第12章 DNA的复制与转录

第三篇 遗传信息的传递

生命物质运动 糖类 脂类 蛋白质 物质代谢 细胞信号通路 核酸 与 维生素 酶? 能量转换 微量元素 激素 ?

在细胞信号通路的调控及酶等生物分子的作用下，生命基本分子的物质代谢与能量转换有条不紊的进行，从而使生命的具体形式得以表现。生命物质的这些性状特征，可以通过遗传从亲代传递给子代，从而使生命得以延续。在生物遗传过程中，核酸是遗传信息的主要携带者，20世纪50年代Crick提出中心法则(central dogma)概括了遗传信息传递的基本规律，该法则认为：遗传信息的流向是DNA→RNA→蛋白质，1970年发现反转录酶，证实在某些情况下，RNA也可以是遗传信息的携带者，使中心法则的到完善和补充。中心法则可以用图解如下：

转录翻译(Transcription) (Translation)DNA蛋白质(protein)RNA执行生物学功能(包逆转录

括参与复制、转录及DNA复制(Reverse Transcription)RNA复制

(DNA Replication)(RNA Replication)翻译等过程)

第12章 DNA的复制与转录

DNA是生物遗传的主要物质基础，生物体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制(replication)由亲代传递给子代，在后代的生长发育过程中，遗传信息从DNA转录(transcription)给RNA，然后翻译(translation)成特异蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。

第一节 DNA的复制 一、复制(replication)的概念

DNA复制是指 DNA 以自身为模板（template）， 合成新的子代DNA分子的过程。通过复制，亲代DNA分子携带的遗传信息准确地传递给子代DNA，这是遗传信息传递的分子基础。DNA在复制时复制区域的双螺旋解开所产生的两条单链和尚未松解开的双螺旋形成的“Y”形区域称复制叉(replication fork)，在此区域发生双链的不断分离和新链的合成，代表DNA复制中的生长点(growing point)。复制叉从起始点(origin)起沿着DNA合成方向连续向前移动。无论原核或真核细胞，在电镜下均可看到此种复制现象。

原核生物的每个细胞含有一个染色体，真核生物的每个细胞通常含有多个染色体。在细胞周期的特定阶段，

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整个染色体组都将发生精确的复制，随后以染色体为单位将复制的基因组分配到两个子代细胞中去。染色体的复制与细胞分裂之间具有密切联系，复制一旦完成就可开始细胞分裂过程，分裂结束，又可以开始新一轮的DNA复制。

染色体外的遗传因子，如细菌的质粒、真核生物细胞器DNA及细胞内共生或寄生生物的DNA，它们的复制或受染色体复制的控制而保持与染色体同步复制，如一些温和噬菌体侵入细菌细胞后可以将遗传物质整合到细菌染色体，与细菌染色体保持同步复制；或保持独立，在细胞增殖周期后随时都可以进行。如细胞器DNA在整个细胞周期均可进行复制；病毒DNA在侵(qīn)入宿主细胞后即能进行复制，还可以整合到宿主染色体上随染色体一同复制。

附1：DNA复制的其它术语

复制子(replicon)：基因组中能独立进行复制的单位称为复制子。每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)，可能还有终止复制的终点(terminus)。复制在复制起点被控制，一旦复制开始，就会继续下去，直到整个复制子完成复制。

对称复制与不对称复制：对称复制是指两条链的复制同时进行；不对称复制是指复制时先复制合成其中一条链后再进行另一条链的复制。

多复制子(multireplicon)：通常指含有多个复制起点的真核线状DNA分子。 切口(nick)：在双链DNA的一条单链上失去一个磷酸二酯键的位置称为切口。 缺口(gap)：双链DNA的一条单链上失去一段单链的位置称为缺口。

附2：细胞周期

由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，叫细胞周期。分为4个期：

－G1期(gap1)：指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间。这一阶段细胞异常活跃，进行一系列生化反应，为进入DNA

复制的S期做准备。G1初期可以合成cAMP、cGMP及三种RNA，氨基酸和糖类物质的转运迅速进行，用以合成新的蛋白和糖类。在G1后期与DNA合成有关的酶（如DNA聚合酶、胸苷激酶等）大量合成，同时进行H1组蛋白的磷酸化、组蛋白及非组蛋白RNA的合成等变化。G1晚期还可合成钙调素（calmodulin），是真核细胞内钙离子（Ca2+）的重要受体，广泛调节细胞内多种代谢过程，是一种重要的细胞代谢综合调节物。细胞进入DNA合成期必须有足够量的钙调素，同时钙调素的水平与G1期长短及进入S期有直接相关性。G1是细胞周期中最长的时期，与细胞增殖的调控密切相关。正常细胞在G1期有一个特殊的限制点（restriction point, R点），该点可能受一系列特异或非特异环境因素的影响，在不利条件下，细胞就停留在R点。从分子水平上看，可能是一些相关基因对外界信号发生的反应，因此R点是控制细胞增殖的关键，受其影响，G1期细胞出现三种不同的命运：（1）继续增殖细胞：这些细胞在分裂完成之后越过R点的限制，从而不断离开G1期，顺序经过细胞周期的各时相并完成细胞分裂。如骨髓干细胞、消化道粘膜细胞、及体外培养的对数生长期细胞等。（2）暂不增殖细胞：也称为G0期细胞，有些细胞分裂完成后，未越过R点，处于暂时不增殖状态，被称为G0期细胞。但这类细胞仍具有增殖潜能，在一定条件下又可进入细胞周期进行增殖活动。如肝、肾等脏器细胞及淋巴细胞等。（3）不再增殖细胞：这些细胞不能越过R点，不再继续增殖，永远停在G1期。如角质细胞、成熟红细胞、神经元细胞，他们是高度分化细胞，通过分化、衰老，直至死亡，这类细胞又称不育细胞或终末分化细胞。

－S期(synthesis phase)：指DNA合成开始到DNA合成结束的一段时期，最主要特点就是DNA进行复制和组蛋白、非组蛋白等

染色体组成蛋白质的合成。通过DNA复制，精确的将遗传信息传递给M期分裂的子细胞，保证遗传性状的稳定性。因此S期是整个细胞周期中最关键的阶段。对于S期DNA复制的启动，有人认为在S期的细胞质内存在一种DNA合成诱导者或称S期活化因子(S-phase activator)，这种因子在G1期到S期的过渡期内合成，S期时含量达到最高，至S期终末时消失，在G2期是不存在的。Rao等用细胞融合法，将同步化的HeLa G1期细胞与S期细胞融合，能够快速诱发G1期细胞核内的DNA合成，暗示了在S期细胞内含有刺激DNA合成的因素。近年发现一种与细胞增殖有关的，参与DNA合成的蛋白质，称为增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)，这种细胞核抗原在G1期到S期的过渡阶段开始合成，S期时含量达到最大，PCNA是DNA聚合酶δ的附属蛋白，具有促进DNA聚合酶δ延伸DNA链的作用。

－G2期(gap2)：指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时期，在该期DNA的合成结束，为有丝分裂进行物质和能量的准

备。在G2期加速合成RNA和有丝分裂相关蛋白（如微管蛋白），若这类蛋白的合成被抑制，则会阻止细胞进入G2期。G2期合成有丝分裂调控的重要因子——MPF(maturation promoting factor，成熟促进因子)，由两个亚单位组成，其中催化亚单位是P34cdc2蛋白激酶，调节亚单位是cyclin。MPF可以促使细胞由G2期向M期过渡，使间期核膜破裂，染色质凝集成染色体。在G2期末到进入M期前也有细胞周期监控点。

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－M期又称D期(mitosis or division)：细胞分裂开始到结束。这一时期的主要特征是染色质螺旋化变为染色体，并均等地分配到

两个子细胞，同时伴随核的一系列变化和胞质分裂。

美国学者海尔弗利在1961年提出动物细胞周期与生命的关系，他根据实验研究发现动物胚胎细胞在成长过程中，其分裂的次数是有规律的，到一定阶段就出现衰老和死亡。这与细胞分裂的次数和周期有关。二者相乘即为其自然寿命。海尔弗利的具体实验情况是这样的：他将胎儿的细胞放在培养液中一次又一次地分裂，一代又一代地繁殖，但当细胞分裂到50代时，细胞就全部衰老死亡。他又在大量实验资料的基础上，提出根据细胞分裂的次数来推算人的寿命，而分裂的周期大约是2.4年，照此计算；人的寿命应为120岁。鸡的细胞分裂次数是25次，平均每次分裂的周期为一年零两个月，其寿命为30年。小鼠细胞的分裂次数是12次，分裂周期为3个月，其寿命为3年。

二、DNA复制特点——半保留半不连续复制(semi-conservative and semidiscontinuous replication):

1. DNA的半保留复制

一个DNA分子可复制成两个DNA分子，新合成的两个子代DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。每个子代DNA中有一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成链，这种合成方式称为半保留复制(semi-conservative replication)。

证据一：1958年，Meselson(梅索森)和Stahl(斯塔尔)利用氮的同位素15N标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。他们将大肠杆菌培养在以15

NH4Cl为唯一氮源的培养基上，连续培养12代后，所有的DNA分子中的氮素均为15N。由于15N-DNA分子的密度比14N-DNA分子的密度大，在CsCl密度梯度离心(CsCl density gradient centrifugation)时这两种DNA分子会产生两个不同位置的区带(zone)。如果将完全被15N标记的大肠杆菌转移到普通培养基(以14N为氮源)上生长，经过一代之后，所有的DNA分子的密度均介于15N-DNA和14N-DNA分子之间，当把这些DNA分子加热时，会产生两种密度分别与15N和14N标记的DNA单链分子相同的单链DNA分子，此即证明培养一代后产生了15N-14N杂合DNA分子；培养两代之后，14N-DNA分子和15N-14N杂合DNA分子等量出现，若再继续培养，14N-DNA分子的量逐代增多。

证据二：Meselson和Stahl的15N标记试验得到的信息只涉及DNA复制前和复制后的状态，无法反映复制过程中的情况。1963年Caims用放射自显影

(autoradiograph)方法第一次观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色体DNA，Caims先用3H脱氧胸苷标记合成大肠杆菌染色体，然后用溶菌酶消化细胞壁，在透析膜上释放完整的大肠杆菌染色体DNA，并于暗处用感光乳胶曝光若干星期。由于3H衰变释放β粒子使乳胶感光生成银粒，显影后银粒黑点轨迹显示出DNA分子的形状，黑点的多少展示3H在DNA分子中的密度，显影后的胶片在光镜下即可观察大肠杆菌染色体全貌。Caims用这种

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方法证明大肠杆菌染色体是环状分子，并以半保留方式复制。

DNA半保留复制机制是双链DNA普遍的复制机制，即使是单链DNA分子，在其复制过程中，通常也总是形成双链的复制型式。 2. DNA复制的不连续性

由于DNA聚合酶只催化5′→3′方向的聚合反应，为解决复制模板双链的反向平行性与DNA复制对称性之间的矛盾，日本学者冈崎(Okazaki)等提出了DNA的不连续复制模型。该模型认为，DNA在复制时首先解开模板DNA的双螺旋结构，DNA聚合酶以解开的两条单链为模板按5′→3′方向在碱基配对原则指导下催化核苷酸的聚合反应，其中一条新链的合成连续进行，另一条新链则先合成的大量DNA片段，再经连接反应后产生，其合成过程是不连续的，这种DNA复制过程也称为半不连续复制(semidiscontinuous replication)。沿复制叉打开的方向，以3′→5′走向的模板链为模板时，可以按5′→3′方向连续合成新链，这条新链称为先导链(leading strand，或主导链、领头链)，前导链合成的连续性会因模板链的损伤、复制因子和底物供应不足等因素影响而被中断；当以5′→3′走向的模板链为模板时，由于DNA聚合酶不能指导3′→5′方向的DNA聚合反应，必须沿着复制叉打开的反方向先合成许多小片段DNA，在经过连接反应形成完整的DNA新链，这条新链称为滞后链(lagging strand，或称为随从链)。在滞后链的合成过程中先合成的小片段DNA称为冈崎片段(Okazaki fragment)，细菌的冈崎片段长度约为1000~2000核苷酸，相当于一个顺贩子(cistron)，即基因的大小；真核生物冈崎片段长度约为100~200个核苷酸，相当于一个核小体DNA的大小。冈崎片段是冈崎等1968年用3H-脱氧胸苷标记大肠杆菌DNA产物发现的，随后用DNA连接酶的温度敏感型变异株也证实了冈崎片段的存在。 3. DNA复制需要引物引导

DNA聚合酶并不能发动新链的合成，只能催化已有链的延伸，而RNA聚合酶则不同，可以在没有引物存在的情况下以DNA为模板合成RNA链。大量实验证明，在DNA合成过程中，先由引物酶(primase)以解开的DNA模板链为模板合成一小段RNA引物，引物长度一般为几个到十多个核苷酸，DNA聚合酶再从RNA引物的3′-OH端开始新DNA链的合成。在大肠杆菌中，引物合成后，由DNA Pol III从引物的3′-OH端催化脱氧核苷酸的聚合反应，直至冈崎片段合成完成，因此冈崎片段的合成除需要四种脱氧核糖核苷酸外，还需要四种核糖核苷酸。冈崎片段上的RNA引物的切除及切除后缺口(gap)的填补由DNA Pol I完成，最后由DNA连接酶将冈崎片段连接成长链。

4. DNA的单向复制、双向复制与滚环复制

单向复制(unidirectional replication)与双向复制(bidirectional replication)：单向复制是指复制从复制起点的一边开始向前进行，复制过程中只产生一个复制叉；双向复制是指复制从复制起点开始向两边进行，复制过程中产生两个复制叉。

病毒DNA最为复杂，有环状的，有线状，有双链的，也有单链的，因此病毒DNA的复制方式也是多种多样的：或是双向，或单向，或对称，或不对称。

由于在一个生长的群体中，几乎所有的DNA分子都处于复制过程中，所以离复制起点越近的基因出现的频率就越高，可依此原理利用遗传学和生物化学的方法来确定大肠杆菌复制起点ori C在基因图谱上的位置。有实验表明，复制起点自身并不携带使复制染色体在细胞分裂时进行分配所必需的信息，这部分功能由另外的序列来决定；而且发动复制的作用和复制拷贝数的多少分别由不同的序列控制。在大肠杆菌细胞中，即使亲缘关系较远细菌的复制起点序列也能引发DNA复制的起始，这暗示了起始区的结构是很保守的。比较已知序列的起始区，发现都含有一系列对称排列的反向重复(inverted repeats)和某些短的成簇的保守序列，这些保守序列的意义尚不清楚。

DNA复制的单双向方式可以通过放射自显影实验来加以确定。大多数生物染色体DNA的复制是双向对称进行的，但是也有例外，如枯草杆菌染色体DNA的复制是双向的，但是两个复制叉移动的距离不同，一个复制叉在染色体上仅移动1/5的距离，然后停止，另外4/5的距离由另一复制叉完成复制过程。质粒R6K的两个复制叉的移动也是不对称的，第一个复制叉复制到1/5处停止，从反方向开始形成第二个复制叉并完成全质粒的复制。质粒Col EI的复制完全单向，复制叉只向一个方向移动。

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噬菌体ΦX174 DNA是环状单链DNA分子，在复制时首先形成共价闭合环状双链分子(复制型)，然后正链由A蛋白在特定位置切开，游离出3′-OH末端，A蛋白连结到5′-磷酸基末端，随后，在DNA聚合酶的催化下以环状负链为模板，在正链的3′-OH末端加入脱氧核苷酸，使链延长，通过滚动合成出新的正链。合成一圈后，露出切口序列，A蛋白再次将其切开，并连接到新切出的5′-磷酸基末端，同时游离出单位长度的单链环状噬菌体DNA分子，这种通过DNA环的滚动合成新链的复制方式称为滚动环(rolling circle)式复制。滚动环式复制是DNA单向复制的一种特殊方式，某些双链DNA也可以通过滚动环方式进行复制，如噬菌体λ复制的后期，非洲爪蟾(Xenopus)卵母细胞中rRNA基因的扩增都是以这种方式进行。

DNA单向复制的另一特殊方式为取代环(displacement loop)式或D-环(D-loop)式复制，采取这种复制方式的双链DNA环在固定点解开启动复制，但是复制高度不对称，其中一条链先复制，另一条链保持单链状态被新合成链取代，待先复制链复制到一定位置时露出另一条链的复制起点，从而启动另一链的复制过程，由于此种复制方式在电镜下呈现D-环形状，因而也称D-环复制。采取这种方式进行复制的有线粒体DNA（纤毛虫的线粒体DNA为线性，其复制方式与此不同）和叶绿体DNA，其中叶绿体DNA双链环的两条链的起点虽然位于不同位点，但同时在起点处解开双链进行D-环复制，因而被称为2D-环复制。

利用放射自显影方法可以确定DNA复制叉的移动速度。细菌DNA大约50000bp/min，大肠杆菌染色体完成复制大约需要40min，但在丰富培养基中，大肠杆菌每20min即可分裂一次。实验表明，复制叉前进的速度是比较恒定的，复制速度实际取决与起始频率。在丰富培养基中，大肠杆菌染色体一轮复制尚未完成，起点便开始了第二轮复制，因此一个染色体可以不只有2个生长点。真核生物复制叉移动速度比原核生物慢的多，大约1000~3000bp/min，这是由于真核生物染色体具有复杂的高级结构。真核生物复制单位长度一般在100~200kb，低等真核生物要小一些，每一复制单位在30~60min内完成复制，由于各复制子发动复制的时间有先后，就整个细胞而言，通常完成染色体复制的时间要用6~8小时。 5. DNA的对称复制与不对称复制

对称复制是指两条链的复制同时进行；不对称复制是指复制时先复制合成其中一条链后再进行另一条链的复制。

6. DNA复制的高保守性(high fidelity of DNA replication)

DNA是遗传信息的携带者，亲代的性状特征在向子代传递的过程中必须保持其准确性，DNA复制是遗传的分子基础，这就对DNA复制的保真性提出了很高的要求。DNA复制是一个复杂的过程，这种复杂性有利于保证DNA复制的忠实性，主要表现在三个方面：①DNA聚合酶对底物的选择作用和3′→5′核酸外切酶的校对作用分别使错配频率下降10-2，这是一般DNA聚合酶在体外合成DNA时所能达到的水平；②在体内复制叉的复杂结构进一步提高了复制的准确率；③细胞内的修复系统可以检查出错配碱基和DNA的各种损伤并加以修复，从而使变异率降到更低的水平。到此可以理解DNA聚合酶催化聚合反应为什么需要引物，因为DNA聚合酶有3′→5′核酸外切酶的校对功能，在没有完成校对时是不进行DNA聚合反应的，而RNA合成没有校对过程，因此不需要引物的参与，当然其错配频率也就大大增加。冈崎片段合成后，需要切除RNA引物，代之以合成忠实性更高的DNA链，这样就保证了DNA复制的高保真性。 7. DNA复制过程中的碱基配对

氢键H氢键碱基配对是核酸分子间传递信息的结构基础。所谓OHNNCH3H的碱基配对是指不同碱基之间依据一定的互补原则通过HONNNNHNN形成氢键相互联系，即A与T之间形成两个氢键，G和

NNNNHC之间形成三个氢键。无论是复制、转录还是逆转录在形NNHONO成双链螺旋分子时，都要通过碱基配对来完成。但是在单H体碱基、核苷及核苷酸之间并不形成碱基配对，只有在形ATGC 成核酸的双螺旋时，由于空间结构的关系才形成特殊的碱

碱基配对时形成氢键示意图

基对。

依据碱基互补配对原则的DNA半保留复制机制可以说明DNA在代谢上的稳定性，经过多代的复制，DNA

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