水解

? 脱氧核糖比核糖的糖苷键易水解，DNA的嘌呤碱在pH2以下即脱落而成无嘌呤酸（二）核酸的酶水解： ①核酸酶的分类：

? 按底物专一性分：RNA酶(RNase)，DNA酶(DNase) ? 按作用方式分：核酸内切酶，核酸外切酶

? 按作用键分：分水解3?-磷酸酯键和5?-磷酸酯键的核酸酶产物分别是5?-磷酸核苷和3?-磷酸核苷

②常用的几种核酸内切酶：

? 牛胰核糖核酸酶(RNaseI)，水解嘧啶3?-磷酸和其他核苷酸5?-OH形成的酯键，产生3?-末端为3?-磷酸嘧啶核苷酸的核酸片段

? 核糖核酸酶T1，发现于米曲霉，水解3?-鸟苷酸与其他核苷酸5?-OH形成的酯键，产物为3?-鸟苷酸为末端的寡核苷酸

? 牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseI)，水解DNA 3?-磷酸酯键，产生5?-磷酸的寡核苷酸，平均长度为4个核苷酸

? 牛脾脱氧核糖核酸酶(DNase II)，水解DNA 5'-磷酸酯键，产生3?-磷酸的寡核苷酸，平均长度为6个核苷酸限制性内切酶：

? 可识别特异的碱基序列并将其水解断开，产物带5?-磷酸基，已发现数千种，是基因工程的重要工具酶 ? 回文序列

? 粘性末端与平头末端 ? 限制性酶切图谱常用核酸外切酶： ? 蛇毒磷酸二酯酶：水解3?-末端核苷酸与相邻核苷酸之间的3?-磷脂键，产生5?-磷酸NMP ? 牛脾磷酸二酯酶：水解5?-末端核苷酸与相邻核苷酸之间的5?-磷脂键，产生3?-磷酸NMP N-糖苷酶：水解碱基与核糖之间的糖苷键；产物为含氮碱基和无碱基末端的寡核苷酸核苷酸酶：水解核苷酸的磷脂键；产物为核苷和磷酸常用研究技术：

（1）核酸的分离纯化：一般原则：条件温和，避免断裂；抑制核酸酶，避免降解；区分不同类型核酸。（2）DNA的分离：

? 主要在于除去Pr、RNA

? 在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下用蛋白酶消化细胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去RNA，操作在低温下进行，防止过酸、过碱、或机械振荡，可得高质量的DNA ? 真核生物染色体DNA与蛋白质的复合物(DNP)溶于水和浓盐溶液，但不溶于0.14mol/L的盐溶液，用苯酚或氯仿使蛋白质变性，DNA溶于水相

? 原核生物染色体DNA结合蛋白质较少，较易分离，用溶菌酶和SDS破碎细胞后，用氯仿异戊醇抽提Pr，再乙醇沉淀，重新溶解后用RNase除去RNA

? 质粒DNA为cccDNA，分子量较小，有超螺旋，因此密度和染色体DNA有明显的不同，可以用超离心分开

（3）RNA的分离纯化：RNA易被广泛存在的RNase水解，所有器皿与溶液都要经过处理除去RNase，在破碎细胞的同时应使RNase失活，在实验反应体系中要加RNase的抑制剂，常用皂土、二乙基焦碳酸、肝素、精胺。目前常用的分离方法：

? 胍盐／氯化铯密度梯度离心(RNA密度>1.89，DNA密度约1.71，蛋白质密度<1.33)． ? 酸性胍盐／酚／氯仿法常用分离纯化技术：（1）沉降分离

? 利用沉降速度和密度的不同分离核酸

? RNA常用蔗糖密度梯度、DNA常用CsCl密度梯度

? 沉降次序：RNA>闭环DNA>线状DNA>有开口的环状DNA ? 碱基组成对密度有影响

? 加入啡啶溴红染料，作为指示剂（2）凝胶电泳

? 影响因素：胶浓度；核酸分子大小；核酸构象；碱基组成

? 电泳迁移率次序：超螺旋DNA>线状DNA>有开口的环状DNA

? RNA分离时，常加入蛋白质变性剂，如甲醛 ? 加入碱基染料作为指示剂

? 电泳后核酸可用于分子杂交，也可回收使用