蛋白质糖基化的研究进展_王家红

药 物 生 物 技 术

PharmaceuticalBiotechnology 2011,18(1):077~080

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蛋白质糖基化的研究进展

王家红,童 玥,朱 玥,田 浤,高向东

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(中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009)

摘 要 作为一种普遍存在的翻译后修饰,糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响,弄清糖基化发生发展的规律是理解蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。文章就糖基化对蛋白质结构的影响、对治疗性蛋白的药理学意义、糖基化位点分析及糖链分析方法作了简要介绍。

关键词 糖基化;蛋白质结构;药理学意义;糖基化位点;糖链分析

中图分类号 Q51 文献标志码 A 文章编号 1005-8915(2011)01-077-04

蛋白质糖基化修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,蛋白质功能的实现多与糖基化修饰密切相关。糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用,并参与受体激活、信号转导等诸多重要的生物进程[1]。蛋白质的糖基化,特别是N-连接糖基化普遍发生在细胞外环境的蛋白质中,包括膜蛋白、分泌蛋白和体液中蛋白,而这些恰巧都是容易获得并易于用作诊断和治疗的对象,因此,许多临床的生物标志物及治疗的靶标常是糖蛋白。系统定性定量分析糖蛋白及其方法学的发展对于发现新的疾病诊断标志物及治疗靶标都有非常重要的意义。糖生物学研究也正在成为继核酸、蛋白质之后生命科学中又一极具潜力的研究领域。本文将从糖基化对蛋白质结构的影响以及糖基化对治疗性蛋白的药理学意义、糖基化位点分析、糖链结构分析等方面进行综述。

1 糖基化对蛋白质结构的影响111 影响蛋白质的折叠

具有一定氨基酸排列顺序的多肽链需要进一步折叠形成一定空间结构的蛋白质分子,才能发挥生物学功能。在蛋白质折叠的过程中,糖蛋白的糖基化起到关键作用。Nakajima等[2]报道N-糖基化对于UGT1A9蛋白(一种UDP葡萄糖苷酸转移酶)的正确折叠有重要影响。UGT1A9蛋白在71、292、344位3个位点都是糖基化的,但糖基化的程度或者聚糖的大小不同。将上述3个位点的天冬酰胺突变为谷氨酰胺后,这些突变体与野生型相比酶活性均降低。为了评估糖基化对于蛋白质的作用,通过将衣霉素表达质粒短暂转染HEK293细胞得到未糖基化的UGT1A9,未糖基化的UGT1A9几乎没有活性。但是,在非变性条件下用内切酶H(EndoH)处理得到去糖基化的

UGT1A9,却显示出和野生型相同的酶活力,说明聚糖本身对于酶活性并没有决定性影响。通过免疫印迹分析发现如果没有正确的N-糖基化会严重影响蛋白质的正确折叠,从而影响酶活力。通过热力学稳定性证实在翻译过程中形成的糖基化对于UGT1A9的折叠非常重要。112 影响蛋白质构象的稳定

除了帮助蛋白质正确折叠外,糖基化还可以增加蛋白质的稳定性,这一点在对SH3蛋白质的研究中得到证明。SH3结构域最初是在Src(一种致癌基因)中鉴定到的由50个氨基酸组成的组件,能够识别富含脯氨酸和疏水残基的特异序列的蛋白质并与之结合,从而介导蛋白与蛋白相互作用。Bechor等[3]在不影响蛋白质结构的条件下,在SH3蛋白质的/天线0和/线圈0结构上选择6个糖基化位点进行糖基化,通过计算机模拟得到了63个糖基化的结构,并通过蛋白质数据库来分析所有突变体的结构。

在热力学研究中,比热容图中曲线的峰(Tf)表示蛋白质的折叠温度。研究显示每增加一个糖基,蛋白质的热力学稳定增加016~019e,说明蛋白质的稳定性随着糖基化程度的增加而增加,而结合一个大的右旋糖酐的突变体与结合一个小的乳糖的突变体有近似的热力学稳定性,所以,结合在蛋白质上的糖基的数量决定了稳定的程度,而糖基的长度影响较小。从动力学研究方面,测定无糖基化的SH3和所有糖基化的突变体在Tf时的非折叠态的自由能阈发现,与没有糖基化的蛋白质相比,每增加一个糖基能阈增加319%。说明糖基化同样能增加蛋白质的动力学稳定性,而结合大的糖基和小的糖基的突变体有着相似的稳定性。由此说明,糖链的引入能够增加蛋白的结构稳定性,并且这种稳定性与糖基的数量成正比,受糖链大小影响较小。

*收稿日期:2010-05-18 修回日期:2010-06-18作者简介:王家红,1981年生,山东沂水人,在读硕士研究生。

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2 糖基化对于治疗性蛋白的药理学意义

药物生物技术第18卷第1期

抗体Fc片段的糖基化对于FcC受体介导的活性至关重要。糖的不均一性尤其是岩藻糖基化或者二等分N-乙酰葡萄糖胺的存在能够调节血液中效应细胞的活性,并通过调节抗体的活性来影响NK细胞介导的杀伤作用。Peipp等发现岩藻糖的缺失并没有增加治疗性抗体的所谓抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。研究表明Fc片段的岩藻糖基化对于ADCC的影响取决于效应细胞的类型。岩藻糖含量低的抗体能增强单核效应细胞的ADCC,而岩藻糖含量高的抗体更倾向于招募多形核白细胞。没有岩藻糖基化的抗CD20能够通过增强与吞噬复合受体FcCRÓb的结合来加强中性粒细胞的吞噬作用。非岩藻糖基化的利妥昔单抗就是通过激活人中性粒细胞的功能来增强癌症病人的免疫应答以达到治疗的目的。214 药代动力学

糖基的种类对于治疗性糖蛋白的药代动力学特性影响深重。来那西普(Lenercept)是由人IgG1的Fc段和两个肿瘤坏死因子的结合区域组成的免疫黏附素,是由CHO细胞制造而来。来那西普含有大量的N-糖基化,而没有高-甘露糖型聚糖。在临床试验中发现不同批次生产的来那西普所测定药代动力学参数存在差异,Rodney等测定了不同批次来那西普的各部分结构,首先排除了由蛋白部分的结构改变带来的变异性。进一步研究发现,影响药代动力学参数的因素就在于该糖蛋白末端的N-乙酰葡糖胺。糖蛋白在体内的清除依赖于能识别其中寡糖结构的特殊受体,清除含有N-乙酰葡糖胺的受体和甘露糖受体比较类似。正是由于N-乙酰葡糖胺在批次间的差异导致了药代动力学测定结果的不同。糖基化作用使得药用蛋白的生产过程更加复杂,这提示人们在生产象来那西普这样的药物时应建立关键性质控指标,如此处的N-乙酰葡糖胺的测定方法及标准。215 免疫原性

病人对于治疗性蛋白的免疫反应,特别是在一些慢性适应症中,对药物安全和有效性有非常大的负性影响,因为它能产生一种中性抗体,少数情况下,还可能引起超敏反应。通常,糖基化可以掩护在大肠杆菌或其它表达系统中产生的重组产物的暴露表位,N-连接和O-连接的寡糖的末端唾液酸残基对于掩护抗原决定簇和表位是非常重要的,抵抗一种治疗性蛋白的抗体的产生很可能与唾液酸酰化有关联,带负电的唾液酸能够影响蛋白特定的常数比如热力学稳定性、对蛋白酶降解作用的抵抗力和溶解性。3 糖基化位点分析方法

鉴于糖基化对于蛋白质结构和功能的重要影响,糖基化的分析方法也越来越受到重视。质谱已成为蛋白质组中最重要的技术之一,同时也是分析糖蛋白应用最广泛的技点分析,质其独特糖基化对于治疗性蛋白具有非常重要的药理学意义,目前,有超过20种重组抗体被批准用于各种癌症和慢性疾病的治疗,尽管IgG-Fc的糖基化只占抗体分子质量的2%~3%,IgG-Fc的糖基化对于下游区的生物机制非常重要(效应功能),而且结合的寡糖能精确影响其生物效应[4]。治疗性糖蛋白药物的糖组成通常是决定它的药理学性质的主要部分,这些性质包括[5]:211 生物学活性

糖基对于建立或者维持糖蛋白空间结构的完整性起非常重要的作用,它们能增强热力学稳定性,保护免受蛋白酶的降解作用,增加溶解性,抑制蛋白的聚集作用。糖基化参与调节蛋白-蛋白相互作用,与发展和最优化治疗性蛋白密切相关。

抑制素A和抑制素B能够抑制卵巢中卵泡生长和卵泡刺激素(FSH)的分泌,是维持生殖组织正常功能的重要调节器。抑制素A和抑制素B在B亚基上是同源的,只是在A亚基上存在差异,两者分子量的差异主要是由于Asn268和Asn302N-连接糖基化位点的存在引起的,Asn268的糖基化形成31k的抑制素A、B,而Asn302的糖基化形成34k的抑制素A、B。Makanji[6]等通过糖基化形成重组人抑制素A和抑制素B,测定其体外生物活性,结果显示,34k的抑制素A比31k的抑制素A要弱,34k的抑制素A(双糖基化)活性是31k的抑制素A(单糖基化)的10%~20%,而34k抑制素B的活性是31k抑制素A的60%。另外,抑制素A去糖基化后,活性增加,而抑制素B去糖基化后,活性降低。可见糖基化对生物学活性有很大影响。

212 受体结合力

红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是肾脏产生的一种细胞因子,能刺激骨髓中的红系祖细胞产生血红细胞,重组EPO因能用于治疗慢性肾脏疾病和化疗所引起的贫血而被广泛研究。EPO与受体的结合力与EPO的糖基化成反比。Darling等报道,测定含有不同水平唾液酸酰化作用的3种EPO变体与其受体的结合速率,发现含有最高唾液酸浓度的变体与受体的结合速率常数下降至未唾液酸酰化作用EPO与受体的结合速率常数的1/3。进一步研究发现,与未糖基化的EPO相比,糖基化的EPO与受体结合速率显著变慢,说明核心糖结构对受体与配基的结合速率常数有反向影响。213 抗体效应作用

IgGs是所有的高等脊椎动物免疫系统的主要分泌产物,与IgGs结合的糖基对于维持其结构、溶解性、构象以及Fc区域与受体的结合有重要作用,通过糖基化来调节治疗

王家红等:蛋白质糖基化的研究进展

势。目前基于质谱的糖基化位点分析方法一般先对糖基化位点进行特异的质量标记,使之与理论质量有一个差异,然后通过质谱分析检测到这种差异,进而分析出是在哪个氨基酸残基上发生了这种变化从而确定糖基化位点[7]。311 PNGaseF酶法

这是目前糖蛋白组学研究中应用最为广泛的一种N-糖蛋白鉴定方法。肽:N-糖苷酶F(peptide:N-gly-cos-idaseF,PNGaseF)几乎可以作用于所有的N-糖链,同时使天冬酰胺转变为天冬氨酸,造成相对分子质量增加0198,从而起到质量标记N-糖基化位点的作用。这种方法应用十分方便,但是不能区分自发脱氨基和酶促去糖基化,使得测定会有一定误差。另外0198的质量差异对某些质谱仪来说尚难以区分。312 EndoH酶法

与PNGaseF不同,内切-B-N-乙酰葡糖胺酶H(endo-B-N-acetylglucosaminidaseH,EndoH)在去糖基化时会将N-糖链五糖核心中与天冬酰胺相连的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)以外的部分切除,而在糖基化位点处留下GlcNAc,从而起到标记糖基化位点的作用。糖基化位点处的GlcNAc使得该处天冬酰胺残基的相对理化质量增加203,这对于质谱的准确度要求不高。313 B-消除-米氏加成反应

O-糖基化位点的标记多采用化学法,其中报道较多的是B-消除反应法。该方法基于在碱性环境中Ser、Thr的O-糖基团会发生B消除形成一个不饱和的双键,这个双键可以被亲核试剂攻击发生加成反应,使Ser或Thr残基的质量相对其理论质量发生一个特定的变化,也就是使O-糖基化位点被质量标记。而且这种质量标记在PSD或CID的条件下是稳定的,从而可以通过串联质谱测序的方法得到糖基化位点的信息。该方法很早就被广泛应用,方法也在不断改进,不足之处在于非糖基化或磷酸化的Ser、Thr残基的侧链羟基也可能发生B-消除,这是该类方法在应用中应当注意的问题。

314 三氟甲基磺酸(trifluoromethananesulphonicacid,

TFMS)法

该法可以切除与肽链直接相连的单糖以外的所有糖基,留下的糖基则起到标记糖基化位点的作用。此方法反应温和,速度较快且可以作用于所有类型的糖链。作为一种广谱、高效温和的方法,TFMS法用于糖蛋白组学的前景还是很诱人的。只是该法在操作时要保持严格的无水条件,且糖链末端唾液酸的存在会影响反应效率。4 糖蛋白糖链结构分析

蛋白质的糖基化分析除了包括确定糖基化位点在那个氨基酸残基以外,对于糖链结构的分析同样非常重要。目:

411 质谱法

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经典质谱分析技术通常采用酶法或者化学的方法把糖链与肽链分开,再分别在氨基酸序列水平或者糖链水平进行进一步的分析。有研究采用膜上样品直接质谱分析技术,这种技术需要的样品量极小,因此1个2-D胶上的蛋白质点可以被分为若干份进行处理,一部分用蛋白酶进行酶解,用于蛋白质的鉴定,另一部分用糖苷酶进行酶解,用于寡糖链结构的研究,再将这两部分结合起来,就可以得到糖肽的信息。Kimura等[8]将这项技术用于血浆糖蛋白组学的研究,选择了7个蛋白质点进行分析,7个蛋白质均成功鉴定,并成功分析了其中3个蛋白质的糖链信息。电喷雾质谱(ESI-MS)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)因其独特的/软电离0方式,可较好地对高极性、难挥发、热不稳定的糖等生物大分子进行结构分析而被称为生物质谱。近年来,在线分析技术的发展使得联机技术和串联质谱技术(MSn)日趋完善。联机技术,如GC/MS、HPLCP/MS、CE/MS和Chip/MS等不需经过过多的分离纯化步骤直接将微量样品上样分析,可更加有效地获得相关的糖链结构信息。其中Chip/MS技术是新近开发的能够微量、快速、高通量测定糖链结构的良好工具。Froesch等[9]利用全自动芯片电喷雾和傅里叶转换离子回旋共振(FTICR)质谱相结合进行了高效的糖筛选和测序研究。

412 核磁共振法(NMR)

目前,NMR技术已成为糖链立体化学结构分析最重要的方法之一,可确定糖链的构型、连接位置、分支和微观多样性[10]。Kogelberg等[11]从人乳中分离出一种未果糖型和3种不同果糖型的寡糖。通过ES-MS和NMR的结合使用确定其结构特点,通过ES-MS/MS分析阐明其分支类型、血型相关刘易斯决定簇、部分序列和寡糖链连接情况,最后通过甲基化分析和1H-NMR确定其全序列。最终鉴定出三种新的糖链结构:未果糖结构,单果糖结构和三果糖结构。但NMR测定糖的讯号峰重叠严重,解析较难,灵敏度不高,而且多维NMR需要毫克级样品,这对多数糖复合物中的微量糖链是很难达到的。413 芯片技术

以糖芯片和凝集素芯片为代表的亲合芯片技术可利用糖链与凝集素之间的特异识别和结合能力间接给出糖链的相关结构信息,是目前高通量快速分析蛋白质糖基化类型的良好工具。Zheng等[12]将由不同凝集素构建的凝集素芯片放入六孔板中,观察了所培养细胞表面上糖链的表达情况。该法简单易行,通过显微镜就可获得结果。414 糖结构分析软件

糖蛋白质量数的分散及糖本身的性质决定了质谱分析的灵敏度较低,经过糖蛋白/糖肽的纯化或糖链的衍生化,等,可以一提高质

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药物生物技术第18卷第1期

测的灵敏度,但后续的糖蛋白结构分析仍然有很多困难,由于糖链的微观不均一性,一个糖基化位点上的糖链类型就可能多达几十种,虽然高分辨的质谱可以成功的检测到这些不同的糖型(glycoform),但质谱图相对也很复杂,这些质谱图能否有效的处理及分析直接决定了糖结构分析成功与否。在研究者们的努力下,近几年也有了比较好的进展,已经出现了相对成熟的软件,如StrOligoAlgorithm算法,可以分3步自动处理糖肽的串联质谱图。5 展 望

蛋白质糖基化是沟通蛋白质和糖这二大类生物大分子的桥梁。在蛋白质组学水平进行蛋白质糖基化研究有助于全面深刻地认识蛋白质糖基化发生、发展的规律及其在整个生命过程中的生物学意义,有助于从基因组-蛋白组-糖组这样一个宏观的综合的层面上观察分析生命现象,达到对生命现象更本质的认识,进而有助于发病机制的阐明,为疾病的早期诊断、治疗等提供更科学的指导。另一方面,当前的蛋白质组学研究热潮也为糖生物学研究的发展提供了千载难逢的机会。作为一类重要的信息中介分子,糖只有与其他诸如蛋白质、脂类的糖基化等放在一起研究才更接近其本质含义。相信随着蛋白质糖基化分析技术的不断发展与完善,作为蛋白质修饰谱研究重要组成部分的蛋白质糖基化研究必将在加深对蛋白质生物功能多样性认识的同时,极大地拓展对于糖类的生物学功能的认识。

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TheResearchProgressinProteinGlycosylation

WANGJia-hong,TONGYue,ZHUYue,TIANHong,GAOXiang-dong

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(SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)Abstract Proteinglycosylationasoneofthecommoncovalentposttraslationshasasignificanteffectonthestructureandfunctionofprotein.Itisessentialtodeciphertherulesofglycosylationbeforeafullcomprehensionofthediversefunctionofproteinscanbeobtained.Glycosylatedsitesanalysis、oligosac-charideanalysis、theeffectofglycosylationonstructureofproteinandpharmacologicalsignificanceofglycosylationintherapeuticproteinsareintroduced.

Keywords Glycosylation,Structureofprotein,Pharmacologicalsignificance,Glycosylatedsites,Ol-igosaccharideanalysis

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ob6e.html