实验一 质粒DNA的微量制备

实验一 质粒DNA的微量制备（4学时）

实验目的

(1) 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 (2) 掌握碱裂解法分离、纯化质粒DNA的方法。

实验原理

质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。目前，质粒已广泛的用作基因工程中目的基因地运载工具—载体。从大肠杆菌中提取质粒DNA，是一种分子生物学最基本的方法。

质粒DNA分离纯化方法有多种，但其原理和步骤都大同小异。本实验着重介绍碱裂解法制备微量DNA。

在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。

在实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。

试剂和器材

一、试剂 1. LB 液体培养基

胰蛋白胨10g/L, 酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L, 用NaOH调节至pH7.0，高压灭菌。 2. TEG缓冲液（溶液I）（pH8.0 25mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L EDTA, 50mmol/L葡萄糖，4mg/mL 溶菌酶）

称取0.3g Tris加入0.1mol/L HCl溶液14.6mL，先配制成pH8.0 Tris-HCl缓冲液100mL，再加入0.37g EDTA·Na2·2H2O和0.99g葡萄糖，临用前加入400mg溶菌酶。

3. 碱裂解液(溶液II)（0.2mmol/L NaOH, 1% SDS） 称取0.8g NaOH和1g SDS定容至100mL, 现配现用

4. 乙酸钾溶液（溶液III）(pH8.0, [K +]=3mol/L, [Ac -]=5mol/L) 取60mL mol/L KAc加入11.5mL冰乙酸和28.5mL蒸馏水 5. 1mol/L pH8.0 Tris－HCl缓冲液 Tris 121.14g/L, 用盐酸调至pH8.0 6. 酚／氯仿（1：1）溶液配制

（1）将商品苯酚置65℃水浴上缓缓加热融化，取200mL融化酚加入等体积的1mol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液和0.2g (0.1%)8－羟基喹啉，于分液漏斗内剧烈振荡，避光静置使其分项。

（2）弃去上层水相，再用0.1mol/L Tris－HCl缓冲液pH8.0与有机相等体积混匀，充分振荡，静置分相，留取有机相。

（3）配制氯仿／异戊醇混合液：将24份氯仿与1份异戊醇混合均匀。

（4）等体积的酚和氯仿／异戊醇溶液混合。放置后，上层若出现水相，可吸出弃去。有机相置棕色瓶内低温保存。

7. TE缓冲液(10mmol/L, pH8.0 Tris-HCl, 1mmol/L EDTA)

称取0.12g Tris，加适量蒸馏水溶解，用1mol/L盐酸调至pH8.0并定容至100mL，加入0.037gEDTA·Na2·2H2O。临用前加入核糖核酸酶，为了使RNase制剂中混杂的DNase失活，临用前80℃处理10min。 8. 无水乙醇及70％乙醇。 二、材料

携带质粒的大肠杆菌。 三. 器材：

试管，Eppendorf管，移液器，恒温振荡器，台式离心机.

碱裂解法实验步骤

1. 培养细菌扩增质粒

将携带质粒的大肠杆菌接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。

2. 收集菌体和裂解细菌

（1）取1.5mL培养液置Eppendorf管内，离心，5000r/min，5min，弃去上清，保留菌体沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，收集菌体。

（2）将菌体沉淀悬浮于预冷的100μl溶液I，剧烈振荡、混匀，室温放置10min。 （3）加入200μl新鲜配制的溶液II，加盖，颠倒数次轻轻混匀，放置5min。 3. 分离纯化质粒DNA

（1）加入150μl冷却的溶液III。加盖后，温和颠倒数次混匀，放置15min。

（2）4℃下离心，5000r/min, 5min，乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物，并使过量的SDS－Na＋转化为溶解度很低的SDS－K＋一起沉淀下来。离心后，上清液若仍混浊，应混匀后再冷至0℃，重复离心。上清液转移至另一干净的Eppendorf管内。

（3）加入等体积的酚，反复振荡，离心，12000r/min, 5min, 小心吸取上层水相溶液，转移到另一个Eppendorf管中。

（4）加入等体积24：1的氯仿／异戊醇混合液，反复振荡，离心，12000r/min, 5min, 小心吸取上层水相溶液，转移到另一个Eppendorf管中

（5）上述溶液中加入两倍体积的预冷无水乙醇，混合摇匀，放置10min。4℃下离心，5000r/min , 5min, 弃去上清液，并将Eppendorf管倒置在干滤纸上，空干管壁粘附的溶液。

（6）加入1mL 70％冷乙醇，洗涤沉淀物，离心，弃去上清液，尽可能除净管壁上的液珠，放置干燥或真空干燥，即得质粒DNA制品。

（7）将DNA沉淀溶于50μlTE缓冲液（临用前加入20μg/mLRNaseA），置－20℃保存，备用

注意事项

（1）细菌培养过程要求无菌操作。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂经高压灭菌处理。

（2）制备质粒的过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。

（3）加入乙酸钾溶液后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。

（4）用酚／氯仿混合液除去蛋白效果比单独使用更好，为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。

思考题

1.碱法提取质粒的过程中，EDTA、溶菌酶、NaOH、SDS、乙酸钾、酚／氯仿等试剂的作用是什么？

2.质粒提取过程中，应注意哪些操作？为什么？

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