04诱变育种

交流】抛砖引玉－－谈谈微生物诱变育种

由于微生物自身的自然诱变几率非常低，所以我们在工业微生物育种时，会采用一些人工的诱变剂，物理类的象紫外线，X射线，快中子，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙线等，其中对微生物诱变效果较好的，应用较广的是紫外线，X射线，快中子。

近年来，诱变育种仍备受育种工作者的欢迎，而且还开发了一些新型诱变剂，用于工业微生物育种。 象微波，红外射线，激光，高能电子流，离子注入。

其中离子注入法做为一种新的生物诱变技术已经引起国内外学者的极大关注。

离子注入是20世纪80年代兴起的一种材料表面处理的高新技术，主要用于金属材料表面的改性。1986年在中国科学院等离子体物理研究所被用于农作物育种，之后又被用于工业微生物的诱变育种，成果显著。 附上文章一篇－－－离子束应用于生物品种改良的研究进展..CAJ

离子束应用于生物品种改良的研究进展..CAJ (210.15k)

这一段时间我正在思考这个问题，在这方面非常愿意和战友们讨论。 请教popstar 战友，有无近10年的关于诱变育种的国外文献。谢谢

国内有关微生物诱变方法的文献非常多。大体包括：

物理诱变剂方面：紫外线，X射线、γ射线、中子、β粒子、α粒子，微波、红外射线、激光、高能电子流、离子注入等；

化学诱变剂方面：碱基类似物、烷化剂、脱氨剂、移码诱变剂、羟化剂、金属盐类等。

生物诱变剂方面（其实这就是基因工程育种，在这里姑且叫作生物诱变剂）：噬菌体和基因诱变剂。

正如你所说国内关于诱变的文章很多，很可惜我现在还没有精力收集国外的文章，国内的文献已经足够我参考了，要是太分心大老板会有想法的，毕竟工厂还是讲效益的地方。 还是那句话“抛砖引玉”。

希望我这张帖子能够吸引更多的同行进来参加讨论，能分享到更多的好见解，微生物版更要越做越好。

现有的关于菌株诱变方法的文章，可以说都是报道了一个操作方法，实验结果中都会说产量提高了多少多少，而无机理的深入探讨。这样的实验没有一点重复性，也许这种文章每天都可以编一篇，这样的文章有参考价值？！

你说的很有道理，不排除有的文章一天可以编一篇，但你也不能完全否认国内文章的质量，毕竟不是每个人的文章都是编的；毕竟有的厂筛到了好的菌种，真的赚钱了。

你希望的有机理的深入研究那是要花钱，企业的老板只要你能筛到好的菌种，他是不可能花钱让你深入探讨的，除非是拿国家钱的研究部门，我就是在企业工作，这点深有体会！

你所说的没有重复性，确实是这样的。影响微生物的条件太多了，别的不说就是各地自来水水质的不同就是无法改变的。

不知道什么原因，我有十个急用的分离平皿，里面的单菌落个个发育不良，现在还找不到原因，十分无奈！

非常高兴和popstar 战友的讨论。希望以后能共同多讨论些纯应用的东西。

popstar wrote:

你说的很有道理，不排除有的文章一天可以编一篇，但你也不能完全否认国内文章的质量，毕竟不是每个人的文章都是编的；毕竟有的厂筛到了好的菌种，真的赚钱了。

你希望的有机理的深入研究那是要花钱，企业的老板只要你能筛到好的菌种，他是不可能花钱让你深入探讨的，除非是拿国家钱的研究部门，我就是在企业工作，这点深有体会！

你所说的没有重复性，确实是这样的。影响微生物的条件太多了，别的不说就是各地自来水水质的不同就是无法改变的。

不知道什么原因，我有十个急用的分离平皿，里面的单菌落个个发育不良，现在还找不到原因，十分无奈！

有道理，企业和研究机构的目的不一样，企业希望自己的菌株能够高产，能够赚钱，科研机构还希望做点理论方面的东西去申请课题和经费！

bigboygong wrote:

非常高兴和popstar 战友的讨论。希望以后能共同多讨论些纯应用的东西。 看的出大家对国内工业微生物菌种选育有许多共同的看法，以后还请多多指教！

对于要诱变的机理来说就是那么几种，但是别人所采用的诱变剂不一定在你的 实验上就有用，别人做的别人 哪方面的东西，我们做研究时需要一个创新的思维个过程，不能照搬别人的东西，只能作为一个参考

诱变在很大程度上是靠运气，这一点和菌种筛选有点像，我有时做不好，老板就说你去拜拜佛，烧烧香，当然这是玩笑，但确实有点。

我个人觉得，诱变的方法没有什么这种好那种好，只要你能得到好的菌种就是好的方法。 当然，最重要的前提是有一个好的大通量的挑选方法！

popstar wrote:

你说的很有道理，不排除有的文章一天可以编一篇，但你也不能完全否认国内文章的质量，毕竟不是每个人的文章都是编的；毕竟有的厂筛到了好的菌种，真的赚钱了。

你希望的有机理的深入研究那是要花钱，企业的老板只要你能筛到好的菌种，他是不可能花钱让你深入探讨的，除非是拿国家钱的研究部门，我就是在企业工作，这点深有体会！

你所说的没有重复性，确实是这样的。影响微生物的条件太多了，别的不说就是各地自来水水质的不同就是无法改变的。

不知道什么原因，我有十个急用的分离平皿，里面的单菌落个个发育不良，现在还找不到原因，十分无奈！

分离的单菌落发育不良的问题我也遇到过数次，就我所知，大体可以通过适量增大培养基中的营养成分（碳源或者氮源）以及减少稀释度来解决。我做的是放线菌，通常选择10^3~10^7的稀释度，最后一个稀释度通常会出现有菌斑却始终不出现孢子的情况。

to：andonyo001

我用的培养基是普通的高氏一号，原因可能是我灭菌的时间太长了，那天刚好有事分心了，灭了有三十分钟。因为我重做了一组灭二十分钟的长好了

andonyo001 wrote: popstar wrote:

你说的很有道理，不排除有的文章一天可以编一篇，但你也不能完全否认国内文章的质量，毕竟不是每个人的文章都是编的；毕竟有的厂筛到了好的菌种，真的赚钱了。

你希望的有机理的深入研究那是要花钱，企业的老板只要你能筛到好的菌种，他是不可能花钱让你深入探讨的，除非是拿国家钱的研究部门，我就是在企业工作，这点深有体会！

你所说的没有重复性，确实是这样的。影响微生物的条件太多了，别牟凰稻褪歉鞯刈岳此??实牟煌?褪俏薹ǜ谋涞摹?不知道什么原因，我有十个急用的分离平皿，里面的单菌落个个发育不良，现在还找不到原因，

十分无奈！

分离的单菌落发育不良的问题我也遇到过数次，就我所知，大体可以通过适量增大培养基中的营养成分（碳源或者氮源）以及减少稀释度来解决。我做的是放线菌，通常选择10^3~10^7的稀释度，最后一个稀释度通常会出现有菌斑却始终不出现孢子的情况。

您所说的分离的单菌落发育不良的问题，可能和你的分离培养基有关。不管改变氮、碳等的比例也好，这一步一般后期确定适宜培养基的时候做的比较多。如果你要分离的话 可以试着用一些如黄豆粉、花生粉之类的有广谱性的培养物来做。不知道你的分离使用来干吗的，像我们通常是使用5、6级的稀释来做的。

答dogintheair：

我发酵用的菌种是链霉菌，需要隔半年分离纯化一次。

固体培养基使用黄豆粉、花生粉还没有遇到过（溶解性？），我用的是蛋白胨跟牛肉膏。

离子束应用于作物（包括微生物）遗传育种，合肥的中科院等离子所离子束生物工程研究室研究应该是国内在此方向上的主要研究单位。 下面我介绍一下他们的研究情况： 研究方向

中长期目标（2015年前）：充分发挥多学科交叉的优势，以低能加速器及单离子束精确定位照射技术为平台，开拓低能离子束在生命科学，特别是在农业和环境科学中应用的新思想、新概念、新方法，在若干点上取得具有前沿科学水平和具有重大应用前景的研究成果，扩大在国际上的影响。培养和造就一批年龄结构合理、具有开拓创新能力的学术骨干队伍，建成国家核能科学与生物学交叉的创新研究基地和国际上知名的单粒子效应研究中心，对我国农业和环境健康事业可持续发展做出重要贡献。

近期目标（2005年前）：单粒子束束径达到微米量级，实现单粒子束细胞器定位诱变，研究损伤信号在细胞内和细胞间传导的途径及基因不稳定性；建立低能离子与生物体系相互作用基本理论，为分子进化和离子束生物工程学奠定基础；创建一批特殊基因型材料及基因定位、克隆与应用；查明大部分低剂量环境因子暴露对健康的影响，找出解决问题的途径。 研究内容：

（1） 单粒子束加速器及单离子束精确定位系统研究

产生微米或微米以下的离子束，对细胞进行非接触式手术，损伤部分基因，探测细胞的应答，研究细胞通

讯、损伤修复、自由基和三重态；同时，发展单细胞育种技术。目前，这已是发达国家竞相开发的研究生命科学的高技术平台。 本方向主要研究内容： 低能加速器；

离子光学和束流品质优化； 束的稳定、传输和准直技术 ；

穿过或注入细胞的粒子数探测和控制技术 ； 细胞图象识别和精确定位技术； 细胞显微快速照射自动控制等等。

（2）离子束与生物分子、细胞相互作用研究

从细胞和分子层次上建立模型研究低能离子与生物体相互作用不仅为离子束在遗传改良上的应用奠定基础，而且在评价环境低剂量辐射的危害性和模拟原始地球环境低能离子在生命起源中的作用具有重要的意义。这已形成了新的学科增长点。 本方向主要研究内容：

哺乳动物细胞离子注入方法学研究（动物细胞离子束育种技术发展研究）； 离子注入哺乳动物细胞致突变机理；

细胞信号传导（Bystander effect）的时空关系； 环境低剂量暴露危害性评价及防护模型； 离子注入非对称合成反应动力学；

低能离子在生命化学起源和星际分子形成中的作用。 （3）离子束生物工程学研究

本研究将离子束诱变、转基因和分子生物学方法进行技术集成，创建新种质材料，丰富基因库，进而对某些基因进行标记、克隆和应用。 本方向主要研究内容：

离子束生物工程方法发展研究； 单离子束单细胞育种； 离子束介导构建基因工程菌； 微生物发酵过程研究； 突变基因标记、克隆与应用。

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诱变育种能大幅度地增加菌种的变异量，从而人们能从诱变后的群体中筛选优良菌株。常采用物理、化学等诱变剂来动摇菌种的遗传性，直接或间接地作用于核酸物质，能强烈地引起菌种的变异。诱变育种的诱变剂很多，常用的有紫外线、X光线、Y射线及硫酸二乙酯（DFS）、5-溴尿嘧啶（5－BU）、氮芥（Nm）、N'广甲基N'亚硝基胍（NTG）等。

诱变育种方法有三个步骤：一是准备孢子悬浮液，将新鲜的食用菌无菌孢子移入5毫升无菌生理盐水或磷酸缓冲液中，摇匀后即成孢子悬浮液。孢子悬浮液的浓度以每毫升含孢子106～109个为宜。二是诱变处理，用诱变剂处理如紫外线处理，诱变处理应在暗箱内进行，箱内装15瓦紫外灯1支，悬挂于30厘米高处，诱变处理时应先开灯20分钟，使波长稳定，然后将相于悬浮液倒入直径为6厘米的无菌培养皿中，打开皿盖，照射0.5～1分钟。照射后的孢子悬浮液每毫升所含的活孢子数约在105～108个。因此要得到单个菌落，必需先用无菌水将照射后的孢子悬浮液稀释1000～10万倍。然后取释释液0.2毫升涂布于装有琼脂培养基的培养皿上，在25℃下培养5～10天，这时就能在每个平板上得到数十个单菌落。选纯正、健壮的单个菌落移入斜面试管内，供进一步测定筛选。三是挑菌筛选，诱变处理只是扩大了它的变异范围，并不能决定变异的方向，所以诱变最大的困难是筛选，只有在大量的、各种各样的变异中，才能筛选到符合需要的变异个体。这样就需将诱变后的孢子经培 养长出菌落后应及时挑菌，选发育健全的单个菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待外面长好后，再分别接 入2～4瓶原种中，然后进行栽培试验，反复比较各菌落的生产性能，择优留取。

各位同仁，小弟我有一个想法，象诱变育种这种方法是非定向诱变，然后通过定向筛选来达到目的的，工作量很大，往往筛很久都没有什么好的结果，现在基因工程的快速发展，应该可以采取定向的诱变技术。

转贴：微生物育种 来自：华南师范大学

人们研究微生物遗传学的目的，就是为了更好地利用和控制微生物的遗传变异特性，使之为生产建设服务，为人类造福。在微生物工业上把所有通过培养微生物，使某种特定代谢产物大量积累的过程均称为发酵。目前，发酵已由野生型菌株发酵向代谢调控发 酵转移。所谓代谢调控发酵，就是利用遗传学的原理和方法，人为地在DNA水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量积累的发酵。代谢调控发酵的关键之一就

是选育从遗传角度解除了微生物正常代谢机制的突变株。微生物育种的方法目前主要是利用诱变、杂交和遗传工程等。 ?

一、突变与育种 ?

1.自发突变与育种 ?

生产中选育菌株--在日常生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变。富于实际经验和善于细致观察的人们就可及时抓住这类良机来选育优良的生产菌株。例如，从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的新菌株。?

定向培育优良菌株--定向培育是指用某一特定因素长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进 行传代，以达到累积并选择相应的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变 的 频率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程十分缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因 工程技术相比，定向培育法带有“守株待兔”的性质，除某些抗性突变外，一般要相当长的时间。?

近年来，用梯度平板法筛选抗代谢拮抗物的变异菌株，以提高相应代谢产物产量。这是定向培育工作中的进展。例如，异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物(即结构类似物)，两者分子结构类似：? 吡哆醇-----------------------------异烟肼?

定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产菌株的方法：先在培养皿中加入10ml的一般琼脂培养基 ，使皿底斜放，待凝固后，将皿底放平，再在原先的培养基上倒10ml含有适当浓度(据实验而定)的异烟肼的培养基，待凝。用此法制成的琼脂平板上存在着一个由浓到稀的异烟肼的浓度梯度(图8—31)。然后在平板表面涂大量微生物细胞，培养后，出现图8—31( 右)所示的结果。这是因为，右边是低浓度异烟肼区域，因此长满了原始的敏感菌，而左侧是高浓度异烟肼区，该区中微生物的生长受到了抑制。只有在适中的部位才出现少数由抗异烟 肼细胞形成的菌落。这类抗性菌落是由于供试菌中个别细胞产生了某种自发突变，所以能形成了抗异烟肼的突变体。根据微生物产生抗药性的原理，它们可能产生了分解异烟肼的酶类，也可能通过合成更高浓度的代谢产物(吡哆醇)来克服异烟肼的竞争性抑制作用。实验结果证明，多数菌株因发生了后一类的突变才获得抗性。因此，利用梯度平板法可达到定向培育某一 代谢产物高产菌株的目的。 2.诱变育种

?诱变育种是指利用物理或化学透变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度 提高，然后

设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎都是通过透变育种而大大提高了生产性能的。其中最突出的例子就 是青霉素生产菌株的选育。1943年，产黄青霉每毫升发酵液只产生约20单位的青霉素，通过透变育种和其它措施配合，目前的发酵单位已比原来提高了三四十倍，达到每毫升5万～10万单位。?

诱变育种除能提高产量外，还可达到改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的，故仍是目前使用最广泛的育种手段之一。? 诱变育种的基本路线

以选育在生产实践中最重要的高产突变株为例。概括表示如下：

-------------------诱变--绝大多数个体死亡 --------出发菌株--------{?-------多数未变 ??? -------------------------少数存活{---------多数负变

----------------------------------少数突变{---------多数幅度小

-------------------------------------------少数正变{-----------多数不宜投产 ----------------------------------------------------少数幅度大{

---------------------------------------------------------------少数适宜投产 诱变育种的原则?

----挑选优良的出发菌株--出发菌株就是用于育种的原始菌株。出发菌株适合，育种工作效率就高。参考以下实际经验选用出发菌株：①以单倍体纯种为出发菌株，可排除异核体和异质体的影响；②采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株。由于有些菌株在发生某一变异后，会提高对其它诱变因素的敏感性，故可考虑选择已发生其它变异的菌株为出发菌株。例如，在金霉素生产菌株中，曾发现以分泌黄色 色素的菌株为出发菌株时，产量下降，而以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量会不断提高。生产实践证明，经长期选用的菌株，继续用诱变剂处理，有时很难使其产量再提高，特别是生产水平已很高的菌株。在此情况下，应设法改变菌株的遗传型，以提高 菌株对诱变剂的敏感性；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。?

处理单孢子(或单细胞)悬液--在诱变育种中，所处理的细胞必须是均匀状态的单细胞悬液。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。有时，虽然处理的是 单核的细胞或孢子，但由于诱变

剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变无法反映在当代的表型上。经过DNA的复制和细胞分裂，表型才会发生变异，出现不纯菌落，这就叫表型延迟。不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。?

由于上述原因，故在诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；对芽孢杆菌则应处理它们的芽孢(因芽孢只有一个核质体，而其营养体一般有两个核质体)。?

细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响。细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。? 在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤。?

选择简便有效、最适剂量的诱变剂--诱变剂主要有两大类，即物理诱变剂和化学诱变剂。物理诱变剂如紫外线、X射线、γ射线和快中子等；化学诱变剂种类极多，主要有烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂有N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基亚硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。要知道某一诱变剂是否有诱变作用以及诱变作用的强弱程度，最理想的方法当然是设法直接测定它对提高某一菌种产量的实际效果究竟有多大。可是在具体工作中，由于此法工作量太大，定量性状不易确定，所以一般常用其他简便而间接的方法来定性确定。例如营养缺陷型的回变法、抗药性突变法、形态突变法或溶源细菌的裂解法等。采用这些方法的理论依据是：一切 生物的遗传物质都是核酸，尤其是DNA，一切诱变剂的作用机制都是引起DNA分子结构的改变。因此，凡对微生物有效的诱变剂，对高等生物同样有效，反之亦然。同时，凡能引起某一性状突变的诱变剂，对其他性状也必然有类似的作用。1973年建立的利用一组鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimulium)营养缺陷型的回复突变来检测各种化学物质对高等动物 是否有致癌作用的艾姆氏试验法(Ames test)，就是利用上述诱变剂“共性原则”的一个范例。利用这种大大简化后的方法，发现化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比关系(约有95%的致癌剂都是诱变剂)。?

目前常用的诱变剂主要有紫外线(U、V)、硫酸二乙酯、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG或MNNG)和亚硝基甲基脲(NMU)等。后两种因有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。?

各种诱变剂有不同的剂量，用强度×时间表示，如紫外线的强度单位是尔格，X射线的单位是伦琴(R)或拉得(rad)等，化学诱变剂的剂量则以在一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。在育种实践中，常采用杀菌率来作各种诱变剂的相对剂量。?

诱变剂的作用：①提高突变的频率；②扩大产量变异的幅度；③使产量变异向正变 (即提高产量的变异)或负变(即降低产量的变异)的方向移动(图8-32)。凡在高诱变率 的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。?

要确定一个合适的剂量，通常要进行多次试验。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果，发现正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现于偏高的剂量中，还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为99或99.9%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为70%～75%，甚至更低(30%～70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。?

利用复合处理的协同效应--诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应(表8—6)。复合处理有几类：一类是两种或多种诱变剂的先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。

二、原生质体融合育种 1.原生质体融合技术的发展?

-原生质体(protoplast)一词最初是由Hanstein用来表示植物细胞壁内的原生质。1952年，Salton用它来表示动植物和微生物细胞去除细胞壁以后的一种细胞结构。1953年，Weibull等人首先用溶菌酶溶解细胞壁获得了原生质体。1958年，Brenner等人提出了细菌原生质体的 3条标准，即没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感。按照同样的标准，Eddy、Emerson、Bachmann等人用蜗牛酶配合其它条件分别从酵母菌或丝状真菌中释放出原生质体。Douglas首先用溶菌酶从链霉菌菌丝中制备出原生质体，并用噬菌体吸附及血清学 试验证明细胞壁确实溶解。日本的岗西等人对链霉菌原生质体的形成和再生的条件进行了系统的研究，其结果至今仍为不少实验室所引用。Landman等人以及Wyrick和Rogers对枯草杆菌的原生质体的形成和再生进行了研究。所有这一切，都为原生质体融合技术的创立提供了必要的条件准备。? 膜的融合是生物界中的普遍现象，如受精、胞饮、肌纤维的形成等均涉及到膜的融合。在1954年，Stahelin就曾用连续照像追踪了炭疽杆菌的原生质体融合。1985年，日本的冈田善雄发 现灭活的仙台病毒可以诱发细胞融合，从而奠定了细胞融合的技术基础。目前普遍采用的化学融合方法是在1974年才建立起来的，当时，高国楠发现聚乙二醇(PEG)在Ca?2+存在下能促使植物原生质体融合，并显著提高融合频率。接着，PEG的促融作用很快在微生物中得到证实，成功地实现了酵母菌、霉菌、放线菌和细菌等多种微生物在株内、株间、种间以及属间的融合，从而使原生质体融合技术在微生物方面形成了一个系统的实验体系。目前，原生质体融合已成为微生物遗传育种的一种新工具。 2.原生质体融合育种的特点?

原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG)助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。原生质体融合技术具有7个方面的优点：?

加入了融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。已知霉菌与放线菌的融合频率为10?-3～10?-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10?-3～10?-6。?

受接合型或致育性的限制较小--由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体 的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制 比较小。?

重组体种类较多--由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换 ，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。?

遗传物质的传递更为完整--由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的 交换更为完整。原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起 的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或 稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。?

可获得性状优良的重组体--与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。例如，唐 氵尺昌彦等将氨基酸生产菌AJ3 419(AEC?r+ile?-)与Bl-4(AHV?r+l ys?-)的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC?r+AHV?r+ile?-+lys?-)，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1倍。?

可提高育种效率--采用温度、药物或紫外线照射等处理纯化一方亲株的原生体，然后再与另一亲株的活原 生质体融合，因此就可以在筛选中除去一方亲株，从而提高筛选效率。?

可采用产量性状较高的菌株作为融合亲株--由于遗传标记如缺陷型往往影响工业微生物的某些生物合成能力，而进行一般基因重组时又 必须采用较多的遗传标记，因此势必使出发菌株的生产性能下降而影响杂交子代的生产水平。但由于原生质体融合频率较高，所以可以采用较少标记或不带标记的菌株进行融合，这对改良生产菌株性能更为有效。

除此以外，原生质体融合技术还具有存在着两株以上亲株同时参与融合以形成融合子的可能，以及提高菌株产量潜力机率较大等特点。因此，利用原生质体融合选育新菌株已受到国内外的普遍重视。? 3.原生质体融合育种的步骤?

原生质体融合育种一般包括如下步骤：①标记菌株的筛选；②原生质体的制备；③原生质体的再生；④原生质体的融合；⑤融合子的选择；⑥实用性菌株的筛选。原生质体融合的基本过程。

----标记菌株的筛选--在原生质体融合的过程中，通常所用的亲株均要有一定的遗传标记以便于筛选。当然，所需的目的基因并不一定与标记基因连锁，但它毕竟可以大大减少工作量，提高育种效率。融合亲株获得遗传标记的方法可采用常规的诱变育种方法，一般可以以营养缺陷和抗药性等遗传性状为标记。在此必须注意的是标记必须稳定。采用抗药性菌株时，抗药性除可以作为标记外，在实验 中还可以排除杂菌污

染的干扰。至于标记的数量，Schaeffer指出，每个亲株都各带有两个隐性性状的营养缺陷标记就可以排除以后实验结果中获得的原养型融合子是回复突变的可能。所以选择性标记也无须过多。如果已知融合频率较高，为了减少标记对菌株正常代谢的干扰，也可以采用仅有一个标记的菌株作为融合亲本。当然，最好选择对菌株生产性能没有影响的标记。特别是对于工业生产菌来说，用诱变方法获得标记，往往对该菌株的生产性能影响甚大。因此，在选择标记时，尽可能采用该菌株自身已带的各种遗传标记。? ----原生质体的制备--获得有活力和去壁较为完全的原生质体是原生质体融合育种技术的先决条件。在细菌和放线菌中制备原生质体主要采用溶菌酶；在酵母菌和霉菌中一般可用蜗牛酶和纤维素 酶。影响原生质体制备的因素有许多，主要有以下几个方面。?

----菌体的前处理--为了使酶的作用效果更好，可对菌体作一些前处理。例如，可在细菌中加入EDTA、甘氨酸、青霉素和D-环丝氨酸等；在放线菌的培养液中加入1%～4%的甘氨酸等；在酵母菌中加入ED TA和巯基乙醇等；在粟酒裂殖酵母中加入2-脱氧葡萄糖等。加入这些物质的目的，就是使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。以细菌为例，甘氨酸可以使细胞壁肽聚糖中的L-丙氨酸和D- 丙氨酸残基为甘氨酸所取代，结果干扰了正常的交叉键合。青霉素能干扰甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D-丙氨酸之间的联结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的细胞壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。环丝氨酸的结构与D-丙氨酸相似，可竟争性抑制丙氨酸消旋酶的作用，使L-丙氨酸不能转变为D-丙氨酸，结果细菌就不能合成N-乙酰胞壁酸五肽，细胞壁难以形成。?

----菌体培养时间--为了使菌体细胞易于原生质化，一般选择对数生长期的菌体。这时的细胞正在生长，代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。此时的原生质体形成率高，再生率亦很高。一般地说，对于细菌采用对数生长后期为好，对于放线菌，Baltz建议采用对数生长期到平衡期之间的转换期最为合适。? ----酶浓度--对于不同种属的微生物来说，不仅对酶的种类要求不同，就是酶的浓度也有差异。一般地说 ，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率的提高不明显。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。由于影响原生质体形成和再生的因素相互有关，若原生质体形成率很高而再生率很低，对于原生质体融合育种来说不大适合。因此，有人建议以使原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最佳酶浓度。?

----酶解温度--温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度的提高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度的增加，酶蛋白逐渐变性而使酶失活。因此，最适温度是这两种效应的共同结果。另外 ，人们发现酶解温度对原生质体的再生影响甚大。因此，在选择最佳酶解温度时，除了要考虑酶的最适温度外，还要以原生质体再生率加以校正。一般地说，酶解温度应控制在20～40 ℃。?

----酶解时间--随着酶解时间的延长，菌体去壁程度愈完全，表现为原生质体形成率逐渐上升。当酶解达到一定时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质

体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成大量原生质体破裂，从而使原生质体失活，表现为原生质体再生率急剧降低。即原生质体的质量与酶解时间密切相关。酶解时间过短，原生质体形成不完全，结果会影响原生质体间的融合；酶解时间过长，原生质体的再生率降低，最终亦不利于原生质体融合。因此，必须选择合适的酶解时间。?

----渗透压稳定剂--渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨胀作用，而且还有助于酶和底物的结合。渗透压稳定剂多采用KCl、NaCl等无机物和甘露醇、山梨醇、蔗糖、丁二酸钠等有机物。菌株不同，最佳稳定剂亦有差异。在细菌中多用蔗糖、丁二酸钠、NaCl等，在酵母菌 中多用山梨醇、甘露醇等，在霉菌中多用KCl和NaCl等。稳定剂的使用浓度一般均在0.3～0. 8mol/L之间。?

----除此以外，破壁时的pH值、培养基成分、培养方式、离子强度和种类等对原生质体的形成亦有一定的影响。?

----细胞壁溶解后，原生质体即以球状体的形态开始释放。杆状细菌的原生质体释放一般是从杆菌的一端进行的，棒状杆菌八字型排列细胞的原生质体释放是从棒状杆菌裂殖断裂一 端开始。由于原生质体比菌体细胞对渗透压更为敏感，所以在蒸馏水这样的低渗溶液中即可立即破裂，在一般培养基平板中也无法形成菌落。根据这一原理，原生质体形成率可按下式进行计算：

------------破壁前菌数-剩余菌数

原生质体形成率=-----------------------×100% -------------破壁前菌数

----原生质体的再生--酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂，这是原生质体融合育种的必要条件。由于原生质体已经失去了坚韧的外层细胞壁，仅有一层100厚的细胞质膜，是失去了原有细胞形态的球状体。因此，尽管具有生物活性，但它毕竟不是一种正常的细胞，在普通培养基平板上也不能正常地生长、繁殖。为此，必须想办法使其细胞壁再生出来，以恢复细胞原有形态和功能。?

----由于仅有细胞质膜的原生质体对渗透压很敏感，很容易破裂致使原生质外流而使细胞死亡，所以，再生培养基必须与原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中加入具有一定渗透压的基质即渗透压稳定剂，这与原生质体制备一样。对于不同的微生物来说，其原生质体的高渗再生培养基的主要成分是不同的。表8-7列出了几种常用的微生物再生培养基中的主要成分。

原生质体的再生是一个十分复杂的过程，至今了解不多。据一些学者研究认为 ，若原生质体的 细胞壁剥离不彻底，则有助于细胞壁的再生。残留的细胞壁尤如结晶时的“晶种”一 样。大量实验亦证明，破壁太

彻底往往会引起原生质体再生率的大大降低。影响原生质体再 生的因素主要有菌种本身的再生特性、原生质体制备条件、再生培养基成分及再生培养条件等。

----一般在进行融合实验前首先要对原生质体再生率进行测定，否则就很难确定不能融合或融合 频率低的原因是由于双亲原生质体本身没有活性或再生率很低，还是由于融合条件不适合所致。 因此，测定原生质体形成率和再生率不仅可作为检查、改善原生质体形成和再生条件的指标 ，而且也是分析融合实验结果、改善融合条件的一个重要指标。原生质体再生率可用下式进行计算：

----------------------再生菌数-剩余菌数

----原生质体再生率=--------------------→×100% ----------------------破壁前菌数-剩余菌数

----一般地说，原生质体再生率通常在百分之零点几到百分几十，有的甚至可达100%。?

----原生质体的融合 --仅仅将原生质体等量地混合在一起，融合频率仍然很低，只有加入表面活性剂聚乙二醇(PEG)，融合频率才会出现突破性的提高。融合促进剂PEG具有强制性地促进原生质体融合的作用 ，其分子量有多种，从1，000到12，000，但在微生物原生质体融合时多用分子量为1，000至6，000的PEG，特别是4，000和6，000两种。在原生质体融合过程中，除了要加入PEG外，还要加入C a?2+、Mg?2+等阳离子，它们对融合亦有促进作用。?

----PEG诱导融合的机制 --君家德郎认为，PEG可以使原生质体的膜电位下降，然后，原生质体通过Ca?2+离子交联而促进凝集。另外，由于PEG渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质膜表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质胶粒的流动性，从而促进了原生质体的相互融合。人们通过对植物原生质体融合的研究发现，融合的程序开始是由于强烈脱水而引起原生质体的粘合，不同程度地形成聚集场，原生质体收缩并高度变形，大量粘着的原生质体 形成非常紧密的接触。接着，接触处的膜间蛋白颗粒发生转位和聚集，然后邻近的脂质分子发生相互反应。由于Ca?2+等强烈地促进脂质分子的扰动和重新组合，结果使接触处的膜形成小区域的融合，产生小的原生质桥。原生质桥逐渐增大，直至两个原生质体融合。?

----影响原生质体融合的因素 --主要有融合剂的浓度、作用时间、阳离子浓 度及pH值等， 更为重要的是亲株本身特性的选择以及原生质体的活力。据报导，PEG的分 子量以4000～6000为好，由于PEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于20%会使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质体收缩而降低融合频率。因此，融合时PEG的 最终 浓度常采用30%～40%。由于PEG一加入，原生质体间的粘着即强烈地发生，融合就能较长时 间有效地进行，所以PEG的处理时间不需太长。此外，PEG在高浓度下有毒，因此也要求融合 时间不宜过长。阳离子浓度对融合频率亦有很大的影响。已知融合时Ca?2+离子的

浓度 以0.01mol/L为最佳，而K?+、Na?+离子会降低融合频率。这是因为K?+、Na?+可优先结合到质膜上，从而降低了Ca?2+离子的刺激作用。关于融合时的pH值，人们发现在有 Ca?2+?存在的条件下，pH为碱性条件能刺激产生最大的融合频率。这是因为，融合时的 pH能够改变体系的电性状态，进而影响原生质体的融合。?

----Hopwood指出，若采取先用紫外线照射原生质体再进行融合，则可以大大增加融合频率。

融合子的选择--按照Schaeffer的观点，有两个遗传标记互补就可以确定其为融合子。因此，就可以通过选择性遗传标记，在选择培养基上挑出融合子。原生质体融合后产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体 。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至以异核状态移接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离和选择，才能加以确定。?

----为了提高融合子中基因重组的频率，可以将PEG处理的原生质体悬液直接培养于高渗选择培养基上，而不采用先培养于高渗培养基上然后再转接到选择培养基上的方法。这是因为，若早期就在完全培养基上再生，二倍体细胞于两条染色体复制之前就会发生分裂，结果重组机率下降。因此，为了获得较多的重组体，有些学者建议选择性地调节重组体再生的环境，可以稳定杂核子的形成和增加下一步的遗传重组能力。? ----实用性菌株的筛选--微生物原生质体融合是一种新的基因重组技术，它具有定向育种的含义。但是，融合所产生的融合子类型仍然是各种各样的，性能和产量不同的情况仍然存在。例如，丁友日方等以纯齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866为亲株进行原生质体融合，对所获得的融合子进行了初筛。 4.原生质体融合育种的应用 ?

----随着原生质体融合育种技术的发展，育种成果不断涌现。丁友日方等以球形芽孢杆菌TS-1和苏云金芽孢杆(Bacillusthuringiensis)H4为亲株(前者对淡 色库蚊有高毒力，后者对粘虫及玉米螟等有高毒力)，在2～3mg/ml溶菌酶浓度下，42℃酶解45min，获得了原生质体。其原生质体形成率和再生率分别为91.02%、37.6%及93.3%、31.2%。然后将获得的原生质体以1∶1比例混合，加入40%的PEG于42℃保温5min。结果获得了既 杀双翅目又杀鳞翅目幼虫的融合子。日本的唐氵尺昌彦等 将赖氨酸生产菌AJ11082与谷氨酸生产菌A J11638进行融合，从融合子中选育出生长最快的AJ11794和AJ11793，该融合子在积累等量赖 氨酸(5.28g/dl)的情况下，其培养时间(31.5h)不到亲株(72h)的1/2?。?

----在链霉菌原生质体融合育种方面，邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新霉素产生菌的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产生原养型重组体的频率为10?-4。其中58%产生巴龙霉素，并从中获得了巴龙霉素产量比原始菌株(300μg/ml)提高5～6倍的融合子。杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株进行融合，以自身抗 菌素抗性为标记选择种间融合子，从中获得了一株正定

霉素产量较亲株提高了2.5倍的融合子。古巴的Valin等以土霉素产生菌龟裂链霉菌为亲株进行种内融合，结果大多数融合子产生土霉素的效价均超过了100μg/ml，比亲株提高了4～5倍。?

----在真菌原生质体融合育种方面，蔡金科等以酒精酵母和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)为亲株进行属间融合，获得了在以乳糖为碳源的培养基中乙醇产率较亲株提高了2.5倍的融合子。焦瑞身等以产生D-氨基酸氧化酶的三角酵母(Trigonopsis variabilis)为亲株进行种内融合，结果获得了D-氨基酸氧化酶的活力比亲株酶活力提高了2倍的融合子。Kirimura等以柠檬酸生产菌黑曲霉(Aspergillusniger)为亲株进行种内融合，获得了柠檬酸产量比亲株提高了1.2倍的融合了。由此可见，原生质体融合已成为微生物遗传育种的有效工具，必将为应用微生物工业带来勃勃生机。

离子束生物工程学应用

上世纪８０年代中期，我国科学家进行着一项鲜为人知的实验。他们将一束离子加速，注入到生物体内，想

看看实验体系中究竟发生了什么。１９８６年终于发现，离子注入后的水稻种子如同搭乘阿波罗飞船太空旅行的玉米一样，叶片上出现了黄色的条纹。人们深入研究了这一现象，并很快投入了应用。

离子束在生物工程学中的应用离不开对原初过程的理解。研究发现，离子束就像“手术刀”那样可对生物体表面进行刻蚀，留下一个个纳米尺度的微孔，后来的离子甚至比离子大几十、上百倍的ＤＮＡ分子，也可由此注入细胞。离子注入细胞时，不断把它的能量传递给被它碰撞的“靶”原子，自身的速度慢慢降下来。被它碰撞的靶原子如果获得较大的能量，就会从原来的位置跑出来，也像注入离子那样碰撞其他的靶原子。这就好比打台球，主球（注入离子或从原位撞出的原子）击中排列在一起的彩球（生物分子）中的某一个（组成分子的原子），引起级联碰撞，被碰到的所有球都移动位置重新排列。最终，慢化后的注入离子、移位原子和本底元素在新的位置上重组，按化学反应规律形成新的分子。

这种规律用于解释离子注入生物效应物理化学过程是成功的。但是，中国科学家并没有就此止步，而是提出了新的命题，即“低能离子在生命化学起源和星际分子形成中的作用”问题。天文观察可知，太阳风和星际分子间低能粒子占绝大部分。在原始大气中，由于雷电、火山爆发、地壳放射性元素的衰变，都可能产生低能粒子。模拟星际分子或原始大气组份离子，如Ｃ＋离子注入水，可形成甲酸、乙酸和丙酸，Ｎ＋离子注入水可形成氨水，而Ｃ＋离子注入氨水可形成三种氨基酸。后来的实验证明，ＣＯ＋、ＣＯ２＋、ＣＨ４＋离子注入水可形成丰富有机分子；离子注入有机分子，只要实验系统中有氮参与，不管氮元素是有机分子中所含有的还是来自注入离子，都有一定的几率形成带有氨基的有机分子，有的还可以形成氨基

酸，提示低能离子在生命化学起源中或星际分子形成中的确发挥了重要作用。这种作用可以发生在海洋，也可以发生在陆地，再淌入海洋。

上述研究不仅增加了人们对生命化学起源途径的认识，而且对开拓离子束生物工程学应用提供了重要的基础知识。

所谓离子束生物工程，就是将人们希望的离子注入到遗传物质上，使原子分子移位、重排，最终按化学反应规律重组ＤＮＡ分子结构；或者，利用离子束加工细胞，在细胞壁形成可修复的小孔，改变孔底电性，促进外源基因（组）转入细胞，实现在新的背景条件下的遗传转化。

离子束生物工程学从开创到技术系统建立到实际应用才只有十年多的时间，已在工农业生产上发挥了重要作用。

例如，离子束生物技术修饰的维生素Ｃ高产菌株产业化使我国维生素Ｃ行业在国际竞争中取胜就是个典型的例子。众所周知，维生素Ｃ是我国战略出口产品。２０世纪９０年代初，国内有近３０家企业，出口占国际市场３０％左右，挤占了国际市场。于是，国际维生素Ｃ巨头掀起价格大战，使我国Ｖｃ行业损失惨重，到１９９８年，只剩下四家苦苦支撑。正是在这一年，维生素Ｃ高产菌株转让东北制药和江山制药，在３００吨罐试产，糖 － 酸克分子转化率达到９４．８％，重量转化率为１０２％。这就是说，１００公斤山梨糖可产出１０２公斤古龙酸（维生素Ｃ前体），几乎接近菌种转化率的极限，被喻为“自Ｖｃ二步法发酵发明以来的重大突破”，引起一场“间谍战”。

据业内专家透露，现在，全行业都在使用新菌株。２００２年，我国Ｖｃ行业成为国际主要供应商，当年下半年就为国家新增外汇２０００万美元，２００３年仅江苏江山一家，创造利润就有２亿元。

再如，花生四烯酸是人体必需不饱和脂肪酸。但是，由于花生四烯酸资源限制，迟迟得不到开发利用。２０００年，为推广应用离子束生物工程菌生产花生四烯酸技术，在武汉成立一家新公司——武汉烯王生物工程公司，２００２年建厂投产，产品出口欧美、东南亚二十多个国家和地区。２００３年按欧盟食品标准通过认证，吸引世界５００强之一的嘉吉公司投资，有可能建成世界上最大的花生四烯酸生产基地。

粮食安全是国家发展、社会稳定的关键因素之一。１９９７年，离子束生物工程学瞄准改变双季稻区稻农

双抢时节紧张、艰苦、低效的耕作技术，创制一种即做早稻直播又做晚稻直播的水稻新种质。经过７年１４季的研究，终于开发出“双季同种，联作直播”双季稻种植新模式。

２００２、２００３年春秋四季由省、市组织专家跟踪测评，每季亩产均在５００千克以上。经农业部稻米质量检测中心检测，所有指标达到部颁优质米标准。据专家测算，新技术每亩每季节省费用１８９元，配以机械化收割，一个稻农可由原来只能耕作５亩发展到５０亩。这一新技术的核心在于双季用同一个品种。如果品种不同，早稻品种收割时的落粒就变成晚稻品种的杂草，不仅影响晚稻产量，而且由于品种混杂而影响晚稻的商品性。

粮食安全还有一个储存问题。国家每年花在水稻储存上的费用达数百亿元，给财政带来沉重负担。１９９７年，离子束生物技术结合常规育种，创制了耐储存水稻皖鉴２０９０，储存４２个月发芽率仍在９８％，而日本耐储存水稻ＤＡＷ ＤＡＭ发芽率已降为零。温总理非常重视，亲自批示：“这是一项对保障国家粮食安全有重大意义的研究工作。要集中优势力量联合攻关，加快水稻及其他粮食作物耐储品种的培育和推广步伐，争取早日解决粮食安全储存问题”。

科学家预言，开发与人类健康有关的多种营养素集中到一种植物的技术是２１世纪农业生物技术发展方向之一。离子束生物工程学在这方面的应用显示其独特的优点。

１９９８年夏天，合肥低温多雨，西瓜卖不出去，瓜农一季的辛苦白费了。这种情况触发了科技人员的灵感：“瓜农既卖瓜又卖叶子就好了”。他们用离子束介导法把银杏遗传物质导入西瓜，当代在西瓜叶内检测到银杏内脂。如果这一性状能稳定遗传，那西瓜叶将会像银杏叶一样值钱了。在２０００年中国首届博士后学术大会上，报道这一实验的论文在９００多篇论文中脱颖而出，获得了农林口唯一的一等奖。

后来的研究表明，在瓜叶、茎中含有银杏内脂的西瓜植株呈递增趋势。在每代种植的２００株中，第四代有６株、第五代９株、今年（第六代）１１株。从一级质谱和二级质谱看，所有检测到的银杏内酯都是Ｃ型。

为了开展离子束生物工程学应用的研究，中国科学家发明了“低能离子束细胞修饰技术和装置”，成为新领域研究的基本方法和经典装置。２００３年，国家知识产权局和世界知识产权组织授予这一发明为“中国专利金奖”。

现在，他们又开发出一个一个地向细胞预定位置投射离子的技术。中国科学院组织专家验收时指出，这是“我国离子束辐照技术的重大突破，必将大大开拓离子束的应用范围”。

这种单离子束细胞精确定位技术使科学家能选择性地照射细胞、细胞核或细胞器，切断基因，研究损伤修复、信号传导、基因表达调控和发育生物学等热点课题。

科技创新是一个民族立足的根本。离子束生物工程学作为新的交叉学科分支已经走过了十多年的时间。到２００３年底统计，仅本实验室一家利用离子束生物技术育成１８个新品种大面积推广，６个新菌株全部产业化，在工农业生产上创造了３０亿元的经济效益。

去年，中国科学院在知识创新工程总结材料中，将“离子束生物工程学”列为全院３１项“已经取得的高技术领域对我国产业发展具有带动作用，对国家安全具有战略意义的自主创新成果”之一和６９项“已培育出的新的科技增长点”之一，且作为建院５０年周年成果展８０余项成果之一。几年来，安徽省人民政府连续奖励实验室４７万元。(http://www.ebiotrade.com/)

诱变育种是指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。

出发菌种是指用于诱变的原始菌种。出发菌种可以是从自然界的土样或水样中分离出来的野生型菌种；也可以是生产中正在使用的菌种；还可以从菌种保藏机构中购买。选择的原则是菌种要对诱变剂的敏感性强、变异幅度大、产量高。

为了使菌体与诱变剂均匀接触，通常要将出发菌种制成细胞(或孢子)悬浮液，再进行诱变处理。诱变剂有物理诱变剂(如紫外线、X射线、γ射线、快中子)、化学诱变剂(如亚硝酸、硫酸二乙酯、氮芥)等。在生产实践上，选用哪种诱变剂、剂量大小、处理时间等，都要视具体的情况和条件，并经过预备实验后才能确定。

菌种经诱变处理后，会产生各种各样的突变类型。如何从中挑选出所需要的突变类型呢?一般要经过初筛和

复筛两个阶段。下面以青霉素产生菌高产突变菌种的筛选为例说明。将经诱变处理的菌液按一定浓度稀释后，涂布在平板培养基上。培养后，将单个菌落挑到斜面培养基上，经培养后，再将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶中，振荡培养后测它们的抗生素效价。这就是初筛。初筛中所得到的超过对照效价10%以上的菌种，再进行复筛。复筛的过程与初筛基本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行1～3次。由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小型甚至中型试验，才能用到发酵生产中。

人民教育出版社

诱变育种是指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法（或特定的筛子）活的所需要的高产优质菌株。诱变育种包括物理诱变和化学诱变，也就是楼主提出来的和各战友都介绍过的，是最常用最普通的微生物育种方法。

在这里我介绍一下体内基因重组育种和DNA shuffling技术。 一、体内基因重组育种

体内基因育种是指重组过程发生在细胞内。这是相对于体外DNA重组技术（或基因工程技术）而言。体内基因重组育种是指采用接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使微生物细胞内发生基因重组，以增加优良性状的组合，或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。该方法在微生物育种中占有重要地位。尤其是70年代以来发展起来的原生质体融合技术为微生物育种开辟了一条新的途径，成为重要的育种手段之一。 1. 原生质体融合

原生质体融合技术是将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内及属间）融合为一个新细胞的技术。主要包括原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤。 2.杂交育种

进行体内基因重组育种的其它方法包括接合、转化

转导等。但由于许多重要的具有生产价值的微生物的杂交、有性世代等尚未揭示，在很大程度上妨碍了杂交育种手段的实际应用，因此在原生质体融合技术发现以前，用杂交育种的手段尚不普遍。但仍有许多很好的尝试和成功的例子，尤其在酵母菌的育种中广泛应用。酵母菌中具有单倍体和二倍体的生活史，存在孟德尔式分离现象，以及a和a’交配型。因此有条件通过杂交来达到基因重组的目的。

在有些真菌中常用准性生殖获得优良菌株，即将具有不同优良性状的二种菌株进行杂交，首先获得异核体，然后通过诱变剂处理提高其形成杂合二倍体的频率，并进而用低浓度的对氟苯并氨酸或多菌灵等处理，促

进单元化过程，最后在平板中挑取扇形角变的菌落孢子，即为单倍体分离子，经进一步筛选，从中获得所需要的优良菌株。 二、DNA shuffling技术

随着PCR技术的发展和应用，1994年美国的Stemmer提出了一个全新的人工分子进化技术――DNA shuffling技术（又称体外同源重组技术），该技术可在短的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高几百倍甚至上万倍的功能性突变基因。其基本原理是先将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片断，由这些随机小片断组成一个文库，使之互为引物和模扳，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片断最为另一个基因拷贝的引物时，引起模扳转换，导入体内后，选择正突变作新一轮的体外重组。一般通过2～3次循环，可获得产物大幅度提高的重组突变体。

我也来参与讨论：我来谈谈微生物诱变育种的方法和步骤.

1. 出发菌株的选择 用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株。在诱变育种中，出发菌株的选择，会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解，挑选出对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。具体方法是选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异；选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果；选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高。另外，出发菌株还可以同时选取2~3株，在处理比较后，将更适合的菌株留着继续诱变。

另外，对于基因重组的出发菌株，无论是供体还是受体，都必须考虑与重组方式对应的基本性能，如感受态、性亲和性、噬菌体吸附位点等，还必须考虑标记互补、选择性性状、受菌体的强代谢活性、营养需求、生长速度等，以及与社会公害有关的问题如耐药性、致病性、肠道寄生性等。

2. 同步培养 在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，这称为同步培养。细菌一般要求培养至对数生长期，此时群体生长状态比较同步，比较容易变异，重复性较好。如亚硝基胍诱变时作用于复制叉处，生长旺盛的细胞中复制叉点较多，碱基类似物也在此时期比较容易进入DNA链中。霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。

3. 单细胞(或单孢子) 悬液的制备 这一步的关键是制备一定浓度的分散均匀的单细胞或单孢子悬液，为此要进行细胞的培养，并收集菌体、过滤或离心、洗涤。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制，如果是用化学诱变剂处理，因处理时 pH值会变化，必须要用缓冲溶液。除此之外，还应注意分散度，方法是先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经处理，分散度可达90％以上，这样，可以保证菌悬液均匀

地接触诱变剂 ，获得较好诱变效果。最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为106~107个／ml，放线菌和细菌的浓度大约为108个／ml。菌悬液的细胞可用平板计数法、血球计数板或光密度法测定，但以平板计数法较为准确。

4. 诱变处理 首先选择合适的诱变剂，然后确定其使用剂量。常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。 常用的物理诱变剂有紫外线、x射线、γ射线(如Co60等)、等离子、快中子、α射线、β射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。 A.紫外诱变

物理诱变剂中最常用的有紫外线。由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为136～300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化而造成的。这种变化包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。

紫外诱变的方法是：将10m1菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10 min左右。为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理。不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。

B. CO60属γ射线 诱变

其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。它能产生电离作用，直接和间接改变DNA结构。直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖-磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离

辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。不同的微生物对C060的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在4~10万伦琴，或者采用能使微生物产生90％~99％死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。

C. 等离子输入是一种较新的诱变方法，国外自20世纪60年代中、后期相继开始把等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于生物等品种改良的研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于1986年开创的。低能离子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与γ射线，中子束等明显不同。离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键或缺陷；同时还有质量沉积，离子束是高LET粒子，有Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。

D. 化学诱变剂 化学诱变剂的种类很多，根据它们对DNA的作用机制，可以分为三大类：第一类是烷化剂，它与一个或多个核酸碱基起化学变化，因而引起DNA复制时碱基配对的转换而发生变异。例如硫酸二乙酯、亚硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亚硝基胍、亚硝基甲基尿等。第二类是一些碱基类似物，它们通过代谢作用渗入到DNA分子中而引起变异，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤等。第三类是吖啶类，它造成DNA分子增加或减少一、二个碱基，从而引起碱基突变点以下全部遗传密码在转录和翻译时产生错误。选择化学诱变剂时还应注意：亚硝胺和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多，其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯被称为“超诱变剂”， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。碱基类似物和羟胺虽然具有很高的特异性，但很少使用，因其回复突变率高，效果不大。

决定化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的浓度、作用温度和作用时间。化学诱变剂的处理浓度常用几微克~几毫克／毫升，但是这个浓度取决于药剂、溶剂及微生物本身的特性，还受水解产物的浓度、一些金属离子以及某些情况下诱变剂的延迟作用的影响。一般对于一种化学诱变剂，处理浓度对不同微生物有一个大致范围，在进行预试验时，也通常是将处理浓度、处理温度确定后，测定不同时间的致死率来确定适宜的诱变剂量。这里需要说明的是化学诱变剂与物理诱变剂不同，在处理到确定时间后，要有合适的终止反

应方法，一般采用稀释法、解毒剂或改变pH值等方法来终止反应。

要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验，就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、x 射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。

在诱变育种时，有时可根据实际情况，采用多种诱变剂复合处理的办法。复合处理方法主要有三类：第一类是两种或多种诱变剂先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。如果能使用不同作用机制的诱变剂来做复合处理，可能会取得更好的诱变效果。诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，这对诱变育种的工作是很有价值的。

中间培养 对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程，即细胞内原酶有量的稀释过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。

分离和筛选 经过中间培养，分离出大量的较纯的单个菌落，接着，要从几千万个菌落中筛选出几个好的，即筛选出所谓性能良好的正突变菌株，这将要花费大量的人力和物力。怎样设计才能花费较少的工作量达到最好的效果，这是筛选工作中的一条原则。一般采用一些方法加以简化，如利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌株等。平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。

我有一个问题，紫外诱变得到的菌株怎样才能证明是突变菌呢？恳请 高手指教

诱变是不定向的,且一次正变幅度较小(ABOUT 5%),更有现有检测系统误差大于5%,企业急需的育种方法,是克服了这些难题的切实可行的定向育种方案.

有高招大侠可与我们联系

aefsw@tom.com

li36735528 wrote:

我有一个问题，紫外诱变得到的菌株怎样才能证明是突变菌呢？恳请 高手指教

根据你的需要检测吧,比如产量提高了什么的

我只有一个8瓦的紫外灯,用来做诱变可以吗?另外,我用变色圈法筛选菌种时,不是单菌落周围的培养基变色,而是整个培养基都变色.请问各位战友这是怎么个原因?

前几位同志大多讲到诱变方法的重要性，因为这含有更多共性的成分，但其实更重要的不在诱变，而在于筛选方法，如何准确快速获得所要的菌株更关键。这首先要了解目的菌种与出发菌种的特点，选择适当的方法，当然是高通量的方法。这在筛选当中更多地涉及到个性的问题，当然针对是缺陷型筛选还是抗反馈抑制筛选等等，有其共性的地方，但实际上的差别，尤其在高同量筛选方面很大。请大家讲一讲高通量筛选方面的问题好吗？

北方星空 wrote:

我只有一个8瓦的紫外灯,用来做诱变可以吗?另外,我用变色圈法筛选菌种时,不是单菌落周围的培养基变色,而是整个培养基都变色.请问各位战友这是怎么个原因?

8瓦的紫外灯应该也有效果,可能效果比15W的要差些.我没有用过,不敢断言,你可以试试.

你的平板整个培养基都变色的话也就没有什么意义了,应该是你选择的筛选培养基不合适.那样的话就只好更换培养基了

zzhangliang wrote:

各位同仁，小弟我有一个想法，象诱变育种这种方法是非定向诱变，然后通过定向筛选来达到目的的，工作量很大，往往筛很久都没有什么好的结果，现在基因工程的快速发展，应该可以采取定向的诱变技术。

我对此有不同的看法，诱变是随机的，同时也是自然的，诱变剂的加入只是提高了诱变的速度而不是方向，所以仍然是自然的变异，但是定向的诱变技术是人为地不自然的变异，带来的结果和问题可能会很多。

诱变方法极多，关键是筛选模型的建立，事半功倍！

诱变方法极多，关键是筛选模型的建立，事半功倍！

基因工程是发展很快。但目前世界上很多编码药物（抗生素）的基因并不清楚，并且是很庞大很复杂的一个合成过程（比如抗生物的合成），因此现在诱变育种还是很多抗生素生产的主要手段。

我现在极度恐惧诱变育种，更讨厌什么高通量筛选！我筛了五六个月，筛了一万多株，没有理想的菌株，要吐血了，也没信心再筛下去了。虽然还得筛，可是极度怀疑自己的实验能力，撞墙啊，可能是我人品不好。

zyun9989 wrote:

诱变在很大程度上是靠运气，这一点和菌种筛选有点像，我有时做不好，老板就说你去拜拜佛，烧烧香，当然这是玩笑，但确实有点。

我个人觉得，诱变的方法没有什么这种好那种好，只要你能得到好的菌种就是好的方法。 当然，最重要的前提是有一个好的大通量的挑选方法！

我是新手上路,以前做的和微生物方面的关系不太大,现在竟然要丛微生物变育种开始了,看到这为仁兄的感想,让我感到诱变对大家的机会可能是均等的.经验,工作量都很重要.希望自己能顺利一些.......

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