概论实验指导(1)

实训三 邻二氮菲分光光度法测定微量铁

一、实验目的

1．掌握722型或WFJ2000型分光光度计的使用方法。 2．掌握吸收曲线的绘制方法及最大吸收波长的确定。 3．掌握分光光度法测定物质含量的方法。

二、实验原理

在可见分光光度法的测定中，通常将被测物与显色剂反应，使之生成有色物质，然后测定吸光度，进而求得被测物质的含量。

用分光光度法测定试样中的微量铁，显色剂比较多，其中以邻二氮菲为显色剂，灵敏度较高，稳定性较好，干扰容易消除，因而是目前普遍采用的测定方法。

在pH =2~9的溶液中，邻二氮菲与Fe2+反应生成稳定的橙红色配合物。

其中lgβ3 = 21.3，摩尔吸光系数ε

508 =1.1×10

4

Fe2++3NN(NN2+)3FeL·mol-1·cm-1，而Fe3能与邻二氮菲生成3：1配

，

＋合物，显淡蓝色。所以在加入显色剂之前，应用盐酸羟胺将Fe3还原为Fe2+其反应式如下：

3+2+2Fe+NH2OH2Fe+2H++N+2HO

＋22 测定时酸度高，反应进行慢；酸度太低，则配离子易水解。本实验采用NaAc溶液控制溶液PH约等于5，使显色反应进行完全。

三、仪器与试剂

1．仪器：722型或WFJ2000型分光光度计、电子天平、2个1000 mL容量瓶、7个50 mL容量瓶、1支50 mL吸量管、4支5 mL吸量管、1支10 mL吸量管、4个5ml量筒、2个100ml量筒

2．试剂：10μg·mL-1的铁标准溶液 准确称取0.8634g NH4Fe (SO4)2·12H2O置于烧杯中，用20 mL 6 mol/L HCl溶液和适量水溶解后，定量转移至1000 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀。从中吸取100 mL该溶液于1000 mL容量瓶中，加入100 mL 1 mol/L HCl溶液，用水稀释到刻度，摇匀。

盐酸羟胺溶液 10 %水溶液（临用时配制）

邻二氮菲溶液 0.15 %水溶液（临用时配制） 可先用少许酒精溶解，再用水稀释。 NaAc溶液 1 mol/L

铁试样溶液 其中含铁0.04~0.08 mg /10 mL

四、实验步骤

1．显色溶液的配制（实验室配制）

取7个50 mL容量瓶，分别准确加入10μg· mL-1的铁标准溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00（mL）及试样溶液10.00 mL，再于各容量瓶中分别加入10 %盐酸羟胺溶液1 mL，摇匀，0.15 %邻二氮菲溶液2.0 mL和NaAc溶液5 mL，每加一种试剂后摇匀再加另一种试剂，最后用水稀释到刻度，摇匀。

2．绘制吸收曲线并选定测量波长

选用加有10.00 mL铁标准溶液的显色溶液，以不含铁的试剂溶液为参比，用1cm吸收池，用分光光度计从波长450~550 nm的范围内，从每隔20 nm到每隔10 nm测一次吸光度，在最大吸收波长附近，再逐渐每隔5 nm到2 nm各测一次。（注意：每改变一次波长，均需用参比溶液将透光率调到100%，才能测量吸光度。）

在数据处理中，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线。选择吸收曲线的峰值波长，即最大吸收波长为本实验的测量波长。

3．标准显色溶液和样品显色溶液的吸光度的测定

在选定最大吸收波长下，用1 cm吸收池，以不含铁的试剂溶液为参比溶液，分别测量标准显色溶液和样品显色溶液的吸光度。

在数据处理中，以各标准显色溶液的的吸收度为纵坐标，以相应含铁量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。

通过标准曲线求试样溶液的总含铁量（μg），计算试样溶液的原始浓度（μg·mL-1）。

五、注意事项

1．盛标准系列溶液及水样的容量瓶应编号，以免混淆。 2．由浓到稀配制标准溶液，由稀到浓测定实验数据。 3．绘制图表时，单位取整数，间隔要适当。

4．每更换一次波长时，都要重新调整“0”和“100%”。

六、数据记录与处理

1．标准曲线的制作 波长（nm） 450 470 490 500 503 505 507 510 513 515 520 530 550 吸光度 （1）吸收曲线的绘（用坐标纸画出平滑曲线） （2）最大吸收波长

2．标准曲线的绘制（以最大吸收波长为测定波长） 铁含量（μg·mL-1） 空白 吸收度 0.000 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 样品 （1）标准曲线的绘制（用坐标纸画，将六个点线性回归） （2）从坐标曲线上查得样品含铁量（μg·mL-1）为

七、思考题

1．吸收曲线与标准工作曲线有何区别？各有何实际意义？ 2．为什么绘制标准曲线和测定试样应在相同条件下进行？

3．在绘制标准曲线时，各点不一定全部在同一直线上，你应该怎样作图？把所有点连在一起可以吗？ 4．邻二氮菲分光光度法测定微量铁时，为何要加入盐酸羟胺溶液？

附录 分光光度计的使用

一、原理

分光光度计分析的原理是利用物质对不同波长光的选择吸收现象来进行物质的定性和定量分析，通过对吸收光谱的分析，判断物质的结构及化学组成。

本仪器是根据相对测量原理工作的，即选定某一溶剂（蒸馏水、空气或试样）作为参比溶液，并设定它的透射比（即透过率T）为100%，而被测试样的透射比是相对于该参比溶液而得到的。透射比（透过率T）的变化和被测物质的浓度有一定函数关系，在一定的范围内，它符合朗伯-比耳定律。

T= I / I0

A= KCL= -log I / I0

其中 T 透射比 A 吸光度 C 溶液浓度 K 溶液的吸光系数 L 吸收池的厚度

I 光透过被测试样后照射的光电转换器上的强度 I0光透过参比测试样后照射的光电转换器上的强度 二、操作步骤

1．连接仪器电源线，确保仪器供电电源有良好的接地性能； 2．接通电源，使仪器预热20分钟；

3．用键或功能键设置测试方式：透射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式；

4．用波长选择旋钮设置您所需的分析波长；

5．将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中（参比样品溶液放在紧靠黑体的第一个槽位中），盖上样品室盖；

6．将0%T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0%”键，此时显示器显示“000.0”；

7．将参比样品拉入光路中，按“0A/100%T”键调0A/100%T，此时显示器显示的“BLA”,直至显示“100.0”%T或“000.0”A为止；

8．当仪器显示器显示“100.0”%T或“000.0”A后，将被测样品拉入光路，这时，便可从显示器读到被测样品的透射比或吸光度。

三、使用注意事项

1．仪器使用时，注意每次改变波长时都要用0%T校具按“0%”键调节显示器显示“000.0”，用参比样品溶液调节“0A/100%T”键至显示“100.0”。

2．仪器所附的比色皿，其透射比是经过配对测试的，未经配对处理的比色皿将影响样品的测试精度，操作者请小心使用。

3．比色皿透光部分表面不能有指印、刮痕，被测溶液不能有气泡、悬浮物。

4．比色皿装液不易过满，液体量为比色皿容量的3/4，使用时手拿比色皿磨砂玻璃面，用吸水纸吸干溢在外表面的液体，再用擦镜纸擦净。

5．比色皿使用完毕后，用蒸馏水洗净，磨砂玻璃面向上放入比色皿盒内。 6．比色皿选择拉杆操作时需轻而缓，以免拉杆脱落。

7．连续使用仪器时间不应超过2小时，或者休息半小时后继续使用。 8．仪器不能受潮，长期不用时，放入硅胶保持干燥，并定期更换硅胶。

实训六 药品pH值的测定

一、实验目的

1．掌握酸度计的结构、原理和使用方法。

2．掌握按《中国药典》(2005)规定准确测定药品pH的方法。

三、实验原理

将玻璃电极作为溶液中H离子活度指示电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，置于待测溶液中组成原电池，当玻璃电极的玻璃膜的两端溶液氢离子活度不同时，产生膜电位，从而使玻璃电极与甘汞电极间的电动势随着H离子活度的变化而变化，根据Nerst方程式可推导得电动势与pH值的关系为：

+

+

2.303RT????pHFo

式中：?——待测离子的膜电势（v）

?——待测离子标准状况下的膜电势（v） F——法拉第常数（96.485 KJ·mol）

-1

oR——摩尔气体常数[8.314 J·mol-1·K-1] T——热力学温度(K)

在实际工作中，利用测量电极和参比电极对被测溶液不同酸度所产生的直流电动势，输入到一台用高输入阻抗集成运算放大器组成的直流放大器，达到指示pH值的目的，新式数字式pH计其设定温度和pH值都在屏幕上以数字的形式显示。

酸度计的计量性能应按国家标准进行检定，包括酸度计的示值准确性、示值重现性、指示器刻度正确性、温度补偿器的正确性和仪器输入阻抗误差等的检查，本实训选用示值准确性和示值重现性两个项目学习检定方法。

二、仪器与试剂

1．仪器：雷磁pHS-3C型酸度计(最小分度0.01 pH单位)，或雷磁pHS-2型酸度计（最小分度0.02 pH单位）。

2．试液：邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液(pH=4.00)、磷酸盐标准缓冲液(pH=6.86)、硼砂标准缓冲液（pH=9.18）, 葡萄糖注射液、注射用水。

四、实验步骤

（一）电位计

电位计上包括“pH/mV”键、“定位”键、 “斜率”键、“温度”键、“确认”键等按键。如图5-3,仪器的外形结构和图5-2仪器后面板结构。

仪器外型结构： 1—机箱 2—键盘 3—显示屏 4—多功能电极架 5—电极

图5-3仪器外型结构

仪器后面板：

6—测量电极插座 7—参比电极接口 8—保险丝 9—电源开关 10—电源

图5-4仪器后面板

1．“pH/mV”键，此键为pH、mV 选择键，按一次进入“pH”测量状态；再按一次进入“mV”测量状态。

2.“定位”键，此键为定位选择键，按此键上部“△”为调节定位数值上升；按此键下部“▽”为调节定位数值下降。“定位”键用于消除电极不对称电位对测量结果所产生的误差。

3．“斜率”键，此键为斜率选择键，按此键上部“△”为调节斜率数值上升；按此键下部“▽”为调节斜率数值下降。“斜率”键用于补偿电极转换系数。由于实际的电极系统并不能达到理论上的转换系数(100％），因此，设置此调节键便于用户用两点校正法对电极系统进行pH值校正，使仪器能更精确地测量溶液的pH值。“斜率”键和“定位”键仅在进行pH值测量及校正时有用。

4．“温度”键，此键为温度选择键，按此键上部“△”为调节温度数值上升；按此键下部“▽”为调节温度数值下降。“温度”键用于补偿由于溶液温度不同对测量结果产生的影响，在进行溶液pH值测量及校正时，必须将此键调至该溶液的温度值上。

5.“确认”键，此键为确认键，按此键为确认上一步操作。此键的另外一种功能是如果仪器因操作不当出现不正常现象时，可按住此键，然后将电源开关打开，使仪器恢复初始状态。 (二)开机前的准备

1．将多功能电极架(4)插入多功能电极架插座中； 2．将pH复合电极(12)安装在电极架(4)上；

3．将pH复合电极下端的电极保护套顺时针旋转轻轻拔下，并且拉下电极上端的橡皮套使其露出上端小孔，见图5-6；

4．用蒸馏水清洗电极。

图5-5仪器附件示意图

图5-6 拔开电极套 图5-7 放进待测液

（三） 雷磁PHS-3C型pH计操作流程（见图5-8）

（四） 仪器的标定

仪器使用前首先要标定。一般情况下仪器在连续使用时，每天要标定一次。 1．在测量电极插座（6）处拔掉Q9短路插头（11）； 2．在测量电极插座（6）处插入复合电极（12）；

3．如不用复合电极，则在测量电极插座（6）处插入玻璃电极插头，参比电极接入参比电极接口（7）处；

4．打开电源开关，按\按钮，使仪器进入pH测量状态；

5．按“温度”按钮，使显示为溶液温度值（此时温度指示灯亮），然后按“确认”键，仪器确定溶液温度后回到pH测量状态。

6．把用蒸馏水清洗过的电极插入pH=6.86pH的标准缓冲溶液中，待读数稳定后按“定位”键（此时pH指示灯慢闪烁， 表明仪器在定位标定状态）使读数为该溶液当前温度下的pH值(例如混合磷酸盐20℃时，pH=6.88),然后按“确认”键， 仪器进入pH测量状态。标准缓冲溶液的pH值与温度关系对照表见标准缓冲溶液附录。

7．把用蒸馏水清洗过的电极插入pH=4.00(或pH=9.18)的标准缓冲溶液中，待读数稳定后按“斜率”键（此时pH指示灯快闪烁， 表明仪器在斜率标定状态），使读数为该溶液当时温度下的pH值(例如邻苯二甲酸氢钾20℃时,pH=4.00), 然后按“确认”键，仪器进入pH测量状态，pH指示灯停止闪烁，标定完成。

8．用蒸馏水清洗电极后即可对被测溶液进行测量。

注意：如果在标定过程中操作失误或按键按错而使仪器测量不正常，可关闭电源，然后按住“确认”键再开启电源，使仪器恢复初始状态，然后重新标定。 经标定后，“定位”键及“斜率”键不能再按，如果触动此键，此时仪器pH指示灯闪烁，请不要按“确认”键，而是按\键，使仪器重新进入pH测量即可，而无须再进行标定。 （五）仪器的检定

检定时，室温应在10～30℃，相对湿度应小于65％；室内无腐蚀性气体和影响测定的气体；周围无强电磁场和强烈振动。

酸度计在使用前，需检定其准确度和重复性。选择两种新配制的pH值相差约3个单位的标准缓冲溶液（使供试液的pH值处于二者之间），检定仪器的准确度总误差和重复性总误差。要求准确度总误差应≤±0.01pH, 重复性总误差应≤±0.05pH.

1．酸度计示值准确性的检测

用pH=6.86的磷酸盐标准缓冲液定位，用pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液调节斜率校准仪器后，测定pH=6.86的磷酸盐标准缓冲液的pH值，重复三次求出平均值。所测定的平均值与磷酸盐标准缓冲液规定值之差，即为酸度计的示值准确性，其结果一般不应超过所用仪器的最小分度值。在3

2．酸度计示值重现性的检测

按（1）中的方法用磷酸盐标准缓冲液（pH=6.86）和邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液（pH=4.00）标定仪器后，重复测定磷酸盐标准缓冲液的pH值 5次，5次测定值之间最大差值即为仪器示值重现性误差。pHS--3C型酸度计重现性误差不得大于0.05 pH单位。

（六）测量

经标定过的仪器，即可用来测量被测溶液，被测溶液与标定溶液温度是否相同，所引起的测量步骤也有所不同。具体操作步骤如下：

1．被测溶液与定位溶液温度相同时，测量步聚如下： a)用蒸馏水清洗电极头部，再用被测溶液清洗一次；

b)把电极浸入被测溶液中，用玻璃棒搅拌溶液，使溶液均匀后读出该溶液的pH值。 2．被测溶液和定位溶液温度不同时，测量步骤如下： a)用蒸馏水清洗电极头部，再用被测溶液清洗一次； b)用温度计测出被测溶液的温度值；

c)按“温度”键，使仪器显示为被测溶液温度值，然后按“确认”键。

d)把电极插入被测溶液内，用玻璃棒搅拌溶液，使溶液均匀后读出该溶液的pH值。 3．葡萄糖注射液pH的测定

按药典规定用磷酸盐标准缓冲液(pH=6.86)和邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液(pH=4.00)标定（校正）仪器后，用蒸馏水淋洗电极，用滤纸吸干，将电极浸入葡萄糖注射液中，并轻轻摇动，重复测定pH 3次，求出平均值。药典规定本品pH应为3.2～5.5。 4．注射用水pH的测定

按药典规定先用磷酸盐标准缓冲液(pH=6.86) 和邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液(pH=4.00)标定（校正）仪器后测定供试液，并重取供试液再测，直至pH值的读数在1 min内改变≤±0.05为止；然后再用硼砂标准缓冲液校正仪器，再如上法测定；两次pH值的读数差不应超过0.1，取两次读数的平均值为供试样品的pH值。药典规定本品pH值应为5.5～7.0。

5．测量结束后，关断电源，用蒸馏水淋洗电极，将橡皮塞塞住电极的加液孔，并将装有补充液的电极保护套套在电极的下端备用。 6．填写仪器使用记录。

五、注意事项

1．电极在测量前必须用已知pH值的标准缓冲溶液进行定位校准，其pH值愈接近被测pH值愈好。 2．取下电极护套后，应避免电极的敏感玻璃泡与硬物接触，因为任何破损或擦毛都会使电极失效。 3．调节各个按键时，勿用力过大，以防止按键失灵。

4．测量结束，及时将电极保护套套上，电极套内应放少量外参比补充液，以保持电极球泡的湿润，切忌浸泡在蒸馏水中。

5．复合电极的外参比补充液为3mo1／L氯化钾溶液，补充液可以从电极上端小孔加入，复合电极不使用时，用橡皮塞塞住加液孔，防止补充液干涸。

6．电极的引出端必须保持清洁干燥，绝对防止输出两端短路，否则将导致测量失准或失效。 7．电极应与输入阻抗较高的pH计(≥10Ω）配套，以使其保持良好的特性。 8．电极应避免长期浸泡在蒸馏水、蛋白质溶液和和酸性氟化物中。 9．电极避免与有机硅油接触。

10．电极经长期使用后，如发现斜率略有降低，则可把电极下端浸泡在4%HF(氢氟酸）中(3-5)s, 用蒸馏水洗净、然后在0.1mo1／L盐酸溶液中浸泡，使之复新。

11．被测溶液中如含有易污染敏感球泡或堵塞液接面的物质而使电极钝化，会出现斜率降低，显示读数不准现象。如发生该现象，则应根据污染物质的性质，用适当溶液清洗，使电极复新。

注1：选用清洗剂时、不能用四氯化碳、三氯乙烯、四氢呋喃等能溶解聚酸树脂的清洗液，因为电极外壳是用聚碳酸树脂制成的，其溶解后易污染敏感玻璃球泡，从而使电极失效。也不能用复合电极去测上溶液。

12

注2：pH复合电极的使用，最容易出现的问题是外参比电极的液接面处，接面处的堵塞是产生误差的主要原因。

六、数据处理

1.酸度计示值准确性的检定：pHS—3C型酸度计示值准确性应≤±0.01 pH单位，pHS-25型酸度计示值准确性应≤±0.02 pH单位

2．酸度计示值重现性的检定：pHS-3C型酸度计重现性误差不得大于0.05 pH单位。 3.求出测量的葡萄糖注射液pH值及注射用水pH值的平均值，并对结果进行误差分析。 附录：缓冲溶液的pH值与温度关系对照表 温/℃ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 度草酸盐标准缓冲溶液 1.67 1.67 1.67 1.67 1.68 1.68 1.68 1.69 1.69 1.70 1.71 1.72 1.72 邻苯二甲酸盐磷酸盐标准硼砂标准缓冲溶液 9.64 9.40 9.33 9.28 9.23 9.18 9.14 9.10 9.07 9.04 9.01 8.99 8.96 氢氧化钙标准缓冲溶液（25℃） 13.43 13.21 13.00 12.81 12.63 12.45 12.29 12.13 11.98 11.84 11.71 11.57 11.45 标准缓冲溶液 缓冲溶液 4.01 4.00 4.00 4.00 4.00 4.01 4.02 4.02 4.04 4.05 4.06 4.08 4.09 6.98 6.95 6.92 6.90 6.88 6.86 6.85 6.84 6.84 6.83 6.83 6.83 6.84 七、思考题

1． 用酸度计测定pH时为什么必须用标准缓冲液校正仪器？校正时应注意什么？ 2．怎样正确操作pHS-3C型酸度计？

3．复合电极使用前应该如何处理？使用和安装时，应注意哪些问题？ 4．为什么定位时应使用与被测溶液pH接近的标准缓冲液？

5．如果被测溶液温度和定位标准缓冲溶液度不相同时，应如何操作？

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/og2x.html