化学研究报告标记版

化学研究报告

标记活细胞内蛋白质的化学标签

CHAORAN JING AND VIRGINIA W. CORNISH*

哥伦比亚大学化学系，美国，纽约州10027，纽约，西第120街550，三菱商事4854， NWC大厦 收录时间2011年3月31日

基于上一个世纪在理解个别蛋白质试管中工作方式的极大进展，我们现在面临的是理解大分子机器、信号通路和其他生物网络在活细胞的复杂环境中如何运作的挑战。通过荧光标签编码个别蛋白质基因，这些蛋白质就被选择性标记，荧光蛋白（FPS）彻底改变了我们直接研究细胞中蛋白质功能的能力。虽然FPs将继续是用于细胞生物学研究的宝贵工具，但是他们在面临 现在需要解开的细胞中蛋白质交互机制中 愈益复杂的动态度量表现出了局限性。正如上个世纪，化学方法应用于选择性地标记试管中的蛋白质，对体外生物物理学起到了重要作用，因此现在面临理解本世纪活细胞中蛋白质如何运作这一挑战时，化学标记技术仍然可以起到突破性作用。

利用化学标记技术，目的蛋白附着到一个多肽，而不是一个荧光蛋白。随后用有机荧光团或其它探针修改多肽。FlAsH肽标签于1998年首次发布。自那时以来，更精致的蛋白质标签，例如TMP和SNAP标签，提高了选择性，并使细胞内蛋白质以高信噪比成像。进一步改进仍然需要实现强大的荧光基团直接掺入，但酶介导的化学标签很难选择性标记短肽标签。

在这个方面，我们专注于化学标记在研究活细胞内蛋白质工作方式的开发和应用。因此，对于不同的化学标记策略和技术，我们重视标记反应足够的选择性和荧光探针对细胞内蛋白

质高信噪比成像。我们重视最近FP在相当困难甚至是不可能的复杂的生物化学标记测量方面的应用。最后，我们得出期待的结论（i）与活细胞兼容的高光子输出的化学标记的发展使高分辨率成像，（ii）化学标签有潜力显著降低标签大小（iii）除荧光成像之外的模块化标签的开发。

————————————————————————— 简介

在上个世纪，用有机荧光和其他生物物理探针进行位点特异性标记蛋白的化学方法显著影响体外蛋白质的基础研究。尽管事实上，显微注射技术在技术上需要损害细胞，但是这些化学探针实际应用中显示，显微注射进细胞的纯化蛋白质的化学修饰，仍然应用于活细胞成像。体外化学探针可以被设计的对胱氨酸和赖氨酸残基选择性地发生反应,因此在体外，标记纯化的蛋白质很有效，然而，细胞中存在的大量的蛋白质和其它能够反应的一系列物质根本就没有所需要的能够被选择性标记的特定的蛋白质。

图1.在活细胞中选择性标记蛋白质的不同策略的代表性实例技术示意图。（A）短肽的中心是四半胱氨酸，两端分别与含砷的荧光团相连，荧光标记使短肽更突出。（B）eDHFR/TMP标记策略是基于蛋白质eDHFR的TMP-二聚体探针的非共价，高亲和力的结合。（C）在SNAP-标记，酶hAGT利用鸟嘌呤探头异质二聚体作为自杀底物。（D）生物素连接酶用生物素类似

物来修饰短肽标签，然后生物素类似物在第二步与探针反应。

1994年，活细胞成像随着一种有选择性的、遗传性的蛋白质标签——荧光蛋白（fps）的引入而有所突破。绿色荧光蛋白（GFP）最初来自A.victoria，是一种238个氨基酸的蛋白质，通过位于第11-链β-位的中心的丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸残基的重排和氧化，折叠后自发形成荧光发色团。由于这些原始报告，自然存在和人工合成的荧光蛋白在各个光谱范围都能被充分利用，为提供给细胞生物学家更丰富的试剂增加了希望和更多可能。荧光蛋白标记通常用于观察蛋白质在活细胞中表达的时间和位置的表达，经常提供显著洞察力。然而，荧光蛋白对更复杂的生物物理和机理研究有局限性。作为?30kD的蛋白质，荧光蛋白可以破坏集合、互动或标记蛋白的功能;荧光蛋白通常具有广阔的吸收和发射光谱，使其在技术上要求监测甚至只是三种不同的蛋白质同时使用多色成像；荧光蛋白能遭受低聚和/或缓慢的折叠和发色团的成熟;荧光团的专业性能难以操纵，因为它是荧光蛋白固有的序列;更重要的是，在光子输出方面（经常测量亮度和耐光性），关键是单分子分辨率，在这一点上，没有一种荧光蛋白可以跟最合适的有机荧光团、更少的纳米颗粒或其他新兴的化学探针媲美。因此，化学标签为已开发的标记蛋白质提供了另一种可以替代的直接在活细胞中得到的化学探针。

用化学标签标记蛋白

用化学标签标记靶蛋白，而不是用荧光蛋白标记，这种靶蛋白用多肽标记，也就是随后经过改良的有机荧光团。技nically，用化学标签标记靶蛋白与用荧光蛋白标记靶蛋白是非常类似的：目标蛋白质和多肽的标签间质粒编码的融合是使用标准的分子克隆技术建构并导入到所希望的细胞中的。有机荧光团扩散到细胞中，然后通过特异性结合或与多肽标记相偶联，并培养细胞。因此，化学标签仍然保留用荧光蛋白实现蛋白质标记的特点，但是通过基因编码，但提供更小更可靠的标签以及有较高的光子输出和定制功能有机荧光团的模块化的使用。

第一份关于在活细胞中用有机荧光团标记蛋白质的荧光蛋白的替代品的报告钱学森和他的同事在1998年发表的《FLASH》。报告中指出，Flash是理想的化学标签，短短15个氨基酸的多肽标签，中心是两端分别与含砷的荧光素配合的四半胱氨酸（CCXXCC），荧光性增

强基于结合了多肽标签（图1A）。迄今为止，一些l两端含砷的荧光团和相对应的四半胱氨酸（TC）的标签的已发布，其中最初的绿色荧光FlAsH和红色荧光ReAsH应用的最频繁。尽管其优雅的设计，技术实际上遭受细胞中含有丰富硫醇的生物分子的非特异性标记、两端含砷配体的毒性和标记的条件。然而，受惠于它的体积小，往往是唯一可行的标记被250个氨基酸荧光蛋白损害的蛋白质或复合物的标签。（通过250个氨基酸荧光蛋白标记被损害的蛋白质或复合物的标签，Flash往往是唯一可行的。）并且FlAsH被广泛报道，也使许多实验成为可能。

以蛋白质为基础的化学标签.为了克服短肽标签的选择性限制，引入了以蛋白质为

基础的化学标签，以允许靶蛋白能被一个蛋白质受体或酶标记，它随后可以被有细胞渗透性的有机配体-或底物-探针异源二聚体标记。下面是几个关于这些蛋白质受体-配体或酶-底物标签的关键性设计问题。一，也许最重要的是，有机荧光配体或底物必须对内源性蛋白质或其他生物分子有较强的细胞渗透性和非特异性结合，或者同样重要但比较少提的是，如果不这样就会分割细胞内特定的细胞器。二，该配体或底物衍生物的合成应该是最直接的，并且是对受体结合或酶的功能破坏性最小的。三，蛋白质受体或酶应该要小的单分子，并且应该几乎不受生物研究过程中的微小干扰。四，该蛋白质标签和配位体/底物-探针之间的标记反应应是快速和近乎定量的。迄今为止，蛋白质标签优于其他化学标记的优点是他们对细胞内的蛋白质高信噪比地成像有足够的选择性和高效性。

在与Sheetz组合作的过程中，我们的实验室利用二氢叶酸还原酶（DHFR）和叶酸类似物之间的高亲和力的相互作用来标记活细胞中的蛋白质。简单地说，我们用大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）标记靶蛋白。简单地说，我们用大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）标记靶蛋白。因为eDHFR以高亲和力（1nMKD）和高选择性（哺乳动物DHFRs的亲和力KD>1μM）与三甲氧苄氨嘧啶（TMP）结合。TMP探针异源二聚体经过十分钟的解离半衰期，然后与eDHFR结合成非共价键，这样该eDHFR标签就被相近化学计量浓度的TMP探针异源二聚体标记（图1B）。TMP-探针异源二聚体具有优异的细胞渗透性和溶解性能，正是这种特点使得TMP在临床上可以作为一种抗生素。正如预期，基于高分辨率的结构和构效关系的数据，市售的TMP可以与eDHFR高亲和力结合，因此只需要对其施加eDHFR这一微小的干扰，就可以改变对甲氧基的位置，这使得合成TMP-探针标记非常简单。作为含有159个氨基酸的，单链的，表达好的蛋白质，eDHFR大约是FP的三分之二大小，没有齐聚和表达的问题，折叠迅速，绕开了生色团成熟半衰期的难题。在众多化学标签中，TMP标签脱颖而出是因为使细胞内蛋白

在活细胞中成的像具有较高的分辨率。

我们使用TMP标签努力描绘哺乳动物细胞中黏着斑复合体的个别蛋白的图像，这些努力告诉我们，一旦TMP-探针标签在细胞内，那么标签的关键性能问题就不是TMP-探针标签细胞的通透性，而是TMP-探针标记物的溶度。重要的是，通过保护基团和连接器的优化，我们获得了能把细胞区室划分的很小的非特异性的富含脂质的TMP-荧光标签，因此可以把图像放的更大，胞质蛋白的扩散的信噪比更高。能够对胞内蛋白质成像的TMP-荧光团调色板的已从荧光素为基础的绿色和人造红色色素扩展到包括一个远红外光控Atto-655，双光子荧光BC575和镧系元素的探针。重要的是通过细胞生物学家和生物物理学家（即不专门从事有机合成的实验室）的采用，将源自活性片断的TMP-标签可作为柔性链市售。

值得注意的是，TMP标签通过在eDHFR的适当位置上安装独特的Cys残基，现在也已经呈现共价，它可以与通过由接近引起的经典的Michael加成反应而加入到TMP-探针分子的潜在的丙烯酰胺亲电子试剂发生反应。虽然经过优化，第一代的共价TMP-标签经历了快速，定量的共价标签（体外T1/2?50分钟）并让位于原子核的eDHFR在活的NIH3T3细胞中成像。但这项工作表明，基于高亲和结合的化学标签的优势，是它不要求高浓度的配体探针与以酶为基础的化学标记的必要的共轭。其中KM的变化范围一般从微摩尔至毫摩尔，导致来自未结合的荧光团的高背景噪声，迫使大量的洗涤步骤。

另一种可以替代以蛋白质为基础的化学标签的策略，“SNAP-标签”采用修饰过的邻位鸟嘌呤-荧光团异源二聚体标记融合到人类的邻位烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（hAGT），一个20kD的单体DNA可以修复蛋白，通过半胱氨酸残基烷基化的单个转换，自然地使邻位烷基鸟嘌呤脱烷烃后的残基进入DNA(图1C)。能够迅速反应的SNAP-标签的变体已经设计出来，以最大限度地减少内源性哺乳动物高级颗粒技术(AGT)的背景标记。赫然，正交AGT选择性地使用胞嘧啶荧光团作为底物，它被称为CLIP-标签的变体，也已经演变而来，尽管它需要进一步优化的像SNAP标签那样强劲。许多各种不同的SNAP和CILP-荧光团购自NewEnglandBiolabs公司，这些荧光团中的一些已经被证实能够在活细胞里面起作用（表1）。同样，Promega公司开发了一种以带有自杀底物的工程脱卤素酶为基础的的共价化学标记，“Halo标签”，已经证明在体外是有效用的标记，但报告表明它可能要面临细胞内的效率和选择性问题。新的基于蛋白质的化学标记的不断推出，但现在大多尚未充分核实这些化学标

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