中华中医药学刊_黄芪多糖对人胃癌细胞系MKN45的生长抑制作用及细胞周期的影响_巢蕾

第30卷第11期

CHINESE

中华中

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医药学刊

MEDICINE

Vol．30No．11Nov．2012

2012年11月ARCHIVESTRADITIONALCHINESE

黄芪多糖对人胃癌细胞系MKN45的生长抑制作用

及细胞周期的影响

121111

巢蕾，周杰，朱萱萱，倪文澎，王海丹，王琼

（1．南京中医药大学附属医院，江苏南京210029；2．南京中医药大学，江苏南京210029）

要：目的：研究黄芪多糖对胃癌细胞MKN45的生长抑制作用及细胞周期的影响。方法：用RPMI1640培

养液对人胃癌细胞MKN45进行传代培养，采用MTT法检测黄芪多糖对MKN45的生长抑制作用，采用流式细胞

摘

术检测黄芪多糖对MKN45细胞周期的影响。结果：MTT法实验显示黄芪多糖可抑制MKN45细胞增殖；细胞周

效应均呈浓度和时间依赖性。结论：黄芪多糖能抑制胃期分析提示黄芪多糖可将细胞MKN45阻滞于G0/G1期，癌细胞增殖，其机制之一是影响细胞周期使之阻滞于G0/G1期。

关键词：黄芪多糖；胃癌细胞；细胞增殖；细胞周期

中图分类号：R285．5

文献标识码：A

文章编号：1673－7717（2012）11－2474－04

EffectofAstragalusPolysaccharidesonProliferationandCellCycleof

HumanGastricCarcinomaCellLineMKN45

CHAOLei1，ZHOUJie2，ZHUXuan-xuan1，NIWen-peng1，，WANGHai-dan1，WANGQiong1

（1．AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210029，Jiangsu，China；

2．NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210029，Jiangsu，China）

Abstract：Objective：ToobservetheeffectsofAstragalusPolysaccharideonproliferationandcellcycleofHumanGas-tricCarcinomaCellLineMKN45．Methods：SubculturewascarriedonbyHumanGastricCarcinomaCellLineMKN45inRPMI1640culturesolution．MTTassaywasusedtodeterminetheinhibitoryeffectofAstragalusPolysaccharideonthegrowthofMGG－803cells．ThechangesofcellcycleofMKN45weredetectedbyflowcytometry．Result：MTTassayshowedthatAstragalusPolysaccharidecouldinhibittheproliferationofcelllineMKN45，cellcycleanalysisindicatedthatAstragalusPolysaccharidecanarrestMKN45atG0/G1phase，bothofthemweretime－anddose－dependentmanner．Conclusion：AstragalusPolysaccharidescaninhibitproliferationofgastriccarcinomacells，andarrestingcellcycleofG0/G1phasemaybeoneofthemechanisms．

Keywords：AstragalusPolysaccharide；gastriccarcinomacell；cellproliferation；cellcycle

黄芪是我国传统的补益中药，从黄芪中提取出了有效

APS）。大量体成分黄芪多糖（AstragalusPo1ysaccharides，

内外实验及临床研究表明，黄芪多糖具有显著增强机体免

疫、增强抗氧化能力、防止脂质过氧化和抗衰老等多种功能及药理功效

［1－3］

药开发和应用提供实验依据。

1材料与方法1．1

材料

人胃癌细胞株MKN45，由江苏省中医院肿瘤实验室传代培养；黄芪多糖（80%）：南京泽朗医药科技有限公司，批批号：ZL110421；5－氟尿嘧啶：天津金耀氨基酸有限公司，号：1109161；RPMI1640培养基，美国GIBCO公司；胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司，批号：101115；胰蛋白酶：GIBCO公司；MTT：美国amresco公司，批号：29893；二甲亚

批号：10081010830。SUNRISE砜：南京化学试剂有限公司，

酶联免疫检测仪：瑞士TECAN公司；流式细胞仪：beckman公司；CO2培养箱（BB16）：Beraeus公司。1．21．2．1

方法

100U/细胞培养常规培养于含10%胎牛血清、

mL青霉素和0．1mg/mL链霉素的RPMI1640培养液中，

。近年来，有关黄芪多糖抗肿瘤免疫机制

方面的研究越来越多。本文通过不同浓度、不同时间的黄

探讨其对胃癌细胞的芪多糖作用于人胃癌细胞系MKN45，

中

华中医药

生长抑制作用及细胞周期的影响，为临床肿瘤中药治疗用

收稿日期：2012－06－15

基金项目：江苏省研究生培养创新工程资助项目（CXZZ11－

0782）；江苏省高校优势学科建设项目

作者简介：巢蕾（1975－），女，江苏南京人，主管药师，硕士，研究方

向：中药药理学。

通讯作者：朱萱萱（1952－），女，江苏南京人，教授，博士研究生导

师，研究方向：中药药理学。

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5%CO2、置37℃、饱和湿度培养箱中培养24h，传代后取对

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数生长期细胞用于实验。

表1

黄芪多糖对MKN45细胞增殖的影响（珋x

±s）1．2．2MTT法检测黄芪多糖对MKN45的生长抑制作用OD值（n=6）抑制率

将对数生长期胃癌细胞株MKN45用0．25%胰蛋白酶消

组别

化后用RPMI1640培养液制成2×104

个/mL的细胞悬液，

24h48h

24h

48h然后接种于96孔板，每孔200μL，置于37℃、5%CO正常

0．620±0．0740．576±0．22

2、饱和

APS（40mg/mL）0．170±0．052＊＊0．157±0．11＊＊71．63%75．83%湿度培养箱中培养24h。

APS（20mg/mL）0．306±0．024＊＊0．183±0．076＊＊51．25%70．34%实验设空白对照组（不完全1640培养液）、黄芪多糖

APS（10mg/mL）0．453±0．035＊＊0．274±0．155＊＊27．92%54．76%治疗组（0．625、

1．25、2．5、5、10、20、40mg/mL）和5－氟尿嘧APS（5mg/mL）0．461±0．032

＊＊

0．334±0．089＊＊26．60%42．71%啶（5－FU）治疗组（0．016、

0．031、0．063、0．125、0．25、0．5、APS（2．5mg/mL）0．506±0．013＊＊0．403±0．008＊＊19．37%30．62%1mg/mL）。每个浓度各设6个复孔，继续培养。分别在APS（1．25mg/mL）0．523±0．040．427±0．16＊＊16．70%15．00%24、48h后每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，于37℃、APS（0．625mg/mL）0．580±0．1270．492±0．1197．60%11．45%5%CO5FU（1mg/mL）0．283±0．03

＊＊

0．093±0．03

＊＊

53．70%

80．34%2继续孵育4h，终止培养。吸弃孔中的培养上清，加入150μLDMSO振荡10min。选择波长570nm，在酶标仪5FU（0．5mg/mL）0．434±0．067＊＊0．139±0．065＊＊29．04%73．93%5FU（0．25mg/mL）0．436±0．058

＊＊0．295±0．206＊＊28．74%52．31%上测定各孔光吸收值（OD值），并计算增殖抑制率。细胞5FU（0．125mg/mL）0．492±0．036*

0．336±0．219＊＊19．59%

44．08%增殖抑制率（%）=（1－用药组平均OD值/对照组平均5FU（0．063mg/mL）0．523±0．0780．391±0．245*14．46%33．76%OD值）×100%，采用寇氏改良法测定IC50。实验重复35FU（0．031mg/mL）0．562±0．0740．534±0．2598．20%18．85%次。5FU（0．016mg/mL）

0．628±0．054

0．536±0．359

－2．68%

1．21%

1．2．3流式细胞术检测黄芪多糖对MKN45细胞周期的影注：与对照组比较，＊＊P＜0．01，

*P＜0．05。响

根据MTT法检测结果，设置空白对照组、黄芪多糖低

与对照组相比，具有显著性差异（P＜0．01）；黄芪多糖剂量组（5mg/mL）、黄芪多糖中剂量组（10mg/mL）、黄芪多

（5mg/mL、10mg/mL）对细胞S期和G2/M期影响不大，而糖高剂量组（20mg/mL）和5－FU组（0．05mg/mL）。将对黄芪多糖（20mg/mL）使停在S期和G2/M期的细胞所占比数生长期胃癌细胞株MKN45用0．25%胰蛋白酶消化后用例显著降低（P＜0．01）；0．05mg/mL的5FU溶液能使停在RPMI1640培养液制成2×104个/mL的细胞悬液，分别在G0/G1期和S期的细胞所占比例增加，与对照组比较，具有

给药培养24、48h后，用胰酶消化，收集细胞并用磷酸盐缓

显著性差异（P＜0．05，P＜0．01），且该比例随着作用时间冲液（PBS）冲洗2次，

2000r/min离心5min收集1～5×105延长逐渐增加，具有显著性差异（P＜0．01）；同时G2/M期

细胞，加入500μL的稀释液悬浮细胞，加入50μL细胞周期

的细胞所占比例显著降低（P＜0．01）。结果见表2～3、图染色液，室温避光染色15min，流式细胞仪检测各组细胞周1～2。期的变化。

表2

黄芪多糖对MKN45细胞周期的影响（24h，

珋x±s）1．3统计学分析

24h

统计学处理数据用（珋x±s）表示，采用t检验，用SPSS

组别G0/G1S

G2/M16.0统计软件进行统计分析，P＜0．05表示差异有统计学control54．94±2．2120．57±4．0619．27±5．05意义。APS（5mg/mL）61．85±0．69＊＊

19．49±7．9415．74±8．032结果

APS（10mg/mL）68．65±2．13＊＊16．49±2．53

12．77±2．922．1黄芪多糖对MKN45细胞的生长抑制作用

APS（20mg/mL）77．83±3．88

＊＊

13．22±3．09

*

8．34±4．18＊＊共培养24h后，黄芪多糖浓度在2．5mg/mL以上时对5FU（0．05mg/mL）

60．05±2．71*28．42±6．21＊＊

10．48±2．80*

MKN45有明显抑制作用，且呈剂量依赖性，与对照组相比，注：与正常细胞比较，*P＜0．05，＊＊P＜0．01。

具有显著性差异（P＜0．01），

5－FU浓度在0．125mg/mL以表3

黄芪多糖对MKN45细胞周期的影响（48h，

珋x±s）上对MKN45具有显著的抑制作用（P＜0．05，

P＜0．01）；共48h

培养48h后，

黄芪多糖浓度在1．25mg/mL以上时对MKN45组别

G0/G1S

G2/M有明显抑制作用，且呈剂量依赖性，与对照组相比，具有显著性差异（P＜0．01），

5－FU浓度在0．063mg/mL以上对control54．54±1．50

23．21±0．39

20．06±1．57APS（5mg/mL）58．67±1．64＊＊20．68±6．70

18．25±4．83MKN45具有显著的抑制作用（P＜0．01）。

APS（10mg/mL）71．49±3．09＊＊17．54±3．519．07±3．88＊＊根据改良寇氏法计算：IC50（APS，

24h）=lg－1［xm－iAPS（20mg/mL）80．09±4．22＊＊

7．65±1．65＊＊

9．81±3．80＊＊（∑p－0．5）］=12．942mg/mL

5FU（0．05mg/mL）

63．02±1．50＊＊31．92±3．70＊＊

4．70±3．82＊＊

IC50（APS，48h）=lg－1［xm－i（∑p－0．5）］=注：与正常细胞比较，*P＜0．05，＊＊P＜0．01。

8.452mg/mL。结果见表1。3讨论

2．2

黄芪多糖对MKN45细胞周期的影响

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率居高不下，黄芪多糖（5～20mg/mL）和5－FU（0．05mg/mL）作用胃癌的治疗除了手术、放疗和化疗外，中医药治疗也越来越于MKN45后细胞周期均发生了变化。黄芪多糖作用于

受到人们的关注

［4］

。中医药在肿瘤的治疗中应用广泛，可

MKN45细胞后，停在G0/G1期的细胞所占比例随着药物浓

以明显提高肿瘤治疗的疗效、减轻放化疗毒副反应和延长

度的增加逐渐增加，且该比例随着作用时间延长逐渐增加，患者生存时间。选择合理有效的中药，并从分子生物学角

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A：Control；B：APS（5mg/mlg）；C：APS（10mg/mlg）；D：APS（20mg/mlg）；E：5FU（0．05mg/mL）

图1

黄芪多糖对MKN45细胞周期的影响（24h

）

A：Control；B：APS（5mg/mlg）；C：APS（10mg/mlg）；D：APS（20mg/mlg）；E：5FU（0．05mg/mL）

图2

黄芪多糖对MKN45细胞周期的影响（48h）

中华中医药

度寻找中药作用靶点，是目前研究热点。本文研究的胃癌MKN45细胞株来源于人胃低分化粘液腺癌，具有较高的转移倾向，与胃癌的发生发展过程密切相关。

近年来许多学者从不同角度对常用的益气药黄芪进行了研究，认为黄芪的主要药效成分黄芪多糖具有抗肿瘤作用

［5］

胞增殖抑制作用，根据实验结果来看黄芪多糖可抑制

MKN45细胞生长且具有明显的时效和量效关系，即浓度越大，作用时间越长，抑制作用也就越强。根据寇氏改良法测

48h的IC50分别为12．942mg/mL和得黄芪多糖24h、8.452mg/mL。

本研究中，胃癌细胞株MKN45经5～20mg/mL黄芪多

糖作用24和48h后，应用流式细胞仪检测MKN45细胞周期分布结果显示，黄芪多糖组G0/G1期细胞所占比例有所增S期、G2/M期细胞比例减少，加，表明黄芪多糖抑制MKN45

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。多数学者认为黄芪多糖是通过调节免疫系统来发

挥抗肿瘤作用，亦有报道黄芪多糖对肿瘤细胞具有直接杀

［6－7］

。伤作用

本实验采用MTT法检测黄芪多糖对人胃癌MKN45细

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解毒活血中药对急性冠脉综合征患者PCI术后MMP－7及tPA的影响

卢正华，孔刚，宫丽鸿

（辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032）

要：目的：通过检测解毒活血中药对急性冠脉综合征患者PCI术后MMP－7及tPA的影响，探讨解毒活

从而得出中医内痈理论的论证。方法：采用经皮seldinger穿刺法血中药治疗急性冠脉综合症不稳定斑块的机制，

摘

或经桡动脉穿刺法选择性冠脉造影术。检测PCI术前及PCI术后用药30天后采用酶联免疫吸附法（ELISA）分

tPA水平。结果：治疗组治疗后MMP－7及tPA水平下降更明显（P＜0．05）。结论：解毒活血中别测定MMP－7、

药能降低ACS患者PCI术后MMP－7及tPA水平，抑制PCI术后炎症。这为解毒活血汤用于ACS的治疗提供了

临床依据。

关键词：急性冠脉综合征；MMP－7；tPA；解毒活血汤中图分类号：R543．3文献标识码：B文章编号：1673－7717（2012）11－2477－03

InfluenceofJieduHuoxueChineseHerbalMedicineonMMP－7and

tPAafterPCIofAcuteCoronarySyndrome

LUZheng-hua，KONGGang，GONGLi-hong

（AffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110032，Liaoning，China）

Abstract：Objective：ThistextstudiedtheimpactofJieduHuoxueChineseherbalmedicineonMMP－7andtPAafterPCIofacutecoronarysyndromethroughanexaminationdisintoxication，thestudyexploredthemachinsmofJieduHuoxueChineseherbalmedicinetreatingunsteadyplaqueofacutecoronarysyndrome，gettingthetraditionalmedicineargumentof细胞增殖主要是通过阻止肿瘤细胞由G1期进入S期，防止延缓其损伤的碱基被复制；使进入S和G2/M期细胞减少，细胞周期进程，使细胞的增殖速度减慢，抑制肿瘤细胞的增

可在细胞内转化成不同殖。5－FU作为一种嘧啶类似物，

的细胞毒性代谢产物，与DNA和RNA结合，最终通过抑制

DNA合成导致细胞周期停滞和细胞凋亡，主要作用于S期，对G0/G1期也有一定作用

［8］

芪多糖在肿瘤的治疗中有着良好的应用前景。参考文献

［1］田庆锷，．中医药李焕德．黄芪多糖抗肿瘤作用研究进展［J］

2011，17（12）：86－87．导报，

［2］徐冰，刘蓓，朱海燕，等．黄芪多糖对大鼠心肌缺血再灌注损

2012，53（1）：52伤心肌p38信号通路的影响［J］．中医杂志，－54．

［3］陈贤坤，马媛媛，赵慧，等．强肌健力方及黄芪多糖对脾虚大

．中药新药与临床药理，2011，22鼠胃肠激素水平的影响［J］（6）：590－593．

［4］崔建成．奥沙利铂、氟尿嘧啶联合亚叶酸钙治疗晚期胃癌效

J］．山东医药，2010，50（51）：85－86．果观察［

［5］LimHY，JooHJ，ChoiJH，etal．Increasedexpressionofcyclooxy-genase－2proteininhumangastriccarcinoma［J］．ClinCancerRes，2000，6（2）：519．

［6］黄惠风，钱建业，谢少茹．黄芪多糖对人胃癌细胞MKN45诱

2010，14导凋亡和细胞周期的影响［J］．实用临床医药杂志，（19）：17－20．

［7］赵莲华，李清，林凡，等．黄芪多糖协同顺铂对BEL－7404人

J］．实用癌症杂志，2005，20（1）：34．肝癌细胞的杀伤作用［

［8］彭维朝，于健春，刘治滨，等．谷氨酰胺与5－氟尿嘧啶的相互

作用在人胃癌细胞株MKN45的观察［J］．中日友好医院学2011，25（3）：160－163．报，

。本实验结果所示，5－FU

S期细胞显组G0/G1期和S期细胞所占比例均有所增加，著增多。

综上所述，黄芪多糖可以抑制胃癌MKN45细胞的增殖，这可能与黄芪多糖阻止肿瘤细胞由G0/G1期进入S期、延缓细胞周期进程有关。黄芪多糖对肿瘤细胞抑制作用为黄芪多糖抗肿瘤的研究提供了实验依据，由此可见黄

收稿日期：2012－07－08

基金项目：辽宁省科技计划重大项目（2008225010－22）；沈阳市科

委科研资助项目（1071215）

作者简介：卢正华（1972－），女，副主任医师，硕士，研究方向：中西

医结合防治冠心病及PCI术后再狭窄。

通讯作者：宫丽鸿（1970－），女，主任医师，博士，研究方向：中西医

结合防治冠心病及PCI术后再狭窄。

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