随机引物与oligodT 区别
更新时间:2024-06-22 01:05:01 阅读量: 综合文库 文档下载
使用oligo dT引物扩增的产物, 可以保证扩增产物包括mRNA的3'末端(减少rRNA的干扰), 但是oligo dT primer扩增有一个问题, 就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的问题, 之所以有长度这个问题,一方面和lz所提到的RNA完整性有关,但最重要的限制在于逆转录酶的延伸能力. 用oligo dT primer扩增可能出现扩增出来的片段长度短, 虽然都有mRNA的3'端, 但是序列信息多位于3'-UTR附近, 若扩增序列太短,则有用信息很少, 不利于序列的识别和分析.
使用random primer, 也有片段长度的限制, 但是由于它的逆转录并不一定在mRNA的末端起始, 而是在随机位置起始,所以它的扩增片段带有更多CDS的信息.但是如果是用总RNA逆转录的话,有可能会受到rRNA的干扰.
至于Gsp,只是在扩增已知gene/gene family以及部分原理的RACE中使用.
用随机引物时 要去除总RNA中的tRNA rRNA, 只保留mRNA
如果接下来你的PCR产物是外显子,就用oligo dT; 如果是内含子或者包括部分内含子,就用random
mRNA反转录之后的cDNA为模板进行PCR,不都是外显子吗?内含子在这之前都被剪切掉了。所以不知道“内含子...”这句话是什么意思,或者有其他的含义,求解!
如果你想要做蛋白表达,就用Oligo dT,要是你做的基因包括内含子就用随机引物喽。
我最近在用逆转cDNA为模板扩增CDS序列(3000bp左右),同时用oligodT和random引物逆转,结果大多数时候两者扩增效果是一样的,少部分情况只有random能扩出目的带,尤其是中间段和靠近5?端的CDS区——这结果基本和网上很多资料相吻合——比如随机引物更适合CDS长的、有二级结构的基因。
显然是选random primer更好,其实说明书是有写的啦,原因是RT-PCR逆转录是要得到一个所有的RNA的cDNA库,然后再P出你要的“几个基因”,所以不是每个基因的mRNA都是有polyA的,很多都是没有的,microRNA,piRNA,很多都没有哦,所以如果你用oligo dT引物,就自然会miss掉很多(确实是很多)的RNA,而随机引物不会有这个问题,用它反转录出来的cDNA丰度更高,结果更加准确
看你的目的基因的mRNA有没有polyA尾巴 有的话就用oligodT 没有的话就用随机引物
一般在反转录的时候除了引用特异性引物和oligodT作为反转录得到第一条cDNA链外,运用随机引物的效果也很好,随机引物一般有6-10碱基的寡核苷酸引物,引物的序列是随机的,也就是说随机引物是各种引物的混合物,随机序列的肯能性很多,由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录,比较容易合成特长的 CDNA;现在随机引物已经商品化, 没有必要自己合成,直接购买就可以,Takara公司就有,我用的挺好的,有两种: pd(N)6 -含有6个碱基的随机序列; pd(N)9-含有9个碱基的随机序列,我用的是 pd(N)6。
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