木聚糖酶的热稳定性以及最适pH值

木聚糖酶的热稳定性以及最适pH值、

温度的研究

冯焱白永胜黄增辉

摘要：木聚糖酶是一类内切糖苷酶酶系,同自然界中五碳糖的循环相联系,在能量循环中占

有重要地位。试验通过采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法,在540 nm处用紫外分光仪测OD值,对某生物木聚糖酶进行研究,得出该木聚糖酶的最适pH值为4.2;分别在30～85℃测定木聚糖酶酶活,得该木聚糖酶的最适反应温度为50℃。同时发现,该酶的热稳定性较好、耐酸碱性好,木聚糖酶对pH值不敏感。

关键词：木聚糖酶;稳定性;最适;温度;pH值

中图分类号Q566+.5

冯焱,山西农业大学生命科学学院,030801,山西太谷。

白永胜、黄增辉,单位及通讯地址同第一作者。收稿日期:2007-06-18

木聚糖是一种多聚五碳糖,主要成分是D-木糖,是植物半纤维素的重要组成部分,它占植物碳水化合物总量的1/3,在自然界中是继纤维素之后的含量第二丰富的再生生物资源。木聚糖酶(E.C3.2.1.8)是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1,4木聚糖苷键的酶系。它对自然界中大量存在的半纤维素起着重要的作用,该酶广泛应用于食品、饲料添加剂等方面,已受到广泛的关注[1,2]。木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域,目前对于木聚糖酶的研究热点主要有以下几方面:①加深对木聚糖酶作用的分子机理的了解;②通过基因工程和蛋白质工程改良木聚糖酶的性质,研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品;③从天然微生物中筛选性质更为优良的木聚糖酶;④采用基因工程手段改良菌种,以获得更多的高产菌株;⑤优化发酵条件,进一步提高木聚糖酶的合成水平。现有的国内外文献关于酶活的测定介绍大多笼统,而且测定方法中各项指标都不统一,同类产品的酶活测定值没有可比性[3-6]。因此,本文就木聚糖酶酶活测定及pH值、温度等关键因素对酶活测定值的影响进行了进一步的研究,并提出木聚糖酶酶活的测定方法。

1材料与方法

1.l试验仪器

精密pH计(±0.01)、电子天平(d=1 mg)、刻度试管、试管架、移液枪(管)、烧杯、紫外分光光度计UV-1601、恒温水浴锅、冰箱、紫外检测器。 1.2试验材料

木聚糖酶酶制剂,由广东珠海市溢多利公司提供。 木糖、木聚糖、丙二醇、丙三醇 1.3试验试剂

0.2 mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为5.0)、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH值2.0～8.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)、1.0%木聚糖(Sigma X-0502)、蒸馏水。 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂的配制[8,14]:取41.6 gNaOH溶于520 ml蒸馏水中,加3,5-二硝基水杨酸12 g溶解;另取酒石酸钠364 g溶解后,再加入苯酚(用50 ml溶解)和无水硫酸钠各10 g,溶解后将上述两种溶液合并、混匀,再加蒸馏水至2 000 ml混匀,移入棕色磨口瓶于暗处贮放1周后即成。 1.4酶活测定 1.4.1酶活单位定义

在37℃、pH值5.5条件下,每分钟产生1μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活单位(U)。 1.4.2酶液制备

准确称取1.000 g该酶制剂,用0.2 mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为5.0)定容至500 ml,摇匀、静止提取,过滤后取滤液并稀释至适当倍数备用。 1.4.3还原糖标准曲线的绘制[7]

14.3.1吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液（2.4）4.0mL,加入DNS试剂（4.7）5.0mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。

1.4.3.2分别吸取木糖溶液（2.5）1.00mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL和7.00 mL，分别用缓冲溶液（2.4）定容至100mL，配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液。

1.4.3.3分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL(做两个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液（2.4）和5.0mLDNS试剂（4.7）。.电磁振荡3s-5s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。以标准空白为对照调零，在540nm处测定吸光度A值

以木糖浓度为Y轴，吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线

1.4.4酶活测定[7,8]

取25 ml具塞试管,加入1.0 ml木聚糖底物,于40℃保温5 min,然后精确加入1.0 ml酶液,准确反应30 min后加3.0 ml DNS,置沸水浴中5 min,再置冰浴中冷却。加10.0 ml去离子水,混匀后于540 nm处测OD值。空白管先加1.0 ml酶液和3.0 ml DNS试剂,置沸水浴中5 min,再加1.0 ml木聚糖底物摇匀后沸水浴5 min,再置冰浴中冷却,加10.0 ml去离子水,在 540 nm下测OD值作为调零对照。

2试验方法

2.1木聚糖酶热稳定性研究

2.1.l干热处理对木聚糖酶酶活的影响

在65、75、85和95℃恒温干燥箱中将样品处理10 min,立即提取,测定酶活,并以未经干热处理的样品中的酶活为100%,干热处理后的酶活为处理前酶活的百分数,即为该酶经干热处理后的剩余酶活。

2.1.2湿热处理时间对木聚糖酶酶活的影响

准确称取1.000 g样品加入10 ml的水(加水后总含水量约17%),充分搅拌后盖严,于85℃恒温干燥箱中处理2.5、5.0、7.5和10 min,立即提取并测定其酶活,以未经湿热处理的样品的酶活为100%,湿热处理后的酶活为处理前酶活的百分数,即为该酶经湿热处理后的剩余酶活。 2.2木聚糖酶的pH值稳定性研究

酶液在不同pH值(2～11)的缓冲液中,30℃水浴中依次保温3、6和12 h后,在不同反应pH值条件下测定其酶活,以酶样最大吸光值的酶活为100%。在其它条件下的酶活为最大吸光度酶活的百分数即为该酶在此pH值条件下的相对酶活。 2.3木聚糖酶最适pH值的测定[9]

在干燥刻度试管内分别加入3 ml pH值范围为2.0～8.0的缓冲液(用0.1 mol/l柠檬酸和0.2 mol/l磷酸氢二钠溶液配制)和pH值范围为9.0～11.0的甘氨酸-NaOH缓冲液,与10 mg/ml木聚糖溶液1 ml一起放在50℃恒温水浴箱中,再加入1 ml用蒸馏水稀释好的木聚糖酶酶液并开始计时,反应10 min后,冷却至室温后用蒸馏水定容至15 ml,摇匀,于波长540 nm处 比色,测定OD值。

2.4木聚糖酶最适反应温度的测定

在最适pH值条件下,分别设置不同的反应温度,恒温水浴锅恒定在30～85℃,检测木聚糖酶酶

活,以酶样最大吸光度的酶活为100%,在其它温度下的酶活为最大酶活的百分数即为该酶在所对应温度下的相对酶活。

3结果与讨论

3.1木聚糖酶的热稳定性研究 3.1.1干热处理对木聚糖酶酶活的影响 经过不同温度下的干热处理对木聚糖酶酶活的 影响试验,得到试验结果见表1。 表1干热处理对木聚糖酶酶活的影响(%) 65 105.57 75 98.26 85 81.10 95 10055.15 处理前酶活 处理温度(℃)

从表1可以看出,该木聚糖酶对于处理温度不超 过85℃时,其耐干热处理的能力较强。 3.1.2湿热处理时间对酶活的影响(见表2) 表2湿热处理时间对本聚糖酶酶活的影响(%) 2.5 83.10 5.0 78.40 7.5 48.20

10.0 10034.62 处理前酶活 处理时间(min)

在85℃下采用不同处理时间进行湿热处理得到 结果如表2所示。从表2可以看出,湿热处理对酶活 的影响同干热处理相比要大得多,这是由于在湿热处 理条件下更易使蛋白质变性的原因。 3.2木聚糖酶的pH值稳定性研究(见表3)

表3不同保温时间及pH值对木聚糖酶稳定性的影响(%) 3 92.2 89.6 98.1 98.5 98.7 97.9 97.1 100.0 99.6 96.8 6 75.0 77.2 84.4 88.5 90.7 89.1 84.6 96.2

93.8 84.9 12 68.0 69.5 80.9 87.8 90.3 83.3 79.2 94.0 91.6 84.6 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 项目 保温时间(h)

由表3可见,该木聚糖酶对pH值不敏感,在不同 的pH值(2～11)缓冲液中,30℃保温3 h,其残余酶活均 在89.6%以上;保温6 h,其残余酶活均在75.0%以上;保 温12 h,其残余酶活仍在68.0%以上。说明该酶能够耐 受动物胃肠道的pH值环境,有望在饲料中添加使用。

3.3木聚糖酶最适pH值的研究(见图1) OD 值 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 01

2 3456789 10 11 pH值

图1 pH值对木聚糖酶酶活的影响 酶制剂

冯焱等:木聚糖酶的热稳定性以及最适pH值、温度的研究 181为试验用木聚糖酶酶液在pH值2～8的柠 檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和pH值9～11的甘氨酸-氢 氧化钠缓冲液条件下酶活测定结果。在pH值2～4时, 酶活随pH值的升高而升高,pH值在4左右酶活达到 最高,接着呈下降趋势,但pH值在9时,突然又出现一 个高峰,其机理还不清楚,很可能与缓冲液的改变有 关,也有可能是由于试验误差所致,在此不作进一步的 探讨。

在pH值3.5～5之间进一步测酶活,可知该木聚 糖酶的最适pH值为4.2(见图2)。 OD 值 0.80

0.75 0.70 0.65 0.60 0.553 .54.24.8 pH值

图2 pH值对木聚糖酶酶活性的影响 3.4木聚糖酶最适反应温度的研究(见图3) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 OD 值 30 50 7090 温度(℃)

图3温度对木聚糖酶反应速度的影响 分别在30～85℃测定木聚糖酶酶活,由图3可 知,该木聚糖酶的最适反应温度为50℃,高于50℃ 酶活便开始下降,酶反应存在一个最适温度,当反应 体系内的温度超过最适宜温度以后,酶反应速度随温 度的升高而下降,这是因为温度升高,虽可加快酶的 催化反应速度,但同时也加快了酶的热失活速度。 4结论

本文研究的该木聚糖酶最适pH值和最适温度与其它关于木聚糖酶的报道相近似,且耐热性

能较好。该木聚糖酶的最适反应温度为50℃。通过对该木聚糖酶pH值的初测,确定其粗略范围为3.5～5.0之间,经过进一步的精确测量,最终测得该酶的pH值为4.2。

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(编辑:高雁,snowyan78@tom.com) 酶制剂

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