RT_PCR法快速鉴别新城疫强弱毒株的试验

试验研究

!"#$%#&$$%’()*+,-.-(/,0123435(-,56’)(3-)37

!"#$%!法快速鉴别新城疫强弱毒株的试验

俞宁，岳华

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都S!44(!）

2)P5"SP中图分类号：

8文献标识码：

!44!=)+S(4P=445P=45文章编号：（544P）

地针对#$%强毒扩增出一条长5P(IT的核酸电泳条带；6ER6$引物对能特异性地针对#$%弱毒扩增出一条长5P(IT的核酸电泳条带。

摘要a通过对大量不同毒力#$%’基因核苷酸序列的分析X根据强弱毒株’4裂

解位点的序列差异设计合成了三对引物X建立了快速诊断新城疫并能鉴别其强弱毒株的反转录=聚合酶链式反应&7@=637,方法X整个试验过程可在PG内完成。试验表明X该方法具有快速特异和操作简便的特点X不仅适用于对鸡胚毒的检测X而且适用于对病鸡组织匀浆液的检测X是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。

关键词a新城疫病毒；融合蛋白基因；反转录=聚合酶链式反应

&’()’*+,)-./!"#$%!0(1.)’*2-)’-./,-)3’3(4-5,6(.’1.2

14-5,6(.’)’51-.)*+789

bc#9?Z，bc*M].

!"#$$%&%#’()’%*+)%,+%-,./%+0,#$#&12*#3405%647,)8%96)41’#9:-4)#,-$)4)%62

*)+03-,"0%,&.3

;<==><2"0),-?

!"5方法

标准强毒株!"5"!病毒的纯化

标准弱毒株&-./01.,用散养未&’()*+,、

免疫鸡所产的受精卵自行孵化至+日龄鸡胚复壮，收集尿囊液经差速离心分别离心J4:9?后，(444)444<U:9?，

取上清液，加入54V6*K)444和5V

#.3B，(W沉淀过夜X!4444<U:9?离心J4:9?后弃上清液X即获得浓缩的病毒

样品。

&:)’51;’<E<;d;</;1<.?/D<9T1./;=T0BF:;</;DG.9?<;.190?&7@=637,e.//1.IB9/G;>10>9^^;<;?19.1;d9<]B;?1.?>.d9<]B;?1#$%/1<.9?/"@G<;;/;1/0^/T;D9^9DT<9:;</]/;>9?7@=637e;<;>;/9Z?;>.DD0<>9?Z101G;/;C];?D;/0^#$%e91Gd.<90]/d9<]B;?D;^<0:1G;K;?;I.?f.?>1G;/;C];?D;>9^^;<;?D;/.1’4DB;.d.Z;/91;/I;1e;;?d9<]B;?1.?>.d9<]B;?1/1<.9?/"@G;:;1G0>e./<.T9>X/T;D9^9D.?>/9:TB;^0<:.?9T]B.190?"g1D0]B>?010?BFI;]/;>^0<>9^^;<;?19.B>9.Z?0/9/0^#$%/1<.9?/>;<9d;>^<0:1G;9?0D]B.1;>DG9Df;?;:I<F0XI]1.B/0I;]/;>^0<>9^^;<;?19.190?0^1G;/.:TB;0^19//];G0:0Z;?9A;>B9C]9>"g1e.//]ZZ;/1;>1G.11G;7@=637:;1G0>e./T01;?19.B^0<>9.Z?0/9/0^#$X9?d;/19Z.190?"

>9^^;<;?19.B>9.Z?0/9/0^#$%.?>;T9>;:90B0Z9D.B

!"5"5组织、细胞的处理把采集到的

病料X剪碎研磨X加入灭菌生理盐水配成

!Y!4的悬液X冻融J次后)444Z离心X

取上清X=54W保存。

!"5"J供试毒株7#E的提取将浓缩

加入!:-的病毒沉淀转移至5:-*6管中，

@<9A0B裂解液X室温放置P:9?X加入4"5:-氯仿X(W!5444<U:9?离心!P:9?X取

上清X加异丙醇4"P:-X室温放置!P:9?后X(W!5444<U:9?离心!P:9?。弃去旋涡上清液，加入至少!:-[PV乙醇，混匀，(W[P44<U:9?离心P:9?。小心弃去上清液，室温或真空干燥P\!4:9?，然后将7#E溶于!44!-经$*63处理过的双蒸水中，一部分用于反转录X另有少量用于测定核酸的浓度。

（#$%）=(>?*52)<#;eD./1B;>9/;./;d9<]/h^]/90?T<01;9?h7@=637

!材料和方法

!"!材料!"!"!

毒株

任公司；反转录试剂盒&’9</1/1<.?>

D$#E2F?1G;/9/H91,购自@0F0I.公司；

其它试剂均为分析纯。

#$%标准强毒株&’()*+,

购于中国兽药监察所；标准弱毒株分离毒&-./01.,由本院禽病研究所提供；

株&234!,由本院实验室保存。

!"!"5仪器及试剂637仪&德国

凝胶成像系统（美890:;1<.公司生产,；

国890=7.>公司生产）；紫外分光光度计。@<9A0B、（美国%.<9.?公司生产）@.C酶、

!"!"J引物引物设计是在E"HE#@，

K"HL3M、$"N"%E#700O*-EE7等设计的E、8、3、$四条引物的基础上添加酶

切位点和保护碱基而成的，由宝生物工命名为6E、程&大连,有限公司合成，68、63和6$。

上游引物6E：PQ=K@KEE@@3@@KE@KK下游引物68：3EKK33@3@@K3=JQ；PQ=K@EEK3@@KKEKKE@K@@KK3EK3E@@=JQ；63：PQ=K@EEK3@@EK3K@3@@3@3@K@3@33@=JQ；6$：PQ=K@EEK3@@KE3KE333@K@3@333=JQ。6ER68引物对能特异性地针对#$%扩增出一条长JS5IT的核酸电泳条带；6ER63引物对能特异性

!"5"(D$#E第一链的合成取样品

下7#EP!-X加入7#./;9?G9I910<!!-、

然游引物!!-X小心混匀XSPW保温P:9?，

后依次加入反转录酶!!-、>#@65!-、I]^^;<(!-X用$*63双蒸水补至54!-。

>#@6均购自宝生物工程&大连,有限责

544(=!5=5[收稿日期：

544P=45=54修回日期：

作者简介：俞宁（!+)4=），女，四川西昌人，在读硕士，主要从事预防兽医学方面的研究，公开发表论文5篇。(5W作用54:9?X+(W作用P:9?，然后

冰浴P:9?。获得的D$#E可直接用于

也可置于=54W下保存。637扩增反应，

!"5"P特异性片段的637扩增在637管中加入!4_637I]^^;<&:Z5R^<;;,P"4!-，5P:‘‘Z3B5J"4!-，!4:‘>#@6

本版编辑：曾宪春

8449:;;<<<#=>=/76#)-&%

四川畜牧兽医

!""#年第

#期

#$%&’()*+,!-，

上、下游引物各*+,!-，模别用81M89与81M8/组合对其扩增;结果板./01!+,!-，234/01聚合酶,+56!-，只有81和89配对才能获得特异性条灭菌去离子水57+76!-。89:扩增特异性带。同时;对接种0/@I9,*毒株的试验片段;通过实验进行优化。

鸡的肝和肺等组织匀浆液进行:2C89:*+!+7琼脂糖凝胶电泳分析结果取扩增;所得结果与鸡胚毒的一致;见图!。

89:产物*,!-于*<琼脂糖上电泳;分析所扩增片段。

!结果

!+*病毒:01的提取

用紫外分光光

度计进行测定，得出!7,=>和!",=>波长处的测定值之比为*+"?，每次可获得0/@的:01!A6!B;其质和量均能满足反转录模板的要求。

!+!

标准0/@强弱毒株的:2C89:扩增先用通用引物81和8D分别对EF"GH和-3IJ&3进行:2C89:扩增;经

琼脂糖凝胶电泳鉴定;两者的89:产物均为特异性./01条带;其分子量为57!KL。!+F

从病料组织中直接检出0/@的方然后分别用81M8D与81M8/组合对两毒法在病料中加入6A*,倍体积的8DI株进行:2C89:扩增;结果只有81M89研磨;?,,,(Q>$=离心6>$=;取上清;用

配对才能从强毒EF"GH中扩增出靶基常规方法提取病毒:01进行:2C89:因;也只有81M8/组合时才能从弱毒

扩增;结果表明两种病料均为强毒株，见-3NJ&3中得到靶基因;其分子量约为图5。

!6FKL;且为单一条带。相反，81M8/配对或81M89配对均不能从强毒或弱毒中获得靶基因;见图*1和图*D。

!+50/@I9,*分离毒株的:2C89:扩增用引物81和8D分别对分离毒株0/@I9,*O鸡胚毒P进行:2C89:扩

增，结果可得到特异的./01条带。再分

!+6特异性试验分别用不同的引物

组合对本实验室保存的传染性法氏囊病病毒ORD/@P、

鸡传染性支气管炎病毒ORD@P及空白对照鸡胚等进行:2C89:扩增;结果均为阴性，见图F。

5讨论

5+*0/是家禽的一种烈性传染病;但有时却表现出慢性疾病的特点;无典型的临床症状;因而需要一种不仅能够诊

断该病而且能快速区别病原是强毒株还是弱毒株的方法。",年代末到H,年代初;0/@基因组结构的阐明为建立这种鉴别诊断方法提供了可能。早期的研究多集中在:2C89:扩增结合序列分析的方法上;虽然也不失为鉴别诊断

0/@的准确可靠的方法;但测序比较烦琐;成本也较高;难以进行大批量操作。

!2

本版编辑：

曾宪春试

验研究

基于这种情况;我们在反复试验的基础上;初步建立了用:2C89:方法检测

0/@和鉴别0/@强弱毒株的方法;从而

为建立0/的分子鉴别诊断方法奠定了基础。

5+!

89:技术具有快速、灵敏度高、

特异性强的优点;能够克服传统诊断方法操作时间长的缺点;十分利于疫病的快速诊断和疫情监测。本研究用:2C89:

方法诊断0/和鉴别0/@强弱毒株仅需几小时;快捷、

敏感、特异且操作简便;省去了分离病毒、动物接种或基因测序等烦琐的操作过程。

5+5:2C89:方法不仅可对鸡胚毒进

行检测;还可以直接用病鸡组织的匀浆液进行检测。我们除了对标准0/@强弱毒株进行鉴别外;还对从四川某鸡场分离的强毒株进行了:2C89:扩增，从接种该病毒的鸡胚尿囊液中不仅获得了

81和8D的扩增片段;也获得了81和89

的扩增片段;完全符合0/@强毒株的基

因特点。同时从接种该病毒的鸡的肝和

肺组织匀浆液中也得到了与鸡胚毒一样的结果;但用S1分别测定尿囊液和匀浆液时;前者的凝集效价为*T6*!;后者则未能测出;表明:2C89:法的灵敏度远高于S1法。另外;从接种RD/@、RD@和空白对照鸡胚的尿囊液中未扩增出任何特异性片段，证明了该方法的特异性，因此:2C89:是进行0/流行病学调查的极具潜力的方法之一。然而;要建立起一种准确、快速和灵敏的鉴别诊断0/的方法;尚需进一步扩大检测数量。

!

参考文献U

V*W曹殿军;刘培欣;等+鸡新城疫病毒强弱毒株:2C89:

鉴别诊断方法VXW+中国预防兽医学报;!,,,;!!

O7PUF*6CF*?+

V!W阎玉河;邓瑞广;等+用反转录C聚合酶链反应快

速鉴别新城疫病毒VXW+中国兽医科技;!,,,;5,O*PU

（下转第!"页）

$%%&’(()))*+,+-./*01

四川畜牧兽医!""#年第

#

期

试验研究

验被认为是目前用于分离、滴定和血清分型的有效方法，而利用()"*+(的方法不仅可以对核苷酸序列进行分析，且对一些序列较小的突变也能发现，而这些小的突变可以产生一个新的血清型，因此核苷酸序列分析对[NJ的分类定位能更加精确。

同时通过Z6=!、_?W"单酶切得到!$-:<片段（见图!）。把单酶切的质粒与阳性质粒相比较，并用电泳鉴定，得出单酶切后的线性质粒比未经过酶切过的阳，从而证性环状质粒泳动得慢（见图2）实了其特异性的重组。

!$-利用I8?8AG9软件将ZR株核苷酸

序列与标准的毒株进行比较’可以发现

ZR株与B(>"/#-E"E#株的血清型较

近，其同源性为E/‘’用<=6DF?比对也得出同样的结果’因此可初步把ZR株定为

IB))B)BB)B)B)B)II+BIBB))II+

+BBII)+))B))B+)BB)I)BB++IB+))BI+)I))BI))B)BB))B)))B)+BIB+I+BII)))II+)B))))BIB)B+B)+)II)I++B)BIB+B)+))+I))I)B+BBII)IBB)B)II)++)BB+)B))B)BBII))BB)++B)I)IBBIB)I)+BB++BB+BI)))I)BI)))+)II)II)BBB))BI)BII)B))+)+B+))+B+I)BB)IBBB+BII))+)+BI+))+))IBIBB++BI))))B)B))BBBB)+B+)BB)IIBB+)+I)+I))+)BIB+I))+)I))B+)IBBBB)I))B+BBB))I+++))B)I))BI))B)IBB)+I)+IB

-$2序列同源性比较应用I8?8AG9

分析软件将Z/的_J(基因与E个标准毒株进行同源性分析1见表/3’结果表明ZR株与B(>"/#-E"E#株的同源性比较高。

B(>株的变异株。!$!

[NJ的高度变异性决定了该病毒

具有多种血清型’而国内通常用_#-、_/-.疫苗来免疫预防[N并不能提供有力的保护，从基因序列的比较来看，ZR株与

_#-、_/-.的_J(同源性不高’因此很难

对当地鸡群提供有力的免疫保护。所以，选择一些地方分离株制苗可以为鸡群提供有效的免疫保护，使其免受地方毒株的攻击。

!

参考文献4

等$传染性支气管炎病%/&陈德胜’潘杰彦’曹瑞兵，

毒1[NJ3国内分离毒株的分子流行病学分析%,&$病毒学报’-..!’/E1-34/2E"/#!$

%-&于秀俊’郑海州’张莉’等$鸡传染性支气管炎病毒

\2/及疫苗株_#-、_/-.Z/基因的克隆与序列测

定%,&$河北师范大学学报1自然科学版3’-..2’

-L1-34/L/"/L5$

%!&朱毓永’张利平’赵宝华$鸡传染性支气管炎病毒

1[NJ3_#-疫苗株Z/基因的克隆与序列测定%,&$

河北师范大学学报1自然科学版3’-..!’-01234

表/

-$!

[NJ"ZR株_J(基因核苷酸序列+II)++)+))+BBII)II))I)BBI+BB

)+)I)B)))BB)II)BBBI+BB+))I))I))B)I+))B))+B)B+IB++))IBIIB++)+I)II))I)BBBII)I)+)B)BIBII)IBI+)BB+B+BI+B))))IBB)I)II)))I))BI)))B)I))B+)BBIBI+IB)II+)+++I)B)B+BBB+)I+BB+B+BB++B++)I)B))BB+++BBBB)))))B)BB)BB+B)+BB)))BII)BBI)I)I))（上接第-5页）

!"#$

%!&刘禄’韦平$用()"*+(鉴别新城疫病毒不同毒

株的研究进展%,&$中国禽业导刊’-...’/01-234/5$

序列同源性分析比较

同源率

‘

E/!/5/5/5/5/5/#-#

2.5"2.E$

a$R$弗里奇’)$曼尼阿蒂斯$分子克%2&,$萨姆布$鲁克，

隆实验指南（第-版）科学出版社’%\&$北京：

变异率

ZR^B(>"/#-E"E#

ZR^I76YZR^\2/ZR^_GF=8ZR^_#-ZR^_/-.ZR^+G??ZR^PE!

ZR^N86OW8FF8E/L0L2L2L2L2L2L#0#

/EE5$

%#&ZSOFDZb’BDHFG?R’P7;@HF*,$Z8XO8?986?6=YD;D

GTFH8Z/@=Y9GS7GF8;?GT;?T89F;GOD<7G?9H;F;WC;7OD4;W8?F;T;96F;G?GT6?GC8=@8?8FYS;9@7GOS;?

（00）42/!"2/0$BODF76=;6%,&$I8?J;7G=’/EE5’

%5&P6?@M’,O?:87A’_G9:M$aCG=OF;G?67Y;QS=;96F;G?

GT@8?8F;9C676F;GOD;?FH8Z/@8?8GT;?T89F;GOD<7G?9H;F;DC;7OD8D;DG=6F8W;?)6;V6?%,&$BC;6?

（2.）45-."5-#$A;86D8’/EE5’

!讨论

!$/目前国内对[NJ的分型比较主要

是从血清学角度进行的。气管环中和试

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

（-5）BC;$*6FHG=’/EE0’4L!0"L2E$

]O6?F;F6F;C8<6D;978D;WO878XO;78Q8?FD;?FH89=86C6@8"69F;C6F;G?D;F8GTFH8TOD;G?@=Y9GS7GF8;?6D6W8F87Q;?6?FGTC;7O=8?98TG7U8V96DF=8W;D86D8C;7OD%,&$,J;7G=’/ELL’15-34!#2"!#5$%/.&胡传伟’付蕾’等$鸡新城疫病毒强弱毒株()"*+(

鉴别诊断方法%+&$中国畜牧兽医学会禽病学分会第十二次学术研讨会论文集’-..2$

%0&M8M’N76DD8O7(’P8Q87D+’!"#$$ROD;G?1R3

S7GF8;?D8XO8?98

@8?86?WGT

U8V96DF=8

W;D86D8

C;7OD4

HYW7GSHG<;9;FY

9GQS676F;C8

%2&贺东生’秦智锋’等$新城疫病毒系统发育分析及

强弱毒株的鉴别诊断%,&$动物医学进展’-...’-/

6?6=YD;D<8FV88?C;7O=8?F6?W6C;7O=8?FDF76;?D%,&$J;7ODI8?8D’/ELL’1/34!!!"!#.$

%L&陈春花’阎玉河’卢景良’等$鸽新城疫病毒分离株

R.裂解位点的基因克隆及序列分析%,&$中国畜

禽传染病’/EE0，（2）4#"L$

1-34-0"!/$

%#&,6789:;"<=69:,+’>;?@,A$%,&$BC;$A;D’/EE!’

1!0340-2"0!.$

%5&>6?FB’>G9HI’J6?(GGK8=667A,’!"#$%,&$

%//&梁成珠’黄兵’等$荧光引物实时定量()"*+(

检测UAJ强毒株的研究%+&$中国畜牧兽医学会禽病学分会第十二次学术研讨会论文集’-..2$

%E&I=;9:Q6?(M，ZYWW6==(,，[G7;G(\，!"#$$

!2

曾宪春本版编辑：$%%&’(()))*+,+-./*01

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/oahm.html