南方医科大学 正交试验法优化啤酒花中黄酮成分的提取以及提取物生物学活性的研究 2010-5-9

正交试验法优化啤酒花中黄酮成分的提取以及提取物生物学活性

的研究

南方医科大学第二临床医学院临床五年制08级 王略力

南方医科大学第二临床医学院临床五年制08级 谢宝树 南方医科大学第二临床医学院临床五年制08级 熊浩

摘 要

对啤酒花黄酮类化合物的提取工艺进行优化研究，用正交试验对提取溶剂乙醇含量、料液比、提取温度及提取时间进行研究，在此基础上确定上述 4 个因素的最佳组合。并对黄酮类化合物的性质进行研究。

关键词： 啤酒花；黄酮；正交法；抗凝

1、 前言

啤酒花 Humunus lupulus L1 是桑科草属多年生草质蔓生藤本植物，其雌性球穗花序简称酒花【1】。干燥的雌性酒花用于酿制啤酒，能赋予啤酒特有的香味、 爽快的苦味，并能增加啤酒的防腐能力和非生物稳定性。酒花还是一种药用植物，国外将其用于治疗癔病、 失眠等，《中国药典》1977 年版上记载酒花的乙醇浸膏用于治疗肺结核病和麻风病等症。

啤酒花含黄酮苷、 黄酮醇及异戊二烯基查儿酮。前二者广泛存在于植物界 ,后者由酒花的蛇麻腺分泌,能抑制癌细胞的体外扩增【2】、甘油二酯酰基转移酶的活性【2】,并有抗菌及雌性激素样功能【3】。

本实验选择乙醇为提取溶剂，通过正交试验【4】，研究啤酒花总黄酮的最佳提取条件（提取溶剂乙醇含量、料液比、提取温度及提取时间），以能在适量的原料上最大量的提取啤酒花中的黄酮，然后通过实验检测黄酮提取物的抗血小板凝集的性质。

2、实验目的

2.1使用正交试验法对啤酒花中黄酮类化合物的提取工艺进行优化研究。 2.2 啤酒花中黄酮类化合物抗血小板凝集性质的研究。

3、实验原理

3.1黄酮类化合物特性

黄酮类化合物易溶于有机溶剂，例如甲醇，乙醇，故可以用甲醇，乙醇等将之溶解并提取出。 3.2正交试验法

用正交试验对提取溶剂乙醇含量、料液比、提取温度及提取时间进行研究,在此基础上确定上述4 个因素的最佳组合。 3.3测黄酮含量的原理【3】

在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下, 黄酮类化合物与铝盐生成螯和物,加入氢氧化钠溶液后显红橙色, 在510nm波长处有吸收峰。 3.3啤酒花中黄酮类提取物抗血小板凝集原理

黄酮类化合物对抑制血小板凝集有一定功效【2】，对凝血因子具有较强的抑制作用，故表现出较好的抗凝血作用。黄酮类化合物对5-羟色胺和ADP联合诱导的大鼠血小板凝集有抑制作用。

4、实验设备

前期准备设备：电子分析天平，50ml量筒2个，250ml量杯1个，烧杯（15ml的6个，100ml的1个，500ml的1个），玻璃棒，研钵，65目筛，冰箱，离心机，试管12个，剪刀，杀鼠手套，ph计，碱式滴定管，滴定台，锥形瓶（50毫升），洗瓶，试剂瓶（150ml1个橡胶塞，500ml3个，25ml的3个），标签，标记笔。

正式实验设备:电子天平，电子分析天平，小试管（12个），试管架，圆底烧瓶（150ml，6个），球型冷凝管（6个），烧杯（50ml6个，125ml 4个），铁架台（6个），铁夹（12个），电热恒温水浴锅（三孔，两台），滤纸，容量瓶（25ml 4个,100ml 4个），胶头滴管，吸耳球，刻度吸管（10ml），玻璃棒，离心机，分光光度计 UV-1100 上海美谱达

/上海，抽滤装置，恒温箱，加样枪（10μl-200μl，100μl-1000μl），标记笔，旋转蒸发器。

5、实验材料及试剂

大鼠6只（体重200～250g雌雄各半），啤酒花150g，乙醇（浓度分别为30%，45%，60%），无水乙醇，10%的Al(NO3)3溶液，5%NaNO2的溶液，4%的NaOH溶液， 3.8%枸缘酸钠，ADP，PH7.4的磷酸盐缓冲液。 5.1 试剂的配制

5．1．1配制浓度分别为30%，45%，60%的乙醇各400ml，10%Al(NO3)3溶液15ml，5%NaNO2的溶液15ml，4%的NaOH溶液120ml，3.8%枸缘酸钠10ml，PH7.4的磷酸盐缓冲液；之后将ADP溶于PH7.4的磷酸盐缓冲液，配制为2 umol/L的ADP溶液10ml。

5．1．2大鼠乙醚麻醉下，断颈取血，3.8%枸椽酸钠抗凝处理。1000r/min，离心5min，取富含血小板血浆（PRP）存于冰箱备用。

5.2 材料的处理

啤酒花样品去除茎叶后，充分粉碎。

6、实验操作步骤

6．1 提取条件优化方法

对影响啤酒花黄酮类化合物提取的4个因素（乙醇含量、 料液比、 提取时间、 提取温度）的 3 水平进行正交试验，筛选出一个最佳组合。 6．2 啤酒花总黄酮的提取流程

有机溶剂浸提:称取8.00 g样品，加入一定量乙醇溶剂，用加热回流装置提取一定时间后过滤，将滤液定容为100 mL。 6．3 总黄酮测定方法

从定容滤液中精密量取6mL，置于25mL烧杯中，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10 mL，摇匀，

放置15分钟，之后转移到25ml的容量瓶中，再加相应浓度乙醇至刻度定容，然后加入比色杯中，以相应浓度乙醇为空白对照，按照分光光度法，在510nm波长处测定其吸光度。

6．4 实验设计 6．4．1 确定指标

即实验的结果。本实验的指标是黄酮产率。这里，用A510nm值表示。 6．4．2 制定因素水平表

考察四个因素（乙醇含量、 料液比、 提取时间、 提取温度），每个因素取三个水平（如温度选择50 ℃、60 ℃ 和70 ℃ 三个水平）。如表1。

表1 因素水平

水平

1 2 3

6．4．3 选择正交表

可容纳四因素三水平的正交表有L9、L27和L18。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3的的四个因素，故选用L9表(L是正交表的代号，L右下角的数字表示试验次数)，见表2。

表2 L9表（34）

试验号

1 2 3 4 5

1 1 1 1 2 2

2 1 2 3 1 2

3 1 2 3 2 3

4 1 2 3 3 1

A 乙醇含量 （ % ） 30 45 60

B 料液比 （ g : ml） 1∶ 7.5 1∶ 10 1∶ 12.5

C 提取时间 （ min ） 30 60 90

D 提取温度 （ ℃ ） 50 60 70

6 7 8 9

6．5 具体操作步骤

2 3 3 3

3 1 2 3

1 3 1 2

2 2 3 1

将本实验的四个因素依次放在L9的第1，2，3，4列，再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，就得到下面的试验安排（见下表）

表3 实验安排表

表中试验号共9个，表示要做9次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。如做第一个试验时乙醇含量是30%，料液比是1：7.5，60m1，提取时间是60min，温度50 ℃,余此类推。

6．5．1 准备6个圆底烧瓶，编号。6个烧瓶均加入8.00 g样品和对应量、对应浓度乙醇，混匀后装上回流冷凝管,置于电热恒温水浴锅上加热水浴，按表3的条件进行冷凝回

流。其中，1、4、6号为一组，2、8、9号为一组，分别、依次用三孔电热恒温水浴锅对这两组进行冷凝回流；3、5、7号为一组，分别用三

孔电热恒温水浴锅对该组进行冷凝回流。结束后进行抽滤，取滤液备用。

6．5．2 将全部提取液加入100ml容量瓶中，用对应浓度的乙醇溶液定容到100ml，摇匀，从中精密量取6mL，置于25mL烧杯中，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10 mL，摇匀，放置15分钟，转移到25ml容量瓶中，再加相应浓度乙醇至刻度定容。

6．5．3 将上述溶液加入比色杯中，以相应浓度乙醇为空白对照，立即按照分光光度法，在510nm波长处测定其吸光度，并将结果记录入表四中

6．5．4 将提取液置于旋转蒸发装置中，蒸去溶剂即可得黄酮提取物，烘干待用。 6．6 黄酮类化合物抑制血小板凝集性质试验

6．6．1 黄酮的配制:黄酮配为1g/L，取黄酮10毫克,溶解在10毫升的乙醇中,震荡充分溶解，用双层滤纸过滤，备用。

6．6．2 取12只试管，编为6组，每组做同一只大鼠的血清实验，按下表加入试剂

血浆

黄酮溶液 900μl -

乙醇（对应浓度） ADP溶液 - 900μl

100μl 100μl

试管A（实验组） 1ml 试管B（对照组） 1ml

6．6．3 将上述试管置于恒温箱（39摄氏度）中10分钟，然后取出，放到分光光度仪中690nm处测定溶液的透光率，以此来判断血小板的凝集情况。并将结果填到表5中。

7、结果与分析

7．1 正交试验结果分析

根据表 4 的数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值(各自被3除)。最后计算极差。极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出哪个因素对黄酮含量影响最大，那个影响最小。找出在何种条件下黄酮含量最高。最后作一直观分析的结论。

表4 数据记录及分析

试验号

1 乙醇含量 （ % ）

2 料液比

3 提取时间

4 提取温度 /（ ℃ ）

试验结果 A510nm

（ g : ml） （ min ）

1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 K1/3 K2/3 K3/3 R极差

1 30 1 30 1 30 2 45 2 45 2 45 3 60 3 60 3 60

1 1：15 1 30 2 1：20 2 60 3 1：25 3 90 1 1：15 2 60 2 1：20 3 90 3 1：25 1 30 1 1：15 3 90 2 1：20 1 30 3 1：25 2 60

1 50 2 60 3 70 3 70 1 50 2 60 2 60 3 70 1 50

7．1．1 根据表 4 计算同一因素不同水平的极差

极差小代表离散度小，表示该水平为提取反应的最适条件。

A. 计算出各水平实验结果总和，即第1、2、3、4列上的k1、k2、k3，并求出k1、k2、k3和k的R值（极差）。

K表示各因子的相同水平所对应的实验值之和，例如第1列下所对应K1表示乙醇含量的水平 1 所对应试验值之和，K2、K3同理类推） R是极差，它是最大水平试验值均数与最小水平试验值均数之差。

R = （Kmax – Kmin）/ 3

B. 选出优水平组合：据R值的大小，排出因素显著性的顺序，并比较k值选出优水平组合（即好的实验条件）。 7．1．2 述数据分析与讨论

基于本实验的数据与计算，讨论在本试验条件下，乙醇含量、 料液比、 提取时间、 提取温度）对黄酮产率的影响；求出在啤酒花中提取黄酮类物质的最适条件。

7．2 性质分析实验结果分析

表5 抗凝实验结果分析

组号

1

实验组A 对照组B 结论：

2

3 透光率

4

5

6

8、注意事项

8.1 实验准备中，啤酒花的茎叶剔除干净，避免对实验的干扰。

8.2 严格按照分光光度计操作规程进行实验，尽量减少实验误差。随着显色时间的延长，

吸光度将略有下降，因此应尽快进行测定。

8.3 实验过程中所涉实验器材较多，器材要做好明确标记，并及时记录好实验数据。

9、费用预算

啤酒花500克:25元，大鼠6只:210元。

参 考 文 献

【1】

中国科学院植物研究所. 中国高等植物图鉴1第1册1 北京:科学出版社, 1994.

502.

【2】

杨小兰，田艳花，师成滨，张晓云. 啤酒花中黄腐酚的生理活性作用的研究进展. 食

品科学,2007,28(7) : 526

【3】

欧阳军. 啤酒花的化学药理研究与临床应用. 中国民族医药杂志， 1999，12（5）：92

【4】

徐吉民. 正交法在医药科研中的应用. 北京：中国医药科技出版社， 1987.

【5】

李静, 王成永, 张婷婷, 谢金涛. 木瓜中总黄酮成分的提取和含量测定. 中医药临

床杂志, 2008, 12(20) : 617

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