徐昊-D301R固定化酶催化生产生物柴油最优条件

分类号 编号

烟 台 大 学 文 经 学 院 毕 业 论 文（设 计）

D301R固定化酶催化生产生物柴油最优条件

Optimal conditions of immobilized enzyme D301 R catalytic production

of biodiesel

申请学位：生物工程 学士 系 别：食品与生物工程系 专 业：生物工程 班 级：文生085--1 姓 名：徐昊

学 号：200890519135 指导老师：姜爱莉（副教授）

2012年5月5日 烟台大学文经学院

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D301R固定化酶催化生产生物柴油最优条件

Optimal conditions of immobilized enzyme D301 R catalytic production

of biodiesel

姓 名： 徐昊

导 师： 姜爱莉

2012年5月5日 烟台大学文经学院

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[摘要] 以D301R大孔树脂为载体进行脂肪酶的固定，通过单因素和正交实验优化固定化条件，得到高活性固定化脂肪酶并对其催化生产生物柴油的最优条件进行研究，结果表明：最优固定条件为：酶/树脂10%（w/w），加水量30%（w/w），异辛烷中4 ℃下固定5 h；催化反应的最优条件为：加酶量67 mg/g,加水量67 μL/g,正己烷0.5 mL/g,甲醇分三次流加，40 ℃下进行反应；反应后最高酯化率为67.24%。固定化酶具有良好的酯化能力。

关键词 大孔树脂；脂肪酶；固定化；生物柴油

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Abstract：In this paper ,lipase was immobilized onto macroporous resin D301R. The immobilized conditions were optimized though single-factor test and orthogonal design. The Optimal conditions and esterifying capability of the immobilized lipase were systematically studied. The results showed that the optimum immobilized conditions were as follows: 10% lipase (enzyme/resin, w/w) was immobilized in isooctane microenvironment contained 30% water at 4 ℃ for 5 h. The optimal conditions for catalytic reaction were as follows: 67mg/g enzyme concentration (enzyme/ acid grease, w/w) add in reaction system contained 67 μL/g water and 0.5mL/g n-hexane, methanol added in three times, at 40 ℃. The highest esterification rate after reaction was 67.24%. Immobilized lipase displayed good esterification ability . Key words：macroporous resin；lipase；immobilization；biodiesel

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目 录

1 文献综述...................................................................................................................................... 1

1.1 生物柴油简介 .................................................................................................................... 1

1.2 生物柴油生产方法 ............................................................................................................. 1 1.3 脂肪酶的简介 .................................................................................................................... 2 1.4 固定化酶简介及固定化方法 ............................................................................................... 3

1.4.1 吸附法 .................................................................................................................... 3

1.4.2 共价结合法 ............................................................................................................. 4 1.4.3 交联法 .................................................................................................................... 4 1.4.4 包埋法 .................................................................................................................... 4 1.5 游离脂肪酶与固定化脂肪酶的比较..................................................................................... 4 1.6 国内外研究进展................................................................................................................. 5 1.7 立题意义及背景................................................................................................................. 6 2 材料与方法 .................................................................................................................................. 7

2.1 实验材料 ........................................................................................................................... 7

2.1.1 实验仪器................................................................................................................. 7

2.1.2 实验原料及试剂 ...................................................................................................... 7 实验方法 .................................................................................................................................... 8

2.2.1 固定化载体预处理................................................................................................... 8 2.2.2 固定化载体制作流程 ............................................................................................... 8 2.2.3 脂肪酶的固定化 ...................................................................................................... 8 2.2.4 脂肪酶水解活力的测定............................................................................................ 8 2.2.5 固定化条件优化 ...................................................................................................... 9 2.2.6 固定化酶催化酯化反应条件优化.............................................................................. 9 2.3 分析方法 ........................................................................................................................... 9

2.3.1 酸价的测定 ............................................................................................................. 9 2.3.2 酯化率的计算方法]...................................................................................................10 2.3.3 酶活力测定 ............................................................................................................10

2.3.4 固定化酶固定稳定性 ..............................................................................................10

3 结果与分析 .................................................................................................................................12

3.1 壳聚糖/树脂比例对固定化的影响 .....................................................................................12 3.2 戊二醛浓度对固定化的影响 ..............................................................................................12 3.3 脂肪酶固定化正交试验 .....................................................................................................13 3.4 固定化酶催化酯化反应条件优化 .......................................................................................14

3.4.1 酶用量的影响.........................................................................................................14 3.4.2 水含量的影响.........................................................................................................15

3.4.3 有机溶剂种类影响..................................................................................................16 3.4.4 有机溶剂用量的影响 ..............................................................................................16

3.4.5 反应温度的影响 .....................................................................................................17 3.4.6 甲醇流加次数影响..................................................................................................18

结论 .................................................................................................................................................20 致谢 .................................................................................................................................................21 参考文献 ..........................................................................................................................................22

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1 文献综述

当前，全球经济发展迅猛，对石油的依赖和需求不断增强，由于石油资源逐渐枯竭，从而导致了历年来国际油价不断攀升，2008年更是突破每桶100美元大关，后来一度逼近每桶150美元，当前油价虽略有下调，但能源危机已经成为制约世界经济发展的重要因素[1]。另一方面，由于工业高度发达，大量的石化燃料燃烧排放了过多的CO2 等废气，造成温室效应、酸雨等破坏，导致了全球性的环境恶化。

能源危机和环境污染成为当今人类面临的两大难题。为了缓解这两大世界难题，人类正努力寻找可替代的清洁能源，生物柴油作为一种绿色的可再生的替代能源，已引起全球的关注与重视。生物柴油可生物降解，无毒，可燃烧，是一种环境友好型燃料。20世纪80年代以来，生物柴油的生产技术迅速发展，世界各国一直在制定开发可再生资源规划，生物柴油研究正蓬勃发展。

1.1 生物柴油简介

生物柴油(Biodiesel fuel)是脂肪酸单烷基混合物[2]，是以油料作物和水生植物油脂以及动物油脂等为原料油，通过酯交换工艺制成的可再生性柴油燃料[3]。是用油脂或长链脂肪酸与甲醇等低碳醇合成的脂肪酸甲酯[4]。生物柴油是含氧量极高的复杂有机成分的混合物，这些混合物主要是一些分子量大的有机物。目前生物柴油主要是用化学法生产，以甲醇为溶剂，用强酸或强碱催化动植物油脂制备。但化学法存在工艺复杂，醇消耗量大，产物不易回收，环境污染大等缺点。利用酶法生产生物柴油具有条件温和、醇用量小、产品易于收集、无污染物排放等优点，但低碳醇转化率低，酶的成本高，酶的寿命短仍是此类方法需要解决的问题

[5]

。因此，为降低生产成本和改善催化效率，国内学者开展了一系列工作，并获

得了一些最新的研究成果。

1.2 生物柴油生产方法

目前为止，制备生物柴油方法有以下四种，分别是：直接混合法[6]、乳化法、[7]

、高温裂解法[8]和酯交换法[9]。

(1)直接混合法

直接混合法是将植物油和石化柴油按照一定比例混合，使植物油的密度降低、粘度下降，直接作为发动机燃料。该方法虽然工艺简单，但是生物柴油质量不高，长期使用会造成堵塞喷嘴、无法继续工作等问题。

(2)微乳化法

微乳化是将植物油与甲醇、乙醇和1-丁醇等溶剂形成微乳化液，从而使植物油稀释降低粘度。该方法工艺简单，但是受到环境条件的限制，环境条件的变化会发生破乳现象。

(3)高温裂解法

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高温热解是在高温或高温和催化剂的作用下，使植物油的分子链断裂，转化为结构简单的小分子物质。该方法过程简单，没有污染物产生，但是裂解设备昂贵，稳定性稍差，造成产品成本过高，不能达到工业化生产的程度。

(4)酯交换法

该方法是用低碳醇，与甘油三酯反应，取代甘油三酸酯的甘油基，形成脂肪酸低碳醇酯。多用甲醇和乙醇两种低碳醇，其中甲醇最常用，一方面是由于甲醇价格较低，另一方面是由于其具有碳链短、极性强等特点，能够很快与脂肪酸甘油酯发生反应，通过反应可降低甘油三酯的黏度。

酯交换法又可分为三种类型，分别是：化学催化法、超临界流体法和生物酶法。

化学催化法

化学催化法又分为碱催化法和酸催化法。酸催化法产率高，但产物分离困难，反应速度慢，且容易对环境造成污染。而碱催化法反应速度快且转化率高，但由于游离酸会使催化剂中毒，因此不能处理地沟油、酸化油等废油，而且还存在着副反应多、乳化现象严重、污染环境的缺点。

超临界流体法

超临界流体法是将在超临界状态下的醇类物质与油脂类物质进行酯交换反应。该法的产率较高，同时避免了使用催化剂所必须的分离纯化过程，但是其反应设备要求高、能耗大、生产容量小、生产成本高。

生物酶法

生物酶法是用脂肪酶替代酸碱催化剂，催化油脂与低碳醇进行酯交换反应。因为酶作为一种生物催化剂具有很高的催化效率。该法反应条件温和、产物提取简单、醇用量小、甘油易回收，并且无污染排放。但是，酶的稳定性不高，容易被甲醇毒害而失活，因此，人们开始关注固定化酶的制备，以提高其稳定性和使用寿命。

图1 油脂与甲醇酯交换反应方程式

Fig. 1 The reaction equation of oil and methanol transesterification

1.3 脂肪酶的简介

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。它是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯

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及其他一些不溶性酯类的水解、醇解、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，具有高效、高选择性、条件温和和环境友好等特点[10]

。脂肪酶在不同反应体系中发挥活性作用，在有机相中可以酶促合成酯交换，而在水界面促进酯水解。

脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成，活性中心靠近分子疏水端。 脂肪酶结构有2个特点：

(1)脂肪酶都包括同源区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-GlyY-Gly-His-Ser-W-Gly (X、Y、W、Z是可变的氨基酸残基)；

(2)活性中心是丝氨酸残基，正常情况下受1个α-螺旋盖保护[11]。

或

1.4 固定化酶简介及固定化方法

固定化酶(immobilized enzyme)，酶本身还是溶于水的，是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，酶即可以表现催化活性又可以重复利用。经过物理或化学方法处理后的酶，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。

酶固定化方法有吸附法、共价结合法、交联法、包埋法。酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍甚至几百倍。

1.4.1 吸附法

吸附法是利用酶与载体吸附剂之间的非特异性吸附作用，将酶吸附在载体上。吸附法一般分为离子吸附法和物理吸附法。

(1)离子吸附法是将酶与含有离子交换基的不溶性载体相结合的固定化方法。此法操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是酶与载体之间的结合容易受缓冲液种类或pH值的影响，在高离子强度时，酶往往会从载体上脱落。此法的载体有DEAE、纤维素、离子交换树脂、纤维素等。

(2)物理吸附法具有酶的活性中心不易被破坏和酶的高级结构变化少的特点，酶活力损失很少，但酶与载体相互作用力弱、酶易脱落。常用的载体有无机载体如氧化铝、多孔玻璃、硅胶、高岭土、皂土等；有机载体如面筋、活性炭、淀粉等。

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1.4.2 共价结合法

共价结合法是指将酶蛋白分子上功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连结的方法。酶与载体间连接牢固，使用过程中不易发生酶脱落，并且具有良好的稳定性及重复使用性，因此成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但是该方法具有反应条件比较强烈、载体的活化或固定化操作比较复杂等缺点，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。

1.4.3 交联法

交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三维的交联网架结构。除了酶分子之间发生交联外，可能还存在着一定的分子内交联。戊二醛是应用最广的双功能试剂，它与酶的游离氨基反应，形成希夫碱而使酶分子交联。此外，可用作交联剂的还有4,4-异硫氰二苯基-2,2-二磺酸、双重氨联苯胺、六甲基二异氰酸、甲苯-2-异氰酸-4-异硫氰酸等。交联法广泛应用于酶膜和免疫分子膜的制备，操作简单，结合牢固

1.4.4 包埋法

包埋法是将酶包埋于半透性的载体之中制成固定化酶，包括网格型和微囊型两种。该方法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，因此可以得到活力较高的固定化酶。但由于固定化基质表面的孔径有限，许多大分子底物和产物难以扩散，所以该法对于作用于大分子底物的酶是不适用的，特别是对于甘油三酯。

1.5 游离脂肪酶与固定化脂肪酶的比较

脂肪酶催化法制备生物柴油可使用游离脂肪酶，也可使用细胞外脂肪酶或细胞内脂肪酶。对于细胞外脂肪酶和细胞内脂肪酶而言，一般可固定在载体中，减少分离纯化及回收步骤。而且，经固定化的胞外脂肪酶或胞内脂肪酶催化生产生物柴油的效果优于游离脂肪酶。

固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：

(1)有利于酶与底物、产物的分开，实现酶的可重复使用，从而使酶的使用效率大大提高，降低使用成本；

(2)固定化酶具有一定的机械强度，可以搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，使反应过程能够管道化、连续化和自动化；

(3)在大多数情况下，酶在固定化后稳定性得到较大提高，可延长使用和贮存时间；

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(4)酶的催化反应过程更易控制。如使用填充式反应器时，一旦底物不与酶接触，即可使酶反应终止；

(5)固定化酶极易与反应体系分离，可获得不被酶污染、纯度较高的产物，简化了提纯工艺，提高了产量和产品质量；

(6)比可溶酶更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协同效应使酶催化反应速度大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行；

(7)辅酶固定化和辅酶再生技术，使固定化酶和能量再生技术或氧化还原体系合并使用，从而扩大其应用范围。

1.6 国内外研究进展

酶法生产制备生物柴油具有条件温和，醇用量低，产物易于分离，污染小及对原料油脂品质要求低等优点。但在生产过程中，酶法催化存在成本较高，反应效率低，生产周期长等缺点[12]。因此，针对降低生产成本和提高催化效率，国内外学者开展了一系列工作，获得了一些最新的研究成果。

杨艳红等[13]以硅藻土为固定化酶载体，在pH7.5，给酶量33374 U·g-1，温度35 ℃，固定4 h条件下，得到固定化酶活力约为5833 U·g-1。得到的固定化酶热稳定性好。固定化酶重复使用八次，相对酶活力不到50％，操作稳定性较好。

以二氧化硅纳米材料为固定化酶的载体，在pH7.5，给酶量28300 U·g-1，温度45 ℃，固定化10 h条件下，得到的固定化酶活力约为3867 U·g-1。固定化酶的热稳定性和pH稳定性比游离酶明显提高。固定化酶重复使用八次，相对酶活力在75％以上，操作稳定性较好。

以凹凸棒石为固定化酶的载体，在pH7.5，给酶量25900 U·g-l,温度25 ℃，固定5 h，得到固定化酶活力约为2800 U·g-1。固定化酶的热稳定性和pH稳定性也都比游离酶有了更大的提高。固定化酶重复使用八次，相对酶活力不到50％，操作稳定性较好。

李昌珠等[14]通过正交试验优化了生物柴油催化剂固定化酶活力测定的最佳条件，比较了固定化酶与游离酶的性能，测定固定化酶活力的最佳条件为反应时间20 min，温度43 ℃。与游离酶比较，固定化酶最适反应温度提高，贮藏稳定性和操作稳定性都有大幅度提升。

金杰等[15]以凹凸棒石为固定化载体，采用吸附法，对脂肪酶进行固定。得到最佳固定化条件：固定化温度为25℃，pH值为7.5，吸附时间为5 h，此时固定化酶的活力约为2800 U/g载体。固定化酶的热稳定性和pH稳定性较游离酶有了较大改善，其在60℃以下能保持75%以上的酶活。在pH为5-9的范围内，固定化酶的酶活能保持70%以上。

吴茜茜等[16]研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪酶固定化的影响。所得固定化酶的半失活温度由游离酶的47℃提高到100℃，与游离酶相比较，酶促反应的最适温度由40℃提高到80℃，高温性温度范围相应增大。在高温条件下，

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3.4.3 有机溶剂种类影响

考察了无溶剂体系和以异辛烷、正己烷、环己烷、石油醚为溶剂的体系酯交换反应的情况，实验结果见图3。图可见，与无溶剂体系相比，加入溶剂以后，酯交换反应的转化率提高。这可能是因为加入溶剂以后，反应底物被稀释，与酶接触的机会增大，并且能够提高底物和产物之间的传质，降低短链醇在底物中的含量，降低短链醇对酶蛋白的毒性，从而提高了酶催化过程中的反应速率【固定化脂肪酶催化制备生物柴油王学伟】。从几种溶剂的效果来看，选用正己烷作为溶剂较适宜。

12090相对酯化率 (%)60300无溶剂异辛烷石油醚环己烷正己烷有机溶剂

图6 不同有机溶剂种类对转酯化反应的影响

Fig.6 The impact of different organic solvents on transesterification

3.4.4 有机溶剂用量的影响

由3.2.3得出最优有机溶剂为正己烷，考察了不同正己烷用量对转酯化反应的影响。正己烷提供反应的环境。但正己烷加入量越大，则甲醇与酶的实际接触面积越小，反应越不充分，相对酯化率越低。当正己烷加入量与含酸油脂质量比为33%(w/w)时，即6 g含酸油脂对应3 mL正己烷为最佳。

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120100相对酯化率 (%)8060402000306090120有机溶剂用量 (%)

图7 不同正己烷含量对转酯化反应的影响

Fig.7 The impact on different N-hexance content on transesterification

3.4.5 反应温度的影响

温度是影响酶催化反应的一个重要参数，选择适当的反应温度不但可以提高反应速度，还有助于延长酶的使用寿命。有利于反应平衡向产物生成的方向移动。在一定的温度范围内，温度升高，反应物碰撞频率增加，酶反应速度加快；但温度超过一定范围时，由于酶蛋白变性。酶活性下降，酶反应速度反而下降。由图可知，在所研究的温度范围内，酶促反应速度随温度的升高而增大．但当温度高于40℃时，随温度的升高催化效率增加缓慢，在40℃时，相对酯化率最高，所以反应温度在40℃较为适宜【固定化8旨肪酶催化活性影响因素的改变对生物柴油转化率的影响】。

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120100相对酯化化率 (%)806040200室温30℃40℃50℃温度

图8 不同反应温度对转酯化反应的影响

Fig.8 The impact of different temperature on transesterification

3.4.6 甲醇流加次数影响

脂肪酶催化酯交换反应时，甲醇与原料油的摩尔比通常为3:1，但高浓度的甲醇很容易引起酶的失活。为进一步探索甲醇浓度对脂肪酶活性的抑制作用，本试验甲醇总量一定，加入方式为一次性加入、分两次等量每隔6 h加入、分3次等量每隔4 h加入、分4次等量每隔3 h的方式研究甲醇加人对酶活性的影响。反应12 h考察甲醇加入方式对酶活性的影响，结果如图。当甲醇一次性加入到反应体系中，反应结束时，相对酯化率很低，甲醇分3次和4次加入的体系中，反应结束时相对转化率较高。甲醇按理论反应比例一次性加入时会对同定化脂肪酶活性产生强烈的抑制作用，即甲醇浓度过高会导敏脂肪酶变性。因此，采取3次等量加入甲醇的方法，对酶活性损害减少，又提高生物柴油的产率，从而降低生物柴油的生产成本。

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12011010090相对酯化率 (%)8070605040302012345甲醇流加次数 (次)

图9 不同甲醇流加方式对转酯化反应的影响

Fig.9 The impact of different methanol adding on tansesterification

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结论

本文以35%的寒酸油脂为原料，讨论催化生产生物柴油的固定化酶的最优反应条件。采用大孔树脂D301R加壳聚糖吸附法制备固定化酶，分别探讨了酶用量、水含量、有机溶剂种类、有机溶剂用量、反应温度和甲醇流加次数等不同因素对转酯化率的影响，确定了各因素的最优条件。研究了不同固定条件对固定化酶活力的影响，确定了最优固定条件。

（1）酶固定化最优条件为：

加酶量10%，加水量30%，在4 ℃下固定5 h。在此条件下进行验证试验，测得固定化酶的酶活4 100.32±12.59 U/g。

（2）固定化酶催化转酯化反应最优条件：

催化转酯化反应对应含酸油脂的酶用量酶用量为67 mg/g；水含量67 μL/g；正己烷用量0.5 mL/g；甲醇分3次流加；40 ℃下反应。经测定反应后得到的最高酯化率为67.24%

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致谢

感谢导师姜爱莉副教授，从论文的选题、实验设计、实验操作到文章撰写都对我进行了很多的指导。姜老师对科研工作执着的追求精神，严谨的治学态度给我树立了榜样。在平时的学习，生活中，我受益颇多。我只有在今后的学习、工作中，以锲而不舍的精神，努力做出成绩。

感谢刘娟学姐在实验步骤，实验操作中的悉心指导和帮助，使我的论文得以顺利完成，实验的每一步都倾注学姐的心血，她尽职尽责的态度让我深受感动。感谢杨楠楠学姐在实验室给我们的帮助，也给我们带来了欢声笑语。

感谢李静、单飞、孙东方、牛鹏军、王金军等同学在实验过程中给予我宝贵的意见和极大的帮助，难忘那段一起在实验室渡过的快乐时光。

感谢所有关心我的同学朋友们！同时深深地感谢我的父母，他们的奉献、鼎力支持和亲切关怀是我前进的动力，他们对我的丝丝慰藉和无私关爱是我深深感激，永远不能忘怀的！

值此论文付莘之际，谨向以上各位老师、同学、朋友、亲人表示最衷心的感谢！

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参考文献

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33(2): 40-43.

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烟台大学文经学院毕业论文(设计)

烟台大学文经学院毕业论文(设计)评审表（指导教师用）

题 目 学生姓名 指导教师 姓 名 学号 职称 专业 所学专业 得分 是否同意参加答辩： 评语： 评阅人（签字）： 年 月 日

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烟台大学文经学院毕业论文(设计)

烟台大学文经学院毕业论文(设计)评审表(评阅人用)

题 目 学生姓名 指导教师 姓 名 学号 职称 专业 所学专业 得分 是否同意参加答辩： 评语： 评阅人（签字）： 年 月 日

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烟台大学文经学院毕业论文(设计)

烟台大学文经学院毕业论文(设计)评审表（答辩小组用）

题 目 学生姓名 得分 评语： 学号 指导教师 姓 名 职称 答辩委员会（小组）（全体成员签字）： 年 月 日

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