猪抗病育种研究进展及对几个认识问题的讨论

动物遗传育种

中国畜牧兽医　2007年第34卷第4期

遗传繁育 63

猪抗病育种研究进展及对几个认识问题的讨论

朱猛进1,吴珍芳2,赵书红1

(1.华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,武汉　430070;2.华南农业大学动物科学学院,广州　510642)

摘要:猪的抗病育种研究具有非常重要的意义,但相对于生产性状,猪抗病性状的研究较为薄弱。目前猪的抗病育种研究主要集中在抗病性状的候选基因鉴定与特定病(抗)原诱导的宿主基因表达(谱)研究两个方面。一方面,通过候选基因、比较基因组和基因组扫描等方法已鉴定出包括F18、FUT1、Mx1基因在内的影响猪抗腹泻、抗水肿病、抗流感等多个功能基因和若干QTLs,另一方面,用于免疫增强因子筛选、抗性基因和致病机理解析的病(抗)原诱导的宿主基因表达(谱)研究也正在成为抗病育种和疫苗学研究的热点。在此基础上,针对人们在猪抗病育种上的几点认识误区进行了纠正和澄清。

关键词:猪;抗病育种;认识误区

中图分类号:S828.2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:167127236(2007)0420063204

猪肉是我国居民最主要的动物蛋白质食物来

源,家猪以第一大家畜的身份在我国畜牧业中占有举足轻重的地位。数十年来,但主要针对的是生产性状(),相对于生产性状,(Schinckel,1998),并且随着集约化饲养方式的普及,猪病特别是一些反复发生的传染病给养猪生产带来了重大损失。疾病已成为现代养猪业的最大威胁之一,越来越多的畜牧生产者和消费者开始意识到提高猪群健康以维持稳定生产秩序的重要性。众所周知,饲养抗病力强的猪可显著降低用药和防疫成本,猪群的健康程度对养猪成本的控制有相当重要的作用,发达国家已开始高度重视猪的健康、抗病力及对发展生猪生产的影响。尽管控制饲养管理和环境卫生条件、预防接种和药物治疗在维持猪群健康、治疗个体疾病等方面发挥了重要的作用,但未能从治本的角度完全控制和消灭猪病的发生与流行。在猪的流行病学史上,一些重大细菌性和病毒性疾病,在生产中反复爆发,使得养猪业一直不能脱离疾病的困扰。在我国养猪业的发展过程中,传染病、环境污染和药物残留带来了持续不断的隐患,致使近几年我国猪肉安全问题愈来愈突出。发展健康养殖业是21世纪国

收稿日期:2006210209

作者简介:朱猛进(1974-),男,重庆人,硕士,讲师,主要从事动

物遗传育种研究与教学工作。

通讯作者:赵书红(1967-),女,博士,教授。E2mail:shzhao@

。显然,仅。不过,一些研究结果发现,不同物种、同种动物的不同品种或品系、甚至个体之间,对于同一病原往往表现出不同的抵抗力或敏感性,很多呼吸道、消化道类疾病的抗病力性状都存在加性遗传方差,这表明多数疾病的发生都在某种程度上受遗传因素的控制。从遗传角度通过育种措施来提高猪群抵抗力为解决上述难题提

供了契机(施启顺等,1995),并且此观念已开始被越来越多的人所理解和接受。1　猪抗病育种的研究进展

一般认为,畜群的抗病性状属于阈性状和数量性状的范畴,往往受到基因、微效多基因与环境的共同影响(Axford等,2000)。其中,个体免疫力是衡量动物抗病能力的重要指标(Knap等,2000),它属于数量性状。不过,对于很多抗病性状而言,不能简单归为阈性状或数量性状,发病与不发病体现了阈性状的特征,但又与单纯的阈性状不同,进入病理状态后又体现出发病严重程度不同的数量性状特征,因而多数抗病性状是同时具备阈性状和数量性状特征的复合性状。在抗病育种研究中,猪的抗病力指对病原(如病毒、细菌、真菌、寄生虫等)的抵抗能力或易感性,多数被认为是属于低到中等遗传力(h2)水平的数量性状(施启顺,1995),如猪对螺旋体的抗病力h2为0.20～0.21(Pryztulski等,1980)、对呼吸道疾病易感性h2为0.14、萎缩性鼻炎易感性h2为0.16(Lundheim等,1979)、肠道疾病的h2为0.59(Lundheim等,1988)、支气管败血巴氏杆菌和

动物遗传育种

64 遗传繁育中国畜牧兽医　2007年第34卷第4

期

伪狂犬病毒疫苗免疫应答h2为0.05～0.52(Roth2

2

schild等,1982)、Ecoli抗原的免疫应答h为0.29～0.45(Edfors等,1985)。近几年国内外育种工作者已开始高度关注猪的抗病性状,这种指导思想正在有力地推动猪抗病育种研究的快速发展。目前,对于猪抗病育种研究主要集中在2个方面,一是抗病性状的候选基因研究,二是特定病(抗)原诱导的宿主基因表达(谱)分析。1.1　抗病性状的候选基因研究　寻找控制抗病力主效基因(QTL)或遗传标记,是开展猪抗病力选育的重要手段。对于猪抗病性状的候选基因,目前已有多例报道,其中研究得较清楚的是猪大肠杆菌K88和F18受体基因。K88或F18菌株的细胞表面抗原附着在小肠粘膜上皮细胞表面相应的受体后大量增殖,释放肠毒素而导致新生仔猪腹泻或表现出水肿病,如果缺乏大肠杆菌K88受体或F18受体,病产生抗性(Sellwood,1975;Bert,)编码大肠杆菌K88(的位置(Rot,而编码大肠杆菌F18受体(ECF18R)6号染色体上,该基因和a2(1,2)2海藻糖转移酶1基因(FUT1)有极高的相似性。Vogeli等(1997)的研究结果还发现在大白、长白、汉普夏、杜洛克和皮特兰等品种猪中存在一与ECF18R紧密连锁的多态性,在对大肠杆菌F18抗性的标记辅助选择中是一个很好的标记。美国ARS利用该标记于1999年7月宣布在大约克中育成该病的抗性猪。国内学者也对上述基因进行了一定程度的研究(施启顺等,2003,2004;晏学明等,2004)。此外,EcoliF4受体基因也与猪的腹泻有关。氟烷基因(Hal)是另一个影响较大的抗性相关基因,它的氟烷敏感等位基因(Haln)可导致猪的体质和抵抗力下降,产生剧烈的应激反应。猪的干扰素被证明对繁殖障碍与呼吸道综合征病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、胃肠炎冠状病毒等多种重大传染病病毒均具有广谱防御和抑制作用(Bautista,1999;Rowland,2001;Chinsangaram等,1999;Suradhat等,2001;Riffault等,2001),因而干扰素基因、干扰素受体基因是选择猪的非特异性抗病力的重要候选基因。此外,MHC作为抗病育种分子标记已被证明与多种抗原的应答、细菌的噬菌作用、对螺旋旋毛虫和恶性黑素瘤的易感性等性状有相关(Lunney等,1998;Valman等,1998;徐如海等,2005),并与

多种繁殖、生长等生产性状均有连锁,也是非特异性抗病力的重要选择位点。通过质粒敲除内源性基因功能的方法,RAG21基因被证明与猪的后天免疫能力有关(Yasue等,2003)。Kumar等(2004)发现C5基因与ADV和MK诱导的抗体滴度无关但和其他一些细胞因子水平显著关联,认为该基因是猪先天性抗病力的一个候选基因。随着比较基因组学方法的逐渐成熟,其他物种中功能明确的抗病基因对于猪的抗病基因筛选有重要的借鉴意义,如在小鼠中自然抗性相关巨噬蛋白1(NRAMP1)基因与沙门氏菌的抗性有关,现在该基因已经定位在猪的15号染色体上,并且在不同品种猪中等位基因的频率存在差异(Sun等,1998)等,2001)等,。在猪、其他物种或病原基,如病毒衣壳蛋白基因、病毒中和性单克隆抗体基因,可以实施基因敲除或转基因工程育种。现在已培育成功抗流感病毒(Mx1)的转基因猪。由于抗病性状测定的成本高、难度大且没有统一的测定指标,构建抗病性状的资源家系十分困难,致使与猪抗病有关的数量性状位点(QTL)定位研究较少,目前仅能检索到为数不多的研究报道,如Wattrang等(2005)在猪的1号和8号染色体上确认存在影响白细胞数量、血细胞容积、IL22和a干扰素分泌量等免疫指标的QTL,以及Reiner等(2002)利用欧洲大白和中国梅山猪构建的F2群体对伪狂犬病毒的易感或抗性QTL进行了检测等。总之,对于抗病育种而言,尽管猪的抗病性状候选基因研究已取得了一定的成果,但由于抗性基因的分离、克隆、特别是功能鉴定有一定难度,使得目前有效的基因素材偏少。同时,抗病性的遗传机制非常复杂,这意味着猪对不同病原的抗病机制具有丰富的多样性或异质性,这使得目前已挖掘到的候选基因数目还远远无法满足实施抗病育种的需要。进一步深入开展抗病性状的QTL、候选基因研究仍将是今后一段时期内猪抗病育种研究的重要内容。1.2　病(抗)原诱导的宿主基因表达(谱)研究　病(抗)原诱导的宿主基因表达(谱)分析除了用于免疫增强因子筛选外,更重要的是用于药物靶标、抗性(易感)基因和致病机理研究。基因表达谱用于抗性(易感)基因挖掘和致病机理探索的原理很简单,由

动物遗传育种

中国畜牧兽医　2007年第34卷第4期

遗传繁育 65

于发病进程中不同病理阶段的基因表达调控网络是

前后联系的,前一阶段基因表达激发后一阶段的基因表达调控,如果切断两个病理阶段基因表达调控网络中间起激发作用的基因,发病进程就可能被终止或改向进入相对轻微的病理状态。因此,在病理进程未到真正发病或在机体可自身修复的早期阶段找到起激发作用的基因,就可能以此线索挖掘出具有巨大育种价值的关键基因,这为我们利用基因打靶技术创造具有特异性抗病力的新种质提供了新思路,甚至为阐明宿主可正常吸附病原颗粒但病原不能在宿主体内正常增殖、以及病原可在体内正常增殖(即宿主带菌或带毒)但不使宿主发病的分子机制提供了线索。近几年PubMed中正在积累越来越多的疾病基因表达(谱)方面的研究,如赵书红等(2005)用寡核苷酸芯片对正常猪与沙门氏菌感染猪的基因表达谱进行了研究,分离、验证、定位了多个功能基因,标记;Sironen等(2006)发现等因的表达谱,28(IL28)可能是一个候选抗性基因;Suradhat等(2003)发现猪感染PRRSV后外周血单核细胞、白细胞等免疫细胞的细胞间素210(IL210)呈上调表达;国内也报道了仔猪腹泻抗性相关特异表达ESTs的筛选工作(亓小红等,2004);以及有报道表明当猪感染沙门氏菌时,体内的抗菌肽cathelicidin的表达量会比平时增加3倍等。从全世界范围来看,病(抗)原诱导的宿主基因表达谱已是抗病育种和疫苗学研究的热点,但甚为遗憾的是,国内这方面研究还不多。要提升我国抗病育种和疫苗学的研究水平,必须尽快加强这方面的研究。2　对抗病育种认识误区的纠正

早在20世纪30年代,有学者就开始对猪、鸡或其它畜禽的抗病育种进行了初步研究,并已经发现遗传差异可导致宿主对病原的敏感性差异。但在随后的一段时期内,随着免疫学和生物制品学的发展,大部分传染病都通过免疫策略得到了有效的控制,使抗病育种受到一定的冷落(唐国庆等,2002)。近年来,随着人们对动物福利和绿色环境保护意识的增强,世界发达国家开始高度重视符合“5R”原则(reduce、reuse、recycle、rescue、re2evaluate)的健康养殖业生产。同时,药物和疫苗在疾病控制中所带

来的诸如耐药性产生和有害残留等问题也越来越受到人们的关注。在这种情形下,特别是随着现代分子育种技术的快速发展,畜禽抗病育种又被重新推到公众的面前。但是,目前人们对抗病育种还存在几点认识误区,有必要予以纠正和澄清。2.1　对抗病育种研究的价值重视不够甚至不认同　有人认为,既然是抗病育种,那么育成的新品种(系)就不会再得病,或者至少对某个特定疾病有100%抵抗力,如果做不到这一点,抗病育种就没有任何意义。上述观点实质上只承认特异性抗病力的育种价值,显然没有充分认识到非特异性免疫力(抗病力或抵抗力)的育种意义。我们知道,家畜的抗病。事实上,、或通过可、以及可在体(毒)但不发病这几种机制而产生天然抗性。对特异性抗病力进行选育的困难主要表现在:①如果不用人工进行基因的定点突变,自然界基因的自发突变频率极低,没有可利用的基因突变即使强度选择也没有明显效果,同时对某种病原抗性进行选择还可能导致对其他病原的易感性增加;②抗病性或易感性测定指标的成本极其高昂,对特定病原抗性的选择直接对生产造成的损失巨大;③对特定病原的抗性进行选择的同时实际上也在对病原本身生存力作同步正向选择,两者的相对选择进展可在一定程度上相互抵消从而影响最终选择效果(Gandon等,2001)。同时,目前猪病发生呈现出非典型化趋势,混合感染和继发感染导致的多重感染使疾病流行谱越来越复杂。所以,很难通过常规育种途径使猪群获得对特定病原的绝对抗性。相反,对非特异性抗病力的选择难度则相对小得多。虽然非特异性抗病力或免疫力的提高不能完全抵抗特定病原的感染,但可以提高猪群抗感染的阈值。抗感染阈值越高,发病率就越低,抗感染阈值的高低决定了猪群的发病率。同时,提高非特异性免疫力还可减少用药量和用药次数,提高疫苗的免疫效果,降低增强免疫次数和剂量,从而减轻猪场的负担。从遗传上提高猪群抗感染阈值和在疫苗中使用免疫增强佐剂具有相同的效果,但研制、开发、生产、使用免疫增强佐剂会增加额外的成本。毫无疑问,培育非特异性抗病力或免疫力高的猪群可以大幅降低疾病控制的成本,非特异性抗病力的育种意义十分明显。

动物遗传育种

66 遗传繁育中国畜牧兽医　2007年第34卷第4

期

因此,尽管培育对特定病原的特异性抗病力具有极

大的诱惑力,但因其难度较大而使得对猪先天的、无病原特异性的一般防御能力———非特异性抗病力的选择反而成了抗病育种研究的重要内容。

育成抵抗特定病原或具有高感染阈而使发病率显著降低的健康并充满活力的猪将大大降低生产成本,提高市场竞争力。同时,利用抗病育种手段可以从根本上避免细菌和病毒耐药性产生所带来的潜在生态灾难和药物残留直接威胁人体健康等问题。所以,从长远来看,从遗传角度创造或培育出抗病新品种(系)是一种治本的合理举措,我们不但不应排斥抗病育种,相反应当从观念和科研资源投入等方面予以高度重视。2.2　对两种疾病控制策略的互补性认识不足　多数疾病的发生是由病原基因和宿主基因共同作用完成的,当病原感染宿主后,宿主多重防御机能启动免疫应答相关基因的表达,致病基因,态,因此,因的综合作用主要有2,包括病原基因组改造如敲除粘附素基因使病原失去致病作用(贾爱卿等,2006)等;二是以抗病育种为主要目的的宿主基因操作策略,包括免疫增强因子的挖掘等。在对抗病育种的理解上,不少人没理解到2种疾病控制策略的互补性而将二者对立起来。有人嬉称对抗病育种的支持和质疑体现了兽医和畜牧科研工作者的利益之争,这种说法实际上没有认识到2种疾病控制策略的互补性。事实上,2种疾病控制策略各自发挥了对方不能替代的作用,一方面,现阶段疫苗和药物在多数特定疾病控制上的作用还无法由抗病育种所替代,另一方面抗病育种可在一定程度上避免前者较难克服的抗原漂移、新病频发、耐药性产生、毒力进化和药物残留等一系列不符合健康养殖理念的问题。所以,在短期和长期效应上,2种策略缺一不可,仅依靠一种策略均不是猪病控制的科学举措,动物医学和遗传育种工作者须密切配合,而不是将2种疾病控制策略对立起来。2.3　将致病基因和抗性基因绝对化　在病原感染宿主后,依据基因所发挥的作用可将宿主基因分为致病(易感)基因和抗性基因。抗性基因是保护机体的相关基因,如参与抗原识别处理、免疫监视等免疫应答过程的基因;而导致机体对疾病易感或进入病理状态的相关基因则属于致病基因,如导致免疫抑

制、免疫逃逸相关基因或直接执行毒素细胞毒性效应的基因等。在抗病育种研究中,其中一个认识误区就是将致病基因和抗性基因绝对化。实际上,致病基因和抗性基因的界限只是相对的,因为在病原感染发病过程中两类基因往往同时表达很难直观予以区分,有些基因的等位基因状态不同或在不同的内环境条件下可能既属于致病基因又属于抗性基因,活性位点的多样性修饰或功能丧失性突变使致病基因和抗性基因的界限模糊,甚至可能使二者角色互换。因此,在猪的抗病育种研究中,应根据特定病原诱导的机体基因表达调控网络细节和候选基因后续功能分析结果来判断基因的性质,不应机械地3　结语

,,特别是相,猪抗病性状的研究十分薄弱,已有的零星研究尚不足以有效支持抗病性状的遗传改良,进一步加强猪的抗病育种研究具有非常重要的理论和实践意义。对于猪的抗病育种研究,笔者认为,应针对目前候选基因数目偏少、研究程度不深的现状,借助我国地方猪种抗病、抗逆基因资源丰富的优势,大规模开展猪抗病育种基因素材的收集、挖掘和整理,在分离、克隆、鉴定重要功能基因和新基因的基础上,从多个层次、多个角度深入、系统地开展基因的结构和功能研究,并进一步针对分子育种实践开发基因诊断技术和育种试剂盒,构建适合猪繁育体系特点的分子育种方法和技术流程,建立猪抗病育种相关的行业标准,培养一支可从事抗病育种研究的学术队伍实属必要,因为这样可以使我国在猪抗病育种领域抢占到制高点,系统地建立自己的知识产权,从而为猪的抗病育种提供足够数量的有效基因素材以及理论、方法和技术的支持。

参

考

文

献

1　KnapPW,BishopSC.Relationshipsbetweengeneticchanges

andinfectiousdiseaseindomesticlivestock[A].BritSocAnimSci,2000,27:65～80.

2　KumarKG,PonsuksiliS,SchellanderK,etal.Molecularclo2

ningandsequencingofporcineC5geneanditsassociationwithimmunologicaltraits.Immunogenetics[J],2004,55(12):811～817.

3　MorozumiT,SumantriC,NakajimaE,etal.Threetypesof

polymorphismsinexon14inporcineMx1gene[J].BiochemGenet,2001,39(7～8):251～260.

动物遗传育种

中国畜牧兽医　2007年第34卷第4期

遗传繁育 67

SSCP技术用于牛mtDNA多态性检测的可行性研究

孟彦1,2,许尚忠1,3,昝林森3,高雪1,任红艳1,陈金宝1

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京　100094;

2.中国水产科学研究院长江水产研究所,荆州　434000;3.西北农林科技大学动科学院,杨凌　712100)

摘要:采用SSCP方法对523头牛线粒体DNA的D2loop序列和12SrRNA基因序列进行多态性研究,再结合DNA直接测序技术发现D2loop序列的SSCP结果与直接测序结果不相符,而12SrRNA的SSCP检测结果与测序结果相同,结果发现对于高变异率片段如线粒体DNAD2loop片段,不适合用SSCP方法进行多态分析;而对于比较保守的片段,如12SrRNA片段适合用SSCP进行多态性分析。

关键词:SSCP;牛;线粒体DNA;多态性;可行性

中图分类号:Q75　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:167127236(2007)0420067205

单链构象多态性(single2strandcomposition

polymorphism,SSCP)是目前广泛用于分析分子种群生物学特征、片段的分型等的一种有效分子标记方法的一种筛查方法(Orita等等,2001)。电泳中,性为单链,而单链DNA,更主要的是取决于DNA单链间所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链内部可以折叠形成具有一定空间结构的构象,这种构象是由DNA单链的碱基排列顺序所决定,其稳定性依靠分子内部的相互作用(主要为氢键)来维持。所以即便是相同长度的DNA单链都会因其碱基顺序不同,甚至单个碱基的改变造成单链空间构象产生变化,引起单链在凝

收稿日期:2006208207

作者简介:孟彦(1979-),女,陕西人,硕士,研究实习员,研究方

向:生物技术研究与应用。

通讯作者:许尚忠(1950-),研究员,博士生导师,主要从事分子

遗传与家畜育种方面的研究。E2mail:simmenta@

;Tel:010262890940

,即单链(),2000)。哺乳动物、、进化速度快、母系遗传和无组织特异性等特点(Zhao等,2004),目前成为研究动物母系起源进化、系统发育、亲缘关系、基因流动的重要标记物(施燕峰等,2003;牛屹东等,2001;Research,2006;Michael等,2003),尤其是进化速度快的D2loop序列、ND5和cytb基因。目前,将SSCP方法

用于线粒体DNAD2loop区多态检测研究较少。

本试验选取523头牛mtDNA基因的D2loop序列和12SrRNA基因部分序列,利用SSCP多态性检测其核苷酸变异,再结合DNA序列测定,探讨SSCP技术在不同变异速度基因多态性分析中应用

的可行性。1　试验方法1.1　试验牛血样采集　本试验涉及15个不同牛品种,其采集地点分布在全国7个省、市、自治区,所采集样品地点、数量、时间见表1。每头牛静脉采血10ml,ACD抗凝(ACD∶血=1∶6),低温快速送回,-20℃保存待用。

nuclearcellsbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JGenVirol,2003,84:453～459.

7　WattrangE,AlmqvistM,JohanssonA,etal.Confirmationof

QTLonporcinechromosomes1and8influencingleukocytenumbers,haematologicalparametersandleukocytefunction[J].AnimGenet,2005,36(4):337～345.

8　ZhaoSH,RecknorJ,LunneyJK,etal.Validationofafirst2

generationlong2oligonucleotidemicroarrayfortranscriptionalprofilinginthepig[J].Genomics,2005,86(5):618～625.

基金项目:优质鲁西牛新品系选育技术研究(2002AA242011)。

4　ReinerG,MelchingerE,KramarovaM,etal.Detectionof

quantitativetraitlociforresistance/susceptibilitytopseudora2biesvirusinswine[J].JGenVirol,2002,83(1):167～172.5　SironenA,ThomsenB,AnderssonM,etal.Anintronicinser2

tioninKPL2resultsinaberrantsplicingandcausestheimmotileshort2tailspermdefectinthepig[J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(13):5006～5011.

6　SuradhatS,ThanawongnuwechR,PoovorawanY.Upregula2

tionofIL210geneexpressioninporcineperipheralbloodmono2

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/o5j1.html