胶乳微球偶联蛋白的使用中常见问题及解答

胶乳微球使用中常见问题及解答

以下问题是我们用户在使用过程中遇到的问题，我们咨询了国外的技术人员，这是他们的答复）

问：产品说明书中给出的胶乳粒径是平均粒径吗？

答：产品说明书中给出的胶乳粒径（Diameter）是平均粒径。 问：如何选择胶乳微球的粒径？

答：一般选择粒径小的胶乳微球，则需要的抗体量就多，精密度和线性相对较好，而选择粒径大的胶乳微球性，则所需抗体少，精密度和线性相对较差，相对于小球，大球的灵敏度较好。

问：一般情况下我们所使用的微球的浓度大概是多少？

答：整个测定体系中，微球的浓度大约在0.01%左右，当然这与试剂本身规定的线性有关系。 问：在使用离心方法偶联乳胶微球，一般需要多大的（相对）离心力？

答：需要多大的离心力和所使用的乳胶微球有关，一般70nm左右的微球大概13000g/min 30min以上，粒径越小所需时间越长，离心力越大。

问：蛋白（抗体）与微球偶联前，是不是微球的活化时间越长，效率越好？

答：羧基微球的活化所需时间很短，一般以10-20分钟为宜，长时间的活化反而会降低偶联效率。

问：由于抗体不只是FC的氨基酸上有NH2，是不是表示它可以在任何方向与EDCA活化微球偶联呢？如果是这样，是不是会影响抗体与抗原的特异性反应？

答： 事实的确如此，当然由于抗体的空间折叠方式和FC端疏水性强，因此偶联反应的绝大多数发生在Fc端，对抗体与抗原的结合的影响不大。

问：胶乳微球与抗体偶联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集，这是什么原因？如何控制和避免？

答：这种情况一般是偶联效率低的原因。当体系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些阻断剂 解决,常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携

带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。

3、胶乳的自凝现象如何控制和避免？

答：胶乳自凝与许多因素有关，如高电解质浓度、表面价电荷被中和、或置于某些不利环境如冷冻时。如果电解质浓度升高到某一水平，使得表面的价负荷被掩蔽，胶乳微球之间发生接触，于是便产生凝集，故高离子强度的缓冲溶液不应使用，缓冲溶液的的浓度不要超过50mM，但有些CML胶乳微球具有高电荷密度，则也能够耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球，不能使用阳电荷的缓冲溶液如Tris缓冲溶液，因为能使电荷中和而凝集。在长期贮藏时，悬浮介质的pH值应至少保持在比胶乳微球表面基团的pKa值高1-2pH单位。高浓度的胶乳微球容易促使胶体不稳定，故胶乳微球的浓度尽量以低浓度为宜，胶乳微球也不能受冷冻，否则会凝集。

问：抗体偶联至羧基微球后，即时检测效果很好，但置于37度 2天后，抗体活性似乎下降很大，什么原因？

答：这种情况大概是以下情况所致：一、乳胶微球含有表面活性剂，导致胶乳自身出现自凝现象，可以通过显微镜进行观察，如果是胶乳含有活性剂，则在偶联之前进行清洗，保证偶联的胶乳微球没有聚集。二、如果共价结合反应是成功的而抗体活性失活如此迅速，最常见的原因是抗体质量差或试剂过期所致，而且还会出现一个自由流动白色粉末、持续性团块等，这表表明试剂已被污染。

问：胶乳溶液用什么缓冲液多大离子强度保存稳定性最好？

答：一般常用的是低浓度的Goods缓冲液，如MOPSO、MES、HEPES等缓冲液，浓度在25-50mmol/L。

问：胶乳微球偶联抗体后与抗原进行反应，但是反应不明显，是什么原因所致？ 答：⑴抗原和抗体不匹配；⑵包被的抗体量下足；⑶抗体使用量虽多，但偶联效率低。 问：如何选择胶乳试剂的波长？

答：胶乳试剂随着检测波长的增加吸光度降低，为了保证试剂检测过程中不超过吸光度的检测限，一般胶乳试剂的波长选择在546-600nm左右。

微球表面基团种类及其反应

微球表面基团 羧基 活化剂 与之反应之基团 生成化学键类型 酰胺；仲胺 EDC；EDC/(sulfo)NHS； 伯氨；仲氨 CDI；CMPI 氨基 交联剂 硼氢化氰 交联剂 硼氢化氰 硼氢化氰；苯胺 交联剂；四硫磺酸钠 4,4'-联吡啶二硫醚 CDI；对甲苯磺酰氯 羟基 溴化氰；DSC 双环氧基化合物 金属基 硅羟基 硫醇或二硫醇 硅烷 氨基；巯基；羟基 胺；仲胺；硫醚；醚 羟基琥珀酰亚胺酯；醛基 卤乙酰基；氯甲基酯 羟基琥珀酰亚胺酯 醛基 氨基；巯基；羟基 酰肼；肼；氨氧基 马来酰亚胺；卤乙酰基；二硫吡啶；；环氧基；羟基琥珀酰亚胺酯；乙烯砜 酰胺；仲胺或叔胺 二酰基肼 还原型腙 仲胺；硫醚；醚 腙；腙；肟 硫醚；硫醚；二硫化物 二硫化物；硫醚；硫醚 硫醚 酰肼 环氧基 醛基 巯基

共价结合胶乳微球的参考方法（以下内容均为国外文献翻译过来的） A. 一步法

1. 配制50 mM 的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0； 2. 将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/ml； 3. 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）； 4. 将上述蛋白质溶液与胶乳微球混和，混和后在室温培育20分钟； 5. 用去离子水配制EDAC溶液，浓度为10 mg/ml（52μmol/ml）； 6. 取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中；

7. 用0.1 M氢氧化钠（NaOH）溶液调整该反应混合液的pH值至 6.5±0.2，在摇床室温培育2小时；

8. 将未结合的蛋白质除去，贮藏于缓冲溶液中。 B. 二步法 简单二步法

1. 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；

2.1ml胶乳微球悬浮液，加入20 mg EDAC，在室温培育40分钟，在20分钟后第二次加入20 mg/ml；

3.用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球，离心，用1倍体积的缓冲溶液重复处理； 4.将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中，蛋白质浓度为1mg/ml；

5.再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中，迅速加入溶解的蛋白质，37℃搅拌反应3小时；

6.按1ml反应混合液加入2.5 μl乙醇胺混合，搅拌反应10分钟； 7.除去未结合的蛋白质，贮藏与贮存的缓冲溶液中。 生成NHS-酯的中间体二步法 1.每ml反应混合物加入下列各物： a.去离子水是最后容积为1.0 ml；

b.0.1 ml的10x的贮备缓冲溶液，其pH值为6.0-6.5（一般可用0.5 M MES缓冲溶液）； 胶乳微球最终浓度为1%（W/V）；

c.0.23 ml的50 mg/ml 的NHS在去离子水中的溶液；

d.19.2 mg/ml (100 mM)的EDAC在去离子水中的溶液（注5、6）； 2.在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；

3.用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物，除去未反应的NHS和EDAC； 4.重新将胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为1%（w/v）；

5.将结合的蛋白质溶于50-100mM 的MES缓冲溶液中，浓度为1 mg/ml；

6.立即加入蛋白质溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%(w/v)、0.5 mg/ml、25-50 mM）；

7.将混合物反应至少2小时，轻轻搅拌；

8. 按1ml反应混合液加入2.5 μl乙醇胺混合，搅拌反应10分钟； 9.除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮与适宜的贮存缓冲溶液中。 C、蛋白质与带醛基的胶乳微球反应

带醛基的胶乳微球是疏水性的胶乳微球，能吸附并能与蛋白质在中性pH条件下生成Schiff碱，这是脂肪族醛基与蛋白质的氨基发生的反应（赖氨酸的伯胺）。这些胶乳微球不需事先活化而生成共价链。Schiff碱的生成是可逆反应。此Schiff碱能被氰基氢硼化钠（sodium cyanoborohydride）反应还原至稳定的烷基胺。当肽类或其他有单一反应氨基的分子与带醛基的胶乳微球结合时，由于还原而趋向稳定。 下面说明蛋白质与带醛基的胶乳微球结合的方法： 1. 配制50 mM的反应缓冲溶液，pH值为7.0-7.5； 2. 配制10 mg/ml的蛋白质在反应缓冲溶液中的溶液； 3. 配制1%(w/v) 带醛基胶乳微球在反应缓冲溶液中的悬浮液；

4. 将1份蛋白质溶液和10份胶乳微球悬浮液混和，在室温反应2小时； 5. 除去未结合的蛋白质；

6. 贮藏胶乳微球结和物与适宜的贮存缓冲溶液中。

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