基因工程的重组连接

基因工程的重组连接 ——DNA连接酶

DNA连接酶

概念：DNA连接酶存在于各种生物体内，其催化的基本 反应形式是将DNA双链上相邻的3 ’羟基和5’磷酸基团共 价形成3 ’ -5’磷酸二酯键，使断开的DNA切口连接起来， 因此它在DNA复制、修复以及体内体外的重组过程中起 重要作用。 分类： 1. E.coli DNA ligase:需要烟酰胺腺嘌呤（NAD+）作辅助因 子， NAD+ +酶 酶-AMP，同时释放出烟酰胺单核 苷酸（MMN） 活化的酶复合物在DNA切口处修复磷 酸二酯键，并释放AMP。 2. T4 DNA ligase：由T4噬菌体基因编码，分子量约为 60KDa。其活性以ATP为辅助因子，它与酶形成复合物， 并释放磷酸焦磷酸基团。

DNA连接酶

目前基因工程所使用的DNA连接酶多是来源于T4噬菌体 的T4DNA连接酶，因为它与大肠杆菌DNA连接酶相比， 具有以下特点： 修复双链DNA上的单链缺口（二者均相同），这是两种 DNA连接酶的基本特征； 连接DNA-RNA杂交双链上的DNA或RNA缺口，其中后 者反应速度较慢； 连接完全断开的2个平头双链DNA分子，反应速度通常 是粘头连接的1/10-1/100，因此这种反应属于分子间连接， 反应速度依赖于2个DNA分子与酶之间的随机碰撞，所 以速度较慢。但是若适当提高酶量以及底物浓度，或在 反应体系中加入适量的一价阳离子（如150-200mM NaCl)和低浓度PEG可以明显改善平头DNA分子的连接。

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DNA连接酶

DNA连接酶

DNA连接反应的影响因素 1.酶活单位：1国际单位（U）的T4-DNAligase 的定义为：在 最佳缓冲系统及15℃，1h内完全连接1μgλ-DNA的 HindⅢ片断所需的酶量。 2. T4-DNAligase的缓冲条件： 50~100mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 10mmol/L MgCl2 5mmol/L DTT

1mmol/L ATP 一般连接反应的总体系控制在10-15ul内。同样T4 DNA连接 酶储藏于50%的甘油中，而过高的甘油浓度对酶活也有抑 制。因此酶的总用量也不要超过总体系的1/10。

DNA连接酶

影响T4DNA连接酶连接反应的因素： 温度：大多数限制性内切酶产生的粘性片段的Tm为 15℃，另一方面T4DNA连接酶本身最合适的反应温度为 37℃，5℃以下活性大大下降。因此在实际操作中，我 们多采用过夜15℃-16℃连接； b. 离子浓度：过高或过低的离子浓度会影响反应速度； c. DNA片段： I. DNA末端的性质 如果为粘性末端可以看作分子内的连 接反应；但如果为平头DNA分子之间连接，则是分子间 连接，速度大大下降； II. DNA浓度、DNA片段的大小 分子内连接：片段与载体的摩尔数比=2：1—3：1 分子间连接：51.1/(DNA浓度：g/L) (分子量：dalton) 的值如果小于1则容易发生分子间的连接反应 一般性规律是：DNA浓度越稀越容易发生分子内连接反应。

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DNA连接酶

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普通连接反应的设计：

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