Ellman方法说明书

Ellman试剂

介绍、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、1页 半胱氨酸作为巯基基团的标准品、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、2页 巯基基团的摩尔吸光度、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、2页 故障排除、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、3页 相关的赛默飞世尔科技产品、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、3页 附加信息、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、4页 参考文献、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、4页

半胱氨酸作为巯基基团的标准品 A.原料制备

·反应缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液，PH=8.0，包含1mM EDTA ·半胱氨酸一水合盐酸盐，分子量175.6

·Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液溶解4mgDTNB B.步骤

1、在缓冲液中溶解一系列不同浓度的半胱氨酸： 标准品 A B C D E F G 缓冲液体积 100ml 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 半胱氨酸质量 26.34mg 25ml标准品A 20ml标准品A 15ml标准品A 10ml标准品A 5ml标准品A 0ml 最终浓度 1.5mM 1.25mM 1.0mM 0.75mM 0.5mM 0.25mM 0.0mM 2、取若干试管，每个试管中包含50μL的Ellman试剂液和2.5ml的缓冲液。 3、在各试管中加入250μL各浓度的标准工作液或待测物溶液。

注：对于未知的样品需要稀释，以便使其浓度标准曲线的工作范围之内（理想的浓度为 0.1-1.0）。

4、室温下反应15min。 5、测试412nm紫外吸收。

6、根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算SH含量 基于摩尔吸光系数精确测量巯基的基团 A.原料制备

·反应缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液，PH=8.0，包含1mM EDTA ·Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液溶解4mgDTNB B.吸光度测试

1、对于每一个未知样本进行测试,准备一个包含50μL的Ellman试剂液和2.5ml的缓冲液。 2、加入250μL待测样品,空白添加250μL反应缓冲液。 3、室温下反应15min。

4、测试412nm紫外吸收。

5、根据TNB的摩尔消光系数(14,150M-1cm-1)计算巯基含量。 自由巯基浓度的计算示例

250μL整数倍的待测液与2.5ml缓冲液、50μL的Ellman试剂混合测试吸光度为0.879（减去空白），用1cm比色管。计算未知的巯基浓度mol/L。报道的摩尔吸光数（摩尔消光系数，用M-1cm-1来表示），TNB在412nm这种缓冲条件下是14150。摩尔吸光系数E被如下定义：

，A为吸光度，b为路径长度多少厘米，c为浓度mol/L。

如上得：吸光度A=0.879，b=1cm，E=14150M-1cm-1，c=6.21×10-5mol/L。

这个值代表试管中溶液的浓度，计算未知样品的浓度，有必要考虑稀释因素如下： 被测溶液的总体积：

如果测定溶液浓度为6.21×10mol/L，2.80ml溶液包含：

-5

这1.74×10mol来源于巯基测定溶液中由原来的0.25毫升样品。因此，自由巯基在原始的未知样品的浓度为：

-7

可能遇到的问题 测试的巯基含量低于预期 可能原因 被氧化 溶液 保持1-5mM EDTA螯合二价金属离子,金属离子可以氧化巯基

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