如何构建一个大肠杆菌高校表达的分子克隆

生物工程

如何构建一个大肠杆菌高校表达的分子克

隆

摘要：基因克隆是把一个外源基因导入生物细胞，并使它得到扩增。但是外源基因DNA片段一般不带有复制子系统及在新的受体细胞中进行功能表达的调控系统。如果要分子克隆在大肠杆菌中高效表达，则需要特殊的载体将克隆基因转入受体细胞，然后运用载体上的复制子和调控系统，进而实现分子克隆的高效表达。

关键词：强启动子，弱启动子，诱导，阻遏

基因克隆的重要环节，就是把一个外源基因导入生物细胞，并使它得到扩增。然而一个外源DNA片段是很难进入受体细胞的，即使进入细胞，一般也不能进行复制和功能的表达。这是因为，所得到的外源DNA一般不带有复制子系统及在新的受体细胞中进行功能表达的调控系统。这样，进行基因克隆是很困难的。在基因工程中，通常是把外源DNA片段利用运载工具送入生物细胞。

载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以及功能表达。 克隆基因的表达通常有三个必须条件：（1）基因的密码区不能被插入序列中断；（2）基因必须在启动子的控制之下，而启动子必须能被宿主细胞的RNA多聚酶有效地识别；（3）mRNA必须相当稳定，并且有效地被转译，产生的外源蛋白质必须不被宿主细胞的蛋白酶快速降解。其中第一个条件是保证克隆基因在

转录的时候不至于中

断。第二个条件则要求

克隆基因在启动子之

下，以保证正常开始转

录。第三个条件则要求

翻译的产物能够在宿

主细胞中停留。现就启

动子的问题重点讨论。

DNA的转录起始区 DNA转录是依赖

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于RNA聚合酶结合于DNA的启动子区域而发生RNA的合成。启动子是一段DNA序列，不同的启动子的效率不同，强的启动子可产生较多的mRNA，弱的则相反。在原核细胞中，有两个地方的DNA序列比较保守。一个是位于转录起点上有10bp的-10bp区域TATAAT序列；另一个地方位于约-35bp区域TTGACA序列。这两个区域对于决定启动子强度是很重要的。虽然大肠杆菌启动子与这些保守序列差不多，但是，事实上很小的差异对启动子知道转录的效率有重大影响，所谓失之毫厘差之千里。强启动子是维持高效率转录的启动子，一般启动子序列于保守序列越接近，启动子越强。很显然的，高效表达的载体需要强的启动子。

此外，两个保守序列之间的DNA对启动子的功能也有影响。各启动子都需

要一些

最适间

隙，间

隙17bp

的启动

子功能

较强。

常

用的高

强度和

调节方

便的载

体有：Lac启动子、trp启动子、tac启动子、PL启动子。

很显然，基因载体应该有强启动子，这样才可以使克隆的基因高效转录。除少数例外，启动子顺序与共同保守区越接近，启动子就越强。

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构建载体时的另一个因素必须考虑的是该启动子能否被调控。大肠杆菌中基因调控有二种主要类型：诱导和阻遏。可诱导基因是将一种化合物加入培养基后其转录部分

即被启动的

基因；常常

该化合物是

可诱导基因

所编码酶的

底物之一。

相反，可阻

遏基因在加

入调控化合

物时被关

闭，停止转

录。基因调

控是一个复杂的过程，仅间接地包括启动子本身。许多位于基因紧上游的，对诱导和阻遏很重要的顺序也应和启动子一起置于表达载体DNA中。因此有可能使调控扩展到表达载体本身，使得可诱导或阻遏通常由启动子控制的基因的化合物，也能够调节克隆基因的表达。

总之启动子的强弱直接关系到克隆基因的表达效率，选择启动子时，强弱是一个重要的选择条件。强启动子是保证克隆基因高效表达的必须条件。出了强弱的选择之外，尽可能选择可调控的启动子，这样可以通过添加化合物促进或阻遏克隆基因的表达，这样可以保护细胞不会被毒性的外来基因表达产物伤害过重，对保护大肠杆菌用重要的作用。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ocs1.html