黑曲霉LH2446产纤维素酶液体发酵条件的研究

万方资料

第27卷第3期2005年6月江西农业大学学报

ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis

Vol.27,No.3June,2005

文章编号:1000-2286(2005)03-0466-03

黑曲霉LH2446产纤维素酶液体

发酵条件的研究

汪世华

1,2

,胡开辉,黄碧芳,余文英,彭利民

2223

(1.福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建福州350002;2.福建农林大学生命科学院开放实验室,福建福州350002;3.武汉隆华生物股份有限公司技术中心,湖北武汉430000)

摘要:采用诱变后的黑曲霉LH2446液体发酵生产纤维素酶。确立了产酶最佳条件:5%稻草粉为碳源,1%的黄豆粉为氮源,培养基起始pH值为pH6.5,250mL三角瓶中装培养基75mL,培养时间为h,温度为30℃。在最适条件下产纤维素酶的最高产量为23600U/g。关键词:纤维素酶;液态发酵;产酶条件中图分类号:Q55　　文献标识码:A

StudiesonsforSubmergedFermentation

ofnigerLH2446toProduceCellulase

WANGShi-hua

2

1,2

,HUKai-hui

2

2

3

HUANGBi-fang,YUWen-ying,PENGLi-min

(1.KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology,MinistryofEducation,China,Fujian,Agri2cultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China;2.OpenLaboratoryofCollegeofLifeScience,Fu2jianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China;3.WuhanLonghuaBiotechnologyCo.Ltd.,Wuhan430000,China)

Abstract:ThestudywasconductedtoexploretheoptimumconditionsforsubmergedfermentationofAs2pergillusnigerLH2446toproducecellulase.Itwasfoundedthattheoptimumconditionswereasfollows:thecarbonsourcewas6%strawpower;thenitrogensourcewas1%beancake;75mLmediawerefilledinthe250mLflaskwithmediumpH6.5,culturetime60handculturetemperature30℃.Undertheoptimumcon2ditions,tothehighestoutputofcellulasewas23600U/g.

Keywords:cellulase;submergedfermentation;optimumconditions纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称,主要有C1酶和Cx酶,C1酶和Cx酶协同作用可将天然纤维素降解为葡萄糖。微生物产生的纤维素酶对纤维素物质的酶促水解具有良好的应用前[1,2]景。纤维素酶的工业化生产有固体发酵法和液体深层发酵法两种,由于液体深层发酵法的培养条

[3]

件容易控制,不易污染杂菌且生产效率高而成为国内外重要的研究和生产工艺。本研究利用诱变后的高产菌株黑曲霉LH2446,初步探讨了影响该菌株产酶的因素。

收稿日期:2004-11-04　　修回日期:2004-12-30

基金项目:武汉隆华生物股份有限公司内部重点资助项目(LH2003A02)

作者简介:汪世华(1976-),男,讲师,博士,研究方向:微生物和分子生物学。Email:wshyyl@。

万方资料

第3期汪世华等:黑曲霉LH2446产纤维素酶液体发酵条件的研究 467

1　材料和方法

1.1　菌种

诱变筛选后的黑曲霉LH2446由武汉隆华生物股份有限公司技术中心提供。1.2　试剂

羧甲基纤维素钠为分析纯,其它试剂均为化学纯试剂。

[3～5]

1.3　培养基及培养条件

(1)斜面培养基:斜面培养基为PDA培养基,将菌种接种于PDA培养基斜面上,于30℃培养2～4d,当培养基上出现黑色菌落时制备成菌悬液备用。

(2)液体种子培养基:液体种子培养基为PDA培养基,在50mL三角瓶中装入20mLPDA培养液,用封口膜封口,灭菌后接种,在30℃,200r/min下振荡培养48～72h。

(3)发酵培养基:培养基为稻草粉和黄豆粉,按不同质量比混合。在250mL三角瓶中装入75mL发酵液,于121℃灭菌30min,按10%的量接入液体菌种,于30℃培养。1.4　纤维素酶的测定方法

培养后随机称取产酶培养物1g,加入2mL缓冲液,浸酶4h,。另取1g

[2,3培养物,于105℃烘干并测定其含水量。法测定释放的还原糖量,其纤维素酶活力单位U定义为:在40℃、pH6.01μmol葡萄糖所需要的酶量。1.5　工艺流程

斜面菌种→→→酶活力的测定。

2　2.1　碳源对产酶的影响

用5%的10种不同的碳源(5种纤维性碳源和5种可溶性碳源)与黄豆粉制成发酵培养基,接种后培养3d,测其酶活,结果见表1。结果表明纤维性碳源比可溶性碳源好,在纤维性碳源中稻草粉作碳源

最好。

表1　碳源对产酶的影响

Tab.1　Effectsofvariouscarbonsourcesonproductionofcellulase

碳源酶活

稻草粉

22000

U/g

麸皮

18570

米糠

16400

玉米芯粉玉米秸秆

19800

18520

葡萄糖

16540

甘露糖

14560

纤维二糖

15340

蔗糖

14220

麦芽糖

14260

2.2　氮源对产酶的影响

用5%的稻草粉和1%的不同氮源(3种有机氮和4种无机氮)混合物,配制发酵培养基,接种后培养3d,测其酶活,结果见表2。从表2看出有机氮优于无机氮,有机氮中黄豆粉最好。

表2　氮源对产酶的影响

Tab.2　Effectsofvariousnitrogensourcesonproductionofcellulase

氮源酶活

酵母膏

21380

U/g

蛋白胨

19460

黄豆粉

21890

硫酸铵

18500

尿素

17500

硝酸钠

17230

磷酸铵

16450

2.3　碳氮比对产酶的影响

用不同碳氮比(稻草粉∶黄豆粉)配制发酵培养基,接种后培养3d,测其酶活,结果见表3。结果表明稻草粉和黄豆粉的比例为5∶1时最好。

表3　碳氮比对产酶的影响

Tab.3　Effectsofratioofcarbonsourcetonitrogensourceonproductionofcellulase

稻草粉∶黄豆粉

酶活

9∶116550

8∶116820

7∶118450

6∶121300

5∶122300

4∶121100

3∶119300

2∶117680

U/g1∶115710

万方资料

468 江西农业大学学报　第27

卷

2.4　起始pH值对产酶的影响

在250mL三角瓶中装入不同起始pH值的培养基75mL,接种后培养3d,测其酶活,结果见图1。结果表明培养基起始pH值对产酶的影响很大,太低或太高都对酶活影响较大,pH6.5最好。

图1　培养基起始pH值对产酶的影响Fig.1　EffectsofinitialpHvalueonproductionofcellulase图2　Fig.2　ofonroductionofcellulase

2.5　培养温度对产酶的影响

在250mL三角瓶中装入培养基75mL,.25℃、30℃、35℃、40℃下接种培养3d,测其酶活,结果见表℃。30℃以上菌株生长迅速,但酶活不高。所以30表4　温度对产酶的影响2.6　Tab.4　Effectsoftemperatureonproductionofcellulase

在250mL三瓶中装入培养基

温度/℃2530354050mL、75mL、100mL、125mL,接种后培

养3d,其酶活分别为17500U/g、酶活/U g-11050021990175701542022470U/g、17520U/g、14460U/g,结果表明瓶装量75mL为最好。2.7　培养时间对产酶的影响

用5%的稻草粉和1%的黄豆粉混合物配制发酵培养基,在250mL三角瓶中装入培养基75mL,培养基起始pH值6.5,在30℃下接种培养24h、36h、48h、60h、72h、84h、94h,测其酶活,结果见图2,表明发酵60h产酶量已达最大为23600U/g,72h以后开始下降并维持一段时间,到120h就急剧下降。因此60h为最佳时间。

3　讨　论

纤维素酶是诱导酶,培养基中纤维素的含量直接影响纤维素酶的产生。我们对其碳源作了大量摸索,结果发现纤维性碳源稻草粉、麸皮、玉米芯粉、玉米秸秆都是较好的碳源,可溶性碳源葡萄糖和纤维

[4,5]

二糖也很有效,但总的来说纤维性碳源比可溶性碳源要好一些。由于稻草粉含有丰富的纤维素,价格便宜且来源广泛,是生产纤维素酶培养基的良好成分。因此我们选择稻草粉作为碳源。

在菌株生长过程中,选取初始pH为4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0振荡培养,分别按时测定纤维素酶活(图1)。结果表明pH6.5时产酶最高。同时试验还表明,不同pH值下菌株产酶的酶活达到最高值所需时间不同,酶的最高活力也不同,(结果这里未显示)。而且还有报道产酶最大时间和生

[4]

成菌体量最大时间也并不一致。这可能是由于纤维素酶是一个胞外酶,酶产量与菌体生长量并不存在线性相关关系。参考文献:

[1]管斌,孙艳玲,谢来苏,等.纤维素酶高产菌株的选育[J].中国酿造,2004(4):18～21.

[2]颜贤仔,周美凤,王丽,等.深层发酵产纤维素酶菌株的分离选育[J].江西农业大学学报,2004,26(3):435～438.[3]庄总来,周兴旺,唐志军,等.福寿螺纤维素酶的开发与应用[J].台湾海峡,2000,19(1):6～9.

[4]谢小保,谭宏,黄小茉,等.黑曲霉GD-6纤维素酶液体发酵条件的研究[J].微生物学杂志,2004,24(2):21～23.[5]冯炘,王丹,辛丽霞,等.产纤维素酶粗糙脉孢菌1602产酶条件优化[J].天津理工学院学报,2004,20(1):104～107.[6]徐春厚.绿色木霉X-13株固态发酵产酶优化条件的研究[J].云南农业大学学报,2003,18(3):286～298.

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